Stereotaktik Enjeksiyon Tekniği uygulamak Hayvan Davranışları üzerinde Genetik Etkileri Eğitim için

Summary

Lentivirüsler cDNA'larını ifade eden ya da shRNAs farelerde spesifik beyin bölgelerinde gen ifadesini modüle edebilen stereotaktik enjeksiyon. Burada, biz Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi davranışsal görevleri ile stereotaktik enjeksiyon birleştirmek için bir protokol mevcut.

Abstract

Stereotaktik enjeksiyon farelerde hedeflenen beyin bölgelerine yüksek titre lentiviruses sunmak için yararlı bir tekniktir. Lentivirüsler aşırı ifade eden ya da beyin dokusuna önemli bir zarar vermeden, nispeten odaklanmış bölgede demonte gen ekspresyonu ya. İyileştikten sonra, enjekte edilen fare gibi Açık Alan Testi (OFT) ve Zorla Swim Testi (FST) gibi çeşitli davranışsal görevler üzerinde test edilebilir. OFT fare bir roman açık alanda merkezinde geçirdiği süreyi ölçerek farelerde hareketlilik ve endişeli fenotip değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bir daha endişeli fare kontrollere göre yeni alanın ortasında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız. FST bir kova su içine yerleştirildiğinde fareler hareketsiz harcamak süreyi miktarının anti-depresif fenotip değerlendiriyor. Bir anti-depresif bir fenotipe sahip bir fare kontrol hayvanları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman hareketsiz geçirecek. Bu protokolün amacı, ster kullanmaktırdavranış testleri ile birlikte bir lentivirüs eotactic enjeksiyon hayvan davranışlarını modüle nasıl genetik faktörler değerlendirmek için.

Introduction

Bu genetik olarak manipüle edilmesi kolaydır, çünkü fare yaygın nörobiyolojisinde kullanılmıştır. Gen nakavt teknikleri her genetik faktör fare davranışlarını nasıl şekillendirdiğini araştırmacılar araştırmak için izin verir. Ayrıca, CRE-loxP sistemi doku için değerli bir araç sağlar ve farklı dokular içindeki gen fonksiyonu çalışma için araştırmacılar sağlar farelerde tip spesifik gen nakavt, Celi. ¹ Bununla birlikte, uygulamada, CRE promoterlerin ekspresyon modelleri kontrol edilmesi zor olan ve bugüne kadar birçok kurulan CRE sürücüleri bölgeye özgü ifadesini elde değil. ^2,3

Seçenek olarak ise, stereotaktik enjeksiyon yetişkin fare spesifik beyin bölgeleri hedef alan bir yöntemdir. CDNA veya shRNA eksprese genetik mühendisliği virüsleri enjekte ederek, gen ekspresyonunun bölgeye özgü modülasyonu elde edilebilir. Her bir farenin beyni boyutu değişir, ancