Abstract
Genekspresjon og dens regulering er svært viktig for å forstå oppførselen til cellene under forskjellige forhold. Ulike teknikker brukes i dag til å studere genekspresjon, men de fleste er begrenset i forhold til å gi et helhetlig bilde av uttrykket av hele transkriptomet. DNA-mikromatriser tilby en rask og økonomisk forskning teknologi, som gir full oversikt over global genekspresjon og har et stort antall bruksområder, inkludert identifisering av nye gener og transkripsjonsfaktor bindingsseter, karakterisering av transkripsjonen aktivitet av cellene og også hjelpe i å analysere tusenvis av gener (i et enkelt eksperiment). I denne studien, har vilkårene for bakteriell transkriptom analyse fra celle innhøsting til DNA microarray analyse blitt optimalisert. Tar hensyn til tid, kostnader og nøyaktighet av forsøkene, beviser dette teknologiplattform for å være svært nyttig og universelt applicabale for å studere bakteriell transcriptomes. Her, DNA microarray analyse med Streptococcus pneumoniae som en case-studie vi utfører ved å sammenligne transkripsjons svarene av S. pneumoniae dyrket i nærvær av varierende L-serin konsentrasjoner i mediet. Total RNA ble isolert ved anvendelse av en Macaloid fremgangsmåte ved hjelp av en RNA-isolering kit og kvaliteten av RNA ble kontrollert ved hjelp av en RNA kvalitetskontroll kit. cDNA ble fremstilt ved bruk av revers transkriptase, og de cDNA-prøvene ble merket ved hjelp av en av to amin-reaktivt fluorescerende fargestoffer. Hjemmelaget DNA microarray lysbilder ble brukt for hybridisering av de merkede cDNA prøvene og microarray data ble analysert ved hjelp av en cDNA microarray data pre-prosessering rammeverk (Microprep). Til slutt ble Cyber-T benyttes for å analysere data som genereres ved hjelp av Microprep for identifisering av statistisk signifikante differensielt uttrykte gener. Videre, in-house bygget programvarepakker (pepper, FIVA, avsløre, aktor, Genome2D) ble brukt til å analyseredata.
Introduction
Studiet av hele settet av mRNA overflod (transkriptomet) kodet av genomet til en encellet organisme eller en eukaryot celle på et bestemt tidspunkt eller under en bestemt tilstand, inkludert genet overekspresjon eller knock-out, kalles transcriptomics. Transcriptomics gjør det mulig å observere i hvilken grad gener blir uttrykt under en bestemt tilstand på et tidspunkt X, og gir oss informasjon om hvor sterkt genene er uttrykt i forhold til en referanse.
En mikromatrise er en to-dimensjonal matrise på et fast substrat (vanligvis en glassplate eller silisium tynnfilm celle) som kan brukes til å analysere store mengder av biologisk materiale ved hjelp av high-throughput screening, og miniatyrisert, multiplekset og parallell prosessering og detektering metoder. Mikromatriser kommer i ulike typer, inkludert DNA-mikromatriser, protein mikromatriser, peptid mikromatriser, microarray, antistoff mikromatriser, cellulære mikromatriser og andre. En DNA microarray eri utgangspunktet en sammenstilling av mikroskopiske DNA flekker festet til en fast overflate, vanligvis glass. DNA-mikromatriser blir brukt til å måle ekspresjonsnivåene av et gen eller et sett av gener samtidig eller å genotype flere områder av et genom 2,3. Picomol (10 -12 mol) av en sonde er tilstede i hver DNA-base som representerer en spesifikk DNA-sekvens, også kjent som en reporter. De merkede mRNA molekyler fra prøvene er kalt "mål". Fluoroforer brukes til å måle probe-target-hybridisering og påvisning av fluoroforen-merkede mål bestemmer den relative overflod av nukleinsyresekvenser i målet. Et microarray eksperiment kan utføre flere genetiske tester parallelt fordi en matrise kan inneholde titusenvis av sonder. Utformingen av en enkel mikroarray eksperimentet er vist i figur 1. Nylig ble det fastslått i våre laboratorier og andre at disse matriser er gjenbrukbare, noe som gjør denne teknikken ganske kostnads effective.
Ulike RNA isolering og rensing teknikker har blitt utviklet gjennom årene, inkludert C-TAB, SDS og GT metoder 4 - 8. Videre er det flere kommersielle kits er også tilgjengelig. For genekspresjon av høy kvalitet RNA er meget viktig. Derfor er RNA isoleringsmetoder modifisert for å få en maksimal mengde av RNA. Likeledes er fremgangsmåten for cDNA-preparat og merking av cDNA minimert. Normalisering av data etter skanning er også utført effektivt ved hjelp av in-house bygget programvarepakker og verktøy 9.
Streptococcus pneumoniae er en Gram-positive menneskelige patogen som koloniserer nasopharynx og er årsaken til flere infeksjoner som lungebetennelse, sepsis, mellomørebetennelse og meningitt 10. Bakterien kan anvende en lang rekke av de næringsstoffer som kreves for vekst og overlevelse 11,12. En rekke studier har blitt utført påpneumokokk nitrogen metabolisme og regulering streker viktigheten av aminosyrer og deres rolle i virulens 13,14. I denne studien var transcriptomic respons S. pneumoniae endrede konsentrasjoner av L-serin, en aminosyre rikelig tilstede i menneskeblodplasma, er rapportert ved bruk av DNA-mikromatriser. Den transcriptomic responsen S. pneumoniae dyrket i et minimal konsentrasjon av L-serin (150 pM) ble sammenlignet med den dyrkes i en maksimal konsentrasjon (10 mM) serin. Kjemisk definert medium (CDM eller minimalmedium) 15 ble anvendt for denne studien for å kontrollere konsentrasjonen av serin. Fokus for denne studien er å gjøre denne teknikken brukervennlig og for å gi ulike verktøy for data normalisering og analyse. Det ble derfor utviklet en rekke verktøy for analyse og tolkning av data. FIVA (Funksjonell Informasjon Viewer og Analyzer) gir en plattform for prosessering av informasjon som finnes i klynger av gener medlignende genutrykksmønster og for å konstruere funksjonelle profiler 16. Aktor er en annen programvarepakke som muliggjør identifisering av mulige funksjoner og merknader av gener 17. Ved å gjøre bruk av clustering metoder, beskriver gir et DNA-bindingssted algoritme. Cis-regulatoriske motiver av gener kan projiseres ved hjelp av denne algoritmen 18. Genome2D tilbyr en Windows-basert plattform for visualisering og analyse av transkriptom data ved å tilby ulike fargeområder for å karakterisere endringer i genuttrykk nivåer på et genom kart 19. Pepper webserver tilbyr, i tillegg til alt-i-ett analysemetode, en verktøykasse for gruvedrift for regulons, arrangører og transkripsjon faktor bindingsseter 20. Full annotering av intergeniske regioner i et bakterielt genom kan oppnås ved hjelp av denne pakken. Biologer kan ha stor nytte av pepper som det gir dem en plattform for å designe eksperiments slik at hypotesen informasjonen kan bekreftes in vitro 20. Disse programvarepakker bidra betydelig til microarray analyse som de fleste av dem er fritt tilgjengelig og gjøre data normalisering og analyse svært pålitelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Media, og Cell Culture
- Grow S. pneumoniae D39 villtypestamme 21 som tidligere beskrevet 11. Inokulere cellene lagret ved -80 ° C i 10% glycerol (med 1/100 forholdet i 50 ml sterile rør) i 50 ml kjemisk definert medium (CDM) med en endelig pH på 6,4 15, men utelater L-serin fra aminosyren blanding.
Merk: to forskjellige CDMS ble brukt; en inneholdende en minimal konsentrasjon av L-serin (150 pM) og den andre inneholdt en maksimal konsentrasjon av L-serin (10 mM). Denne minste konsentrasjon er i hovedsak av konsentrasjonen av L-serin i humant blodplasma, og målet er å sammenligne genekspresjon av S. pneumoniae D39 belastning under disse to forholdene.
2. Isolering av Total RNA
- Materialer
- Bruk syre fenol, RNA karakter for isolering av total RNA.
- Macaloid:
- Suspendere 2 grammacaloid i 100 ml TE og kok i 5 min. Avkjøl til RT og sonikere inntil macaloid gels.Centrifuge løsningen ved 2000 x g i 5 min ved RT, resuspender i 50 ml TE pH 8 og oppbevares ved 4 ° C.
- Løsninger:
- Behandle alle løsninger med dietylpyrokarbonat (DEPC). Tilsett 100 ul DEPC / 100 ml oppløsning, inkuber O / N ved 37 ° C og autoklav i 15 min.
- Metodikk
- Grow 50 ml S. pneumoniae D39 cellekultur i 50 ml rør ved 37 o C (uten risting) til midten av eksponensiell fase (OD ~ 0,3). Sentrifuger kulturer ved 4 ° C på 10 000 x g i 2 min. Kast media og umiddelbart fryses cellepelletene i flytende nitrogen.
- Premix 300 ul kloroform: IAA (24: 1) og 300 ul fenol (syre fenol, RNA grade). Bruke 500 pl av den organiske fase i trinn 2.2.3.
- Forbered følgende blanding på forhånd i RNA-fri skrukork: 00,5 g glassperler, 50 ul 10% SDS, 500 pl fenol / kloroform: IAA (som fremstilt i trinn 2.2.2), macaloid lag (150-175 ul, ikke er nøyaktig som den er meget viskøs). Suspender celle pellets i 400 ul TE (DEPC) og legge de resuspenderte celler inn i skrukork.
- Å bryte cellene, plassere skrukork i en perle beater for 2x 60 "pulser ('homogen') med 1 min intervall på is. Sentrifuger prøvene i 10 min ved 10 000 x g (4 ° C).
- Overfør den øvre fase til et nytt rør, tilsett 500 ul kloroform: IAA (24: 1) og sentrifuger i 5 minutter ved 10 000 x g (4 ° C).
- Overfør 500 ul av den øvre fase til friske rør, tilsett 2 volumdeler (1 ml) av lysis / bindingsbuffer og bland ved å pipettere opp og ned. Isoler total RNA ved hjelp av RNA isolering kit og følg produsentens anbefalte protokollen.
3. RNA Cleanup
< ol>4. Analyse av RNA
- Bestemme konsentrasjonen av RNA på et spektrofotometer. Bestemme kvaliteten av RNA ved anvendelse av en analyse som følger (figur 2).
- Fortynn 1 pl av prøven med 50 ul DEPC vann for å få en konsentrasjon på 20 til 200 ng / mL.
- Bruk en ul fortynnet RNA prøve å sjekke kvalitet på Bioanalyser henhold til produsentens instruksjoner.
- Merk: et forhold mellom 23S: 16S på rundt 2,0 er ansett som god 1 A260 enhet RNA tilsvarer 40 ug / ml.. En anbefalt mengde for merking er 10-20 mikrogram.
5. cDNA Forberedelse og merking
ntent "> MERK: Følgende protokoll ble fulgt for cDNA forberedelse og merking.- Gløding
- Utføre annealing reaksjon i 300 mL PCR rør, holde konsentrasjonen av total RNA 10-15 mikrogram for hjemmelaget lysbilder eller 5 mikrogram for bedriftslaget lysbilder. Bland RNA med 2 ul Tilfeldige nonamers (1,6 ug / ul) og tilsett nuclease-fritt vann om nødvendig for å holde det endelige volum av annealing blandingen til 18 ul.
- Hold blandingen annealing ved 70 ° C i 5 min. Deretter avkjøles blandingen til RT i 10 minutter (annealing) og, om nødvendig, spinne ned reaksjonene til bunnen av røret. Plassere reaksjonsrørene på is i minst ett min.
- Revers transkripsjon
- Forberede revers transkriptase mix som følger: til 18 mikroliter annealing mix, tilsett 12 mL Master mix (som består av 6 ul 5x First Strand buffer, 3 mL 0,1 M DDT, 1,2 mL 25x AA-dUTP / nucleotide mix og 1,8 mL reversere transcriptase (1 ul for selskapets lagde lysbilder). Holde reaksjonsblandingen i 2-16 timer ved 42 ° C.
6. Nedbrytning av mRNA og rensing av cDNA
- Å degradere mRNA fra reaksjonsblandingen, tilsett 3 ul av 2,5 M NaOH og plasseres ved 37 ° C i ca 15 min. Deretter legge til 15 mL av 2M Hepes fri syre for å nøytralisere NaOH.
- Rense cDNA blanding ved hjelp av PCR opprydding kolonner og følge produsentens protokoll.
7. Måling av cDNA Konsentrasjon
- Måle cDNA konsentrasjoner på et spektrofotometer. Å fortsette med merking, sjekk at konsentrasjonen av cDNA er minst 60 ng / mL (hjemmelagde lysbilder) eller 20 ng / mL (selskaps laget lysbilder).
8. Merking av cDNA med Amine-reaktivt Dye og rensing
- Bruk amin-reactive fargestoff til å merke cDNA. Direkte blande cDNA med en delmengde (5 mL) avamin-reaktive fargestoff.
- Inkuber blandingen ved RT, i mørke, til 60 til 90 minutter og gå direkte til rensing av farvestoff-merket cDNA. Rense dye-merket cDNA ved hjelp av PCR opprydding kolonner og følge produsentens protokoll. Eluere cDNA i 50 ul elueringsbuffer.
9. Måling av Labelled cDNA
- Bruke et spektrofotometer for å måle inkorporering av amin-reaktive fargestoffer inn i cDNA. Kontroller at konsentrasjonen av amin-reaktive fargestoffer er minst 0,5 pmol / ul i et totalvolum på 50 ul.
10. Blanding av Labelled cDNA Samples
- For hjemmelaget lysbilder, bruke all den merket cDNA for hybridisering med ikke mer enn 30% forskjell i cDNA konsentrasjon. For bedrifts laget lysbilder, bruke cDNA med ikke mer enn to ganger forskjell i cDNA konsentrasjon.
Merk: normalt, er ca 300 ng av cDNA nødvendig for selskapets lagde lysbilder, som er veldig lite i forhold til required mengde cDNA for hjemmelaget lysbilder.
11. Hybridisering og Vaske
- Bruk følgende reagenser: demi vann, etanol 99%, SHY Buffer (hjemmelaget, med 40 mL gjær RNA). Forberede maksimalt 1 ml SHY.
- Apparater og forberedelse av løsninger
- Slå på vakuumkonsentratorer og varmeapparat minst 1 time før tørking. Slå på hybridisering ovn, med settpunktet reguleres til riktig hybridisering temperatur (for S. pneumoniae DNA-mikromatriser, bruker 45 ° C). Tilsvarende forvarme hybridisering kassett og ovn i 30-60 min.
- Forvarm SHY buffer på 68 C i minst 30 min.
- Prøveopparbeidelse (merket cDNA)
- Bland like mengder av merket cDNAs (maks 30% forskjell). Tørk prøven ved hjelp av vakuum-konsentratorer ved høy temperatur (ca. 40 minutter) inntil volumet er mindre enn 7 ul.
- Lifter-slip
- Bruk rene løfte-slips.Merk: ± 30 pl kan lastes på lysbildet.
- Rengjør løfteren-slips med såpe, rikelig med vann fra springen og 100% etanol. Merk: Dirty løft slips gi høy bakgrunn.
- Lufttørke løfteren-slips med luftpistol til å blåse bort støvpartikler. Plasser en ren løfteren-slip på lysbildet med hvit teflon fôr på sidene vendt ned.
- Legge hybridisering buffer (til merket cDNA)
- Oppløs de tørkede fargestoff prøver i 7 mL H2O og inkuber ved 94 ° C i 2 min.
- Umiddelbart, legger 35 mL forvarmet SHY buffer (68 ° C), bland forsiktig og sentrifugering ved maksimal hastighet i 1 min for å bli kvitt bunnfall. Forvarm sonden ved 68 ˚C for ca 5 min før lasting.
- Skyv-løfteren-slip montering og forvarming.
- Plasser hybridisering lysbildeholderen på en varmeblokk ved 50 ˚C. Plassere DNA microarray lysbilder med løfteren-slip på den oppvarmede hybridisering lysbildeholderen og poppvarmer lysbilde med løfteren-slip for et øyeblikk. Utfør de neste trinnene så raskt som mulig.
- Legg 40 mL av prøven mål til slutten av lysbildet. Tillate fluid å strømme mellom glassflatene av kapillærkraft. Utføre alle pipettering sakte og forsiktig.
- Hold lysbilder med løfteren-slip horisontal til alle tider og bevege seg sakte for å være sikker på at løfteren-slip ikke flytte.
- Ta forvarmet hybridisering kassetten ut av hybridisering ovnen og lukke maskinen. Sted filter-papir dynket med 3 ml 2x SSC (standard saltvann citrate) i hybridisering kassett.
- Påfør hybridisering lysbildeholderen med lysbilder i hybridisering kassett. Lukk hybridisering kassett og satt i hybridisering ovnen igjen (for ca 16-18 timer).
- Slide vasking
- Forberede ferske vaske-buffere I, II og III (750 ml per vasketrinn). For 500 ml vaske-buffer jeg, bruker 2 x SSC / 0.5% SDS. For 500 ml vaske-buffeh II, bruker 1 x SSC / 0,25% SDS. For 500 ml vaske-buffer III, bruker 1 x SSC / 0.1% SDS (valgfritt)
- Plasser vaske-buffere ved 30 ° C (for å være sikker på at SDS er oppløst).
- Senke skinnene så raskt som mulig, men meget forsiktig, i et Falcon rør fylt med 50 ml vaskebuffer I før glasset hviler på den koniske bunn av røret.
- Etter noen sekunder, når løfteren-slip synker til bunnen av røret, ta ut lysbildet med pinsett uten å skrape rekken og satt i stativet av vaskestasjonen. Fortsett med vasking uten tid gap.
- Vask lysbildene i 5 min i 500 ml vaske-buffer jeg (i en vaskestasjon). Gi det en ny vask for 20-30 min i 500 ml vaske-buffer II (i en vaskestasjon). Tilsvarende vaske lysbildene i 5 min i 500 ml vaske-buffer III (valgfritt) (i en vaskestasjon).
- Tørk de glir i 2 minutter ved 2000 rpm.
12. Microarray Analyse
- Skanne bildermed respektive bølgelengder i skanneren og lagre i en mappe "Jove Project".
- Bruke programvare for å analysere de skannede filene først som beskrevet tidligere 22. Etter å ha kjørt denne programvaren, velger du "Open Image" -kategorien for å laste den røde bildefilen (-.550) som "Red" og grønn bildefil (-.635) som "Grønn". Last gal fil (.gal) som har S. pneumoniae rekke liste på bildefil ved å velge "Load Array List" -kategorien 22.
Merk: denne matrisen liste besto av 48 rutenett, på hver rute var det 16 rader og 15 kolonner. Hvert sted på nettet representerer et enkelt gen og flekk informasjon, inkludert genet navnet legges gjennom en flekk beskrivelse fil. Nummeret er gitt fra venstre til høyre og fra topp til bunn. - Etter nøye småblødninger nett, velg fanen "Finn Array, Finn Blocks, Juster funksjoner" for å justere flekker. Etter å samkjøre alle funksjonene, analysere bildet ved å velge "Analysere" tab. Opprett en ny fil med resultater, histogram og spredningsplott. Lagre denne filen fra kategorien "Lagre resultater som" som en .gpr fil for videre analyse.
- Utføre ytterligere normalisering og behandling av data med egenutviklede Microprep programvarepakke som beskrevet 9.
- Bruk uavhengige biologiske replikater for DNA microarray data som er dye-byttet. Utfør CyberT gjennomføring av en variant av t-test1 og beregne falske funnrate (FDRs) som beskrevet 9.
- For differensielt uttrykte gener, ta p <0,001 og FDR <0,05 som en standard.
- Last opp DNA microarray data på NCBI innsending side for å få en GEO (Gene Expression Omnibus) sjonsnummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA, cDNA isoleringer og analyse
L-serin er et av de essensielle aminosyrer, og dens konsentrasjon i blodplasma fra mennesker varierer 60-150 pM hos barn og voksne. Dens rolle i biosyntesen av puriner og pyrimidiner fremhever dets betydning i metabolismen, og det er en forløper til en rekke aminosyrer (glycin, cystein og tryptofan). For å studere virkningen av L-serin på hele transkriptomet S. pneumoniae D39 villtypestamme, mikromatriseanalyse av D39-stammen dyrkes i CDM med en minste konsentrasjon (150 uM) av L-serin mot den dyrkes i en maksimal konsentrasjon (10 mM) i det samme medium ble utført. Først av alt, total RNA fra celler dyrket under begge konsentrasjoner ble isolert. Konsentrasjonene av RNA-prøvene er gitt i tabell 1. Kvaliteten av total RNA ble undersøkt ved bruk av kvalitetskontroll analyse. RNA ble behandlet med DNase før du utfører denneanalyse for å fjerne mulig genomisk DNA Figur 2 viser kvaliteten av RNA.; lane L representerer stigen, kolonnene 1 og 2 representerer RNA fra 150 pm serin og kolonnene 3 og 4 representerer RNA fra 10 mM serin. Tilstedeværelsen av to store bånd tilsvarende de to RNA-subenheter indikerte god kvalitet av RNA og det neste trinn av forsøket kunne bli utført.
Etter måling av kvaliteten av RNA, ble cDNA-syntese utført. cDNA ble dannet ved hjelp av tilfeldige nanomers og revers transkriptase enzymet. Konsentrasjonene av cDNA-prøvene er angitt i tabell 1. Dette cDNA ble merket med amin-reaktive fargestoffer, og konsentrasjonene av det merkede cDNA og fargestoff etiketter er gitt i tabell 1. Etter merking ble prøvene blandet tilsvarende og deretter hybridisert. Etter vasking, ble lysbilder skannes ved hjelp av skanneren, og analyse ble utført med Gene Pix Pro-programvaren. Figur 3 viser scatterplottet analyse av amin-reaktive fargestoffer forhold. Etter innledende analyse, ble dataene analysert videre ved hjelp av PicroPrep programvarepakke (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 for å redusere støy og Cyber-T ble anvendt for endelig analyse. Tabell 2 oppsummerer resultatene av microarray studier etter anvendelse av kriteriene for ≥ 2.0 fold forskjell og p-verdi <0,001. Et antall gener ble uttrykt forskjellig i nærvær av minst L-serin i forhold til det maksimale (tabell 2).
Figur 1. En oversikt over DNA mikroarray-teknologi. RNA ble isolert fra styre og måltprøver og merket cDNA blir deretter hybridisert.
Figur 2.Kvalitetssjekk av RNA isolert fra S. pneumoniae D39 celler dyrket i nærvær av minst (150 pM) og maksimum (10 mM) serin-konsentrasjoner. Lane L representerer størrelsen-stigen mens felt 1 og 2 representerer RNA prøver isolert fra celler dyrket i nærvær av serin minimumskonsentrasjon. Tilsvarende, felt 3 og 4 representerer RNA prøver isolert fra celler dyrket i nærvær av serin maksimal konsentrasjon. Bandene representerer 23S og 16S rRNA. Tilstedeværelsen av bare to bånd viser at det er ingen gDNA forurensning og RNA er av god kvalitet.
Figur 3. Array sammenligning spredningsdiagram av en prøveblanding. Hver flekk i plottet representerer betyr uttrykket verdi (log2) av et gen i et eksperiment med fargestoff 1 på y-aksen og fargestoff 2 på x-aksen.
| Prøve | RNA Sample | Beskrivelse | RNA konsentrasjon (ng / mL) | cDNA konsentrasjon (ng / mL) | Merket cDNA (ng / mL) | DyLight-550 (pmol / mikroliter) | DyLight-650 (pmol / mikroliter) | Hybridisering ordningen |
| S1 | R1 | D39 villtype dyrket i CDM + Minimum L-serin | 2057 | 255 | 225 | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 villtype dyrket i CDM + Minimum L-serin | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 villtype dyrket i CDM + Maksimal L-serin | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | D39 villtype vokst i CDM + Maximum L-serin | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Tabell 1. Hybridisering ordningen av prøvene som brukes i microarray analyse.
| Gene en | Funksjon b | Ratio c | |||
| SPD0600 | Celledeling protein DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Fosfoglyceratkinase | 3,5 | |||
| SPD0646 | Hypotetisk protein | 3.4 | |||
| SPD0873 | Hypotetisk protein | 3.3 | |||
| SPD1223 | Hypotetisk protein | 3.3 | |||
| SPD0980 | Ribose-fosfat pyrophosphokinase 2.8 | ||||
| SPD1628 | Xantin phosphoribosyltransferase | 2.7 | |||
| SPD1011 | Glycerat kinase | 2.4 | |||
| SPD0645 | Hypotetisk protein | 2.3 | |||
| SPD0564 | Hypotetisk protein | 2.2 | |||
| SPD0641 | Mannose-6-fosfatisomerase, klasse I, Mana | 2.1 | |||
| SPD1333 | Hypotetisk protein | 2.1 | |||
| SPD1384 | Sering utstrømming familie protein | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP-glukose 4-epimerase, Gale-en | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-acetylglucosamine-6-fosfat deacetylase, Naga | 2.1 | SPD0104 | LysM domene protein | 2 |
| SPD0140 | ABC transporter, ATP-bindende protein | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidase C, PepC | 2 | |||
| SPD1350 | Hypotetisk protein | 2 | |||
| SPD1822 | Ribosomal stor subenhet pseudouridine syntase, RluD underfamilie protein | 2 | |||
| SPD0453 | Type I begrensning-modifikasjon system, S subenheten | -2 | |||
| SPD0459 | Heat shock protein GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Glukose-1-fosfat adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | Sensor histidin kinase, antatte | -2,1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hydroxyacyl- (acyl-carrier-protein) dehydratase Fabz | -2,2 | |||
| SPD1494 | Sugar ABC transporter, permease protein | -2,2 | |||
| SPD0974 | Klasse I glutamin amidotransferase, antatte | -2,4 | |||
| SPD1600 | Anthranilate phosphoribosyltransferase | -2,5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-tRNA syntetase | -2,6 | |||
| SPD0681 | Hypotetisk protein | -2,7 | |||
| SPD0501 | Transkripsjon antiterminator, Lict | -3,4 |
Tabell 2. Liste over gener regulert i transkriptom sammenligning av S. pneumoniae-stamme D39 villtype dyrket i CDM 15 med minimum konsentrasjon av L-serin og CDM 15 med maksimal konsentrasjon av L-serin. Et gen tallene viser til D39 locus koder. B D39 annotering / TIGR4 merknad 21 c. Forholdet representerer gangers økning / reduksjon i uttrykket av gener i CDM-maksimalt i forhold til CDM-minimum (minustegn indikerer nedregulering).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver et brukervennlig protokoll som kan brukes til å utføre hele transkriptomet analyse av bakterier. Det sentrale poenget om denne teknikken er at tilstanden under hvor cellene høstet vil variere. Etter høsting av celler og RNA-isolering, blir denne teknikken er lik for alle typer av bakterieprøver og følger nøyaktig identiske trinn, og derfor kan anvendes på alle typer bakteriekultur. Protokollen er meget enkel og praktisk og starter fra RNA-isolering. Vår RNA isolering protokollen (med en Macaloid og RNA isolering kit) er tidseffektivt i forhold til konvensjonell fenol-kloroform og Trizol metoder. I det neste trinnet, er fremstillingen av cDNA med transkriptase III enzym utføres. Deretter blir merking av cDNA gjort ved først å blande cDNA med amin-reaktive fargestoffer, og deretter rensing av merket cDNA. Merkingen er også enkel og tar ikke mye tid som prøvene må inkuberes i ca 1time i mørke. Alle disse trinnene kan utføres i en hvilken som helst standard laboratorium som det ikke krever noe spesialutstyr. Et microarray scanner er nødvendig å skanne lysbilder. For lysbilde skanning og analyse, er GenePix Pro program som brukes, som er en svært enkel og brukervennlig program 22.
