Summary

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

Published: May 10, 2015
doi:

Summary

הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).

Abstract

הזרקת stereotactic היא טכניקה שימושית כדי לספק lentiviruses גבוה כייל לאזורים במוח ממוקדים בעכברים. Lentiviruses יכול גם ביטוי יתר או ביטוי גני מציאה באזור יחסית ממוקד ללא פגיעה משמעותית ברקמת המוח. לאחר התאוששות, העכבר המוזרק יכול להיבדק על משימות התנהגותיות שונות כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST). OFT נועד להעריך את התנועה ואת הפנוטיפ החרדה בעכברים על ידי מדידת משך זמן שמבלה עכבר במרכז שדה פתוח רומן. עכבר חרד יותר ישקיע פחות באופן משמעותי זמן במרכז שדה רומן השוואה לקבוצת ביקורת. FST מעריך את הפנוטיפ אנטי-דיכאון על ידי כימות את כמות הזמן שמבלים עכברים נייחים כאשר הניחו לדלי של מים. עכבר עם פנוטיפ אנטי-דיכאון יבלה נייח פחות זמן באופן משמעותי לעומת שליטת בעלי חיים. המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בsterהזרקת eotactic של lentivirus בשיתוף עם בדיקות התנהגותיות להעריך כיצד גנטי גורמים לווסת התנהגויות של בעלי חיים.

Introduction

העכבר כבר בשימוש נרחב בנוירוביולוגיה כי זה קל לתפעל גנטי. טכניקות נוקאאוט הגן מאפשרות לחוקרים לחקור כיצד כל גורם גנטי מעצב התנהגויות עכבר. יתר על כן, מערכת cre-loxP מספקת כלי רב ערך עבור דקיק ובתא type- נוקאאוט ספציפי גן בעכברים, המאפשר לחוקרים ללמוד תפקוד גן ברקמות שונות. 1 עם זאת, בפועל, דפוסי ביטוי של יזמי cre קשים לשליטה , ועד כה רבים cre נהגים הוקמו לא השיגו ביטוי ספציפי לאזור. 2,3

לחלופין, הזרקת stereotactic היא שיטה שמכוונת אזורים ספציפיים במוח של העכבר הבוגר. על ידי הזרקת וירוסים מהונדסים גנטי לבטא cDNA או shRNA, אפנון האזור ספציפי של ביטוי גנים יכול להיות מושגת. למרות שגודל המוח של כל עכבר משתנה, המיקום של אזורים מסוימים במוח ניתן לקבוע באמצעות coordi stereotacticנטס להגדיר מציוני הדרך בגולגולת של מוח העכבר. ציוני הדרך הנפוצות ביותר הן גבחת, למבדה, וקו interaural. באמצעות קואורדינטות מתקבלות מאטלס מוח, 4 המיקום המדויק של כל אזור במוח ניתן לזהות על ידי Antero-האחורי (/ P), (M / L) המדיאלי-צדדי, וגב-הגחון (D / V) צירים מ גבחת / צומת קו interaural. בדרך כלל וירוסים שהוחדר לתוך מוחם של עכברים מתויגים עם או חלבון אדום, או ירוק ניאון (RFP או GFP), כך שניתן תהיה אישרו זריקות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הערכות התנהגות של עכברים נחוצות במיוחד למחקר בסיסי של הפרעות פסיכיאטריות. סימפטומים של הפרעות פסיכיאטריות בחולים בדרך כלל כרוכים בהתנהגויות חריגות. חלק מהתנהגויות האנושיות אלה אבולוציונית שימור וניתן חיקה ישירות ונצפה בעכבר. לדוגמא, דיכאון יכול להיות מודל בעכבר על ידי מדידת ייאוש התנהגות. אנשים עם דיכאון לעתים קרובותen מרגיש כאילו שום דבר שהם עושים אי פעם לעזור, סימפטום שיכול סופו של דבר להוביל להתאבדות. במכרסמים, זה יכול להיות מודל באמצעות הבדיקה בכפייה לשחות (FST), אשר מודדת את כמות הזמן שעכבר שחיה לעומת צף בבריכה של מים (נתפס כויתור). פרדיגמה זו אומתה על ידי הצלת פנוטיפ עם תרופות נגד דיכאון. 7,8,9 עכברים שקבלו תרופות נגד דיכאון יבלה נייח זמן באופן משמעותי פחות בהשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה. עוד מבחן התנהגותי, מבחן שדה הפתוח (OFT) נועד להעריך את התנועה בעכברים, וגם יכול לשמש כדי לנתח את הפנוטיפ החרדה בעכברים. 5,6 מבחן זה מבוסס על ההנחה שהעכברים מרגישים בטוחים יותר כאשר הם קרובים אל הקיר בשדה פתוח רומן. עכברים מסוג בר סופו של דבר יהיה לחקור את סביבת הרומן, כפי שהם בעלי חיים סקרנים. עם זאת, הוצאות פחות זמן במרכז השדה מציינת חרדה בעכבר, כמו העכבר לא יהיה מסוגל להתגבר על initiaפחד l הביא על ידי סביבת רומן. החרדה של העכבר, כמו לכמת ידי כמות הזמן מושקעת במרכז שדה פתוח, ניתן להשוות לחרדה קלינית בבני אדם, אשר שוהה בהפרעות פסיכיאטריות רבות.

השילוב של זריקות stereotactic עם פרדיגמות התנהגות הוא דרך חדשנית לשנות את הביטוי של גן מסוים באזור מוח ממוקד. ההשפעה של ביטוי גנים מווסת על התנהגויות עכבר אז יכולה להיות נחושה. בניגוד לנוקאאוט המוח כולו, שיטה זו שימושית במיוחד כפי שרק מטרות אזורים ספציפיים במוח. בנוסף, זריקות stereotactic מבוצעות בדרך כלל בעכבר הסוג בר המבוגר, לכן, ביטוי גני אנדוגני נשמר לאורך שלבי התפתחות. שיטה זו תמנע את ההשפעה לבלבל אם נדרש הגן להישרדות בשלב העוברי או לאחר לידה של פיתוח. מגבלה עיקרית אחת היא שעכברי הניסוי צריך ללכת through ניתוח פולשני, שבו יש לי הגולגולות של עכברים שייפתח. יתר על כן, מידת אפנון גן נקבעת על ידי כייל והיעילות של הנגיף. הווירוס צריך להיות מוזרק לאזור הנכון באמצעות קואורדינטות stereotactic, אשר דורש מכשירים מיוחדים. אימות של הזריקה הנכונה יכולה להסתיים רק לאחר המוות.

שיטה זו שימשה בעבר כדי לבדוק את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות נוירולוגיות שונות. לדוגמא, RNAi בתיווך ויראלי מיקוד גן Th (המאפשר דופמין להיות מסונתז) הוזרק לcompacta nigra substantia, וניתוח ההתנהגות של התנועה נערך. 10 מחקר נוסף המשמש להזרקת stereotactic של DISC1 השתקת lentivirus להעריך התנהגות עכבר ביחס לסכיזופרניה. מציאה של DISC1 הובילה לתנועה מוגברת בתגובה לחידוש (סימפטומים הקבלות חיוביים בסכיזופרניה), וחוסר תנועה גדולה יותר בFST. 11 כמו כן, מחקר נוסף מצא כי ביטוי יתר של 5-HT 1B הוביל להתנהגות גישוש עלתה בOFT, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ נוגד חרדה בשיטה זו. 12 זריקות stereotactic יכולות לספק וירוס cre לגרום רקומבינציה בעכברי cre-loxP . שיטה זו שימשה למחוק את קולט Y2 באמיגדלה וגרעין המיטה של ​​terminalis stria סלקטיבי. על ניתוח התנהגות, עכברים אלה נמצאו פנוטיפ אנטי-דיכאון כאשר הגן נמחק באמיגדלה המרכזית, אבל אין פנוטיפ כאשר הגן נמחק באמיגדלה basolateral או גרעין המיטה של terminalis stria. 13 כך, טכניקה זו מספק כלי ייחודי כדי לחקור את ההשפעה הגנטית על התנהגות בעלי חיים.

Protocol

הערה: כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים היו במעקב בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת פנסילבניה, # IACUC 44,057 1. Lentivirus הפקה הערה: היום לפני transfection, LentiX-293 תאים צריכים להיות בconfluency 80%. <ol sty…

Representative Results

הזרקת stereotactic מדויקת מסתמכת במידה רבה על הגדרת הקואורדינטות הנכונות. קצה המחט המשמשת להזרקת הווירוס צריך להיות מוגדר באופן ישיר על הצומת של גבחת וקו interaural (איור 1). זה מועיל להשתמש סטראו כדי לברר אם או לא המחט ממוקמת כראוי. כאשר מסתכלים מבעד למיקרוסקופ, המח?…

Discussion

זריקות stereotactic מוצלחות מסתמכות על שלושה גורמים: שמירה על העכבר בחיים, הגדרת נקודת האפס הנכונה לקואורדינטות (קצה המחט בצומת של גבחת וקו interaural), וקביעת העומק הנכון לנקודת האפס (קצה המחט רק נגיעה החיצונית של רקמת המוח). הכדאיות של עכברים היא חשובה. הישרדות ניתוח יכולה להסת…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Stereotactic Apparatus item 51725 Stoelting co. 51725
Quintessential stereotaxic pump  Stoelting co. 53311
Injection Styringe, 65 RN Hamilton 7633-01
DMEM Sigma-Aldrich D5796
PEI  Polysciences Inc. 23966
Scissors Fine Surgical Tools 14084-08
Blunt end forceps Fine Surgical Tools 11002-12
Needle holder  Fine Surgical Tools 12001-13
Drill Ram Products Inc Microtorque control box, Tech2000 handpiece with pedal
Glass bead sterilizer Inotech  IS-400
Absorbable sutures  Unify M-K518r19 Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs VWR 89031-270
Heating pad Gaymar T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears Rugby NDC 0536-6550-91
Disposable syringe BD Syringe 309623
Cloth
Gloves  Ansell Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic see veternarian 
Tracking software Noldus Ethovision XT
Tracking Camera Noldus Media Recorder

References

  1. Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A Cre-transgenic mouse strain for ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5080-5081 (1995).
  2. Hirrlinger, J., et al. Split-cre complementation indicates coincident activity of different genes in vivo. PLoS One. 4 (1), 1-10 (2009).
  3. Fenno, L. E., et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic. Nature Protocols. 11 (7), 763-772 (2014).
  4. Paxinos, G., Franklin, K. . The mouse brain in sterotaxic coordinates. , (2001).
  5. Gould, T. D., Dao, D. T., Kovacsics, C. E. Mood and anxiety related phenotypes in mice: the open field test. Humana Press. 42, 1-20 (2009).
  6. Denenberg, V. H. Open-field behavior in the rat: W.0hat does it mean. Annals of the New York Academy of Sciences. 159, 852-859 (1969).
  7. Bogdanova, O. V., Kanekar, S., D’Anci, K. E., Renshaw, P. F. Factors influencing behavior in the forced swim test. Physiology & Behavior. 118, 227-239 (2013).
  8. Porsolt, R. D., Anton, G., Blavet, N., Jalfre, M. Behavioral despair in rats: A new model sensitive to antidepressant treatments. European Journal of Pharmacology. 47 (4), 379-391 (1978).
  9. Hunsberger, J., Dunman, C. Animal models for depression-like and anxiety-like behavior. Nature Protocol Exchange. , (2007).
  10. Hommel, J. D., Sears, R. M., Georgescu, D., Simmons, D. L., DiLeone, R. J. Local gene knockdown in the brain using viral-mediated RNA interference. Nature Medicine. 9 (12), 1539-1544 (2003).
  11. Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136 (6), 1017-1031 (2009).
  12. Clark, M. S., Sexton, T. J., McClain, M., Root, D., Kohen, R., Neumai, J. F. Overexpression of 5-HT1B receptor in dorsal raphe nucleus using herpes simplex virus gene transfer, increases anxiety behavior after inescapable stress. Journal of Neuroscience. 2 (11), 4550-4562 (2002).
  13. Tasan, R. O., et al. The central and basolateral amygdala are critical sites of neuropeptide Y/Y2 receptor-mediated regulation of anxiety and depression. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6282-6290 (2010).
  14. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protoc Hum Gen. 12 (12.10), (2007).
  15. Carter, D. A. Anesthetizing mice. Methods Mol Biol. 18, 135-136 (1993).
  16. Alachkar, A., Jiang, D., Harrison, M., Zhou, Y., Chen, G., Mao, Y. An EJC factor RBM8a regulates anxiety behaviors. Current Molecular Medicine. 13 (6), 887-899 (2013).
  17. Bernal, J., Baldwin, M., Gleason, T., Kuhlman, S., Moore, G., Talcott, M. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery. 22, 445-451 (2009).
  18. Wahlsten, D. Getting ready for testing. Mouse Behavioral Testing: How to use mice in behavioral neuroscience. Academic Press. , 133-141 (2011).
  19. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorso-ventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 6 (77), 955-968 (2013).
  20. Snyder, J. S., Soumier, A., Brewer, M., Pickel, J., Cameron, H. A. Adult hippocampal neurogenesis buffers stress responses and depressive behaviors. Nature. 476 (7361), 458-461 (2011).
  21. Sik-Lee, J., et al. Induction of neuronal vascular endothelial growth factor expression by cAMP in the dentate gyrus of the hippocampus is required for antidepressant-like behaviors. Journal of Neuroscience. 29 (26), 8493-8505 (2009).
  22. Miller, D. G., Adam, M. A., Miller, A. D. Gene transfer by retrovirus vectors occurs only in cells that are actively replicating at the time of infection. Molecular and Cellular Biology. 10 (8), 4239-4242 (1990).
  23. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).

Play Video

Cite This Article
McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. J. Vis. Exp. (99), e52653, doi:10.3791/52653 (2015).

View Video