Når du har gjort alle forsøk ble analyse utført ved hjelp MicroPrep og CyberT. Den MicroPrep pakke, består av tre moduler, dvs. PrePreP, prep og PostPreP 9. Denne informasjonen pre-prosessering rammeverk reduserer tiden for normalisering av data og reduserer også mengden av kasserte data. Den enkle som programvaren kan brukes gjør det mulig for forskeren å ha en forståelse av DNA microarray data i minimum tid. Det tar bare et par minutter å konvertere rå signal data i høy kvalitet data for videre behandling etter lysbilde bildeanalyse er gjort. Videre analyser på pool av gener reguleres i microarray kan gjøres ved hjelp av ulike in-house programvarepakker. De omfatter PEPPER 20, FIVA 16, AVslØre 18, aktor 17 og Genome2D 19. Disse Windows-baserte verktøy og programvarepakker er brukervennlig og gir dyp innsikt i data under videre etterforskning. Disse programvarepakker gjør det veldig lett og hendig for forskerne å utnytte denne teknologien som data blir mye mer meningsfull og relevant.
De fargestoffer som brukes i mikromatriser er kjent for å være utsatt for en ozon-effekt, der fargestoffene blir ustabile i nærvær av ozon og signalstyrken er så lav at den ikke kan bli gjenkjent av skanneren. Amin-reaktive fargestoffer som er mindre følsomme overfor ozon-effekten blir brukt for å merke cDNA. Løsningen på ozon-effekten vil gjøre denne teknologien enda bedre.
En liste er laget av gener som var opp- eller nedregulert i nærvær av den minimale L-Serine-konsentrasjon i forhold til det maksimale (tabell 2). De oppregulert gener kan kategoriseres i henhold til deres produktets funksjon. Syv av disse koder hypotetiske proteiner, fire er involvert i transport og karbohydrat-metabolisme, en celledeling protein DivIB, og visse aminosyrer transport- og stoffskifte gener. Tilsvarende er det også visse gener som er nedregulert i vårt testet tilstand. En BglG-familien transkripsjonell regulator LicT, noen karbohydrat gener og noen aminosyre-spesifikke gener er blant de downregulated gener. En varmesjokk protein GrpE er også blant de nedregulert seg. Derfor gir denne studien en fullstendig oversikt over genene forskjellig uttrykt under de testede forholdene. Etter analyse av resultatene, er det nødvendig av og til å verifisere resultatene. Dette kan enten gjøres ved qPCR eller β-galaktosidase-assay ved bruk av lacZ-promotor-fusjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Anne de Jong og Siger Holsappel for hjelp med DNA-mikromatriser lysbilde produksjon. Anne de Jong støtte for bioinformatikk analyse er også verdsatt. Vi takker også Jelle Slager for gjennomgang av papir. Muhammad Afzal og Irfan Manzoor støttes av GC University, Faisalabad, Pakistan under fakultetet utviklingsprogram av HEC Pakistan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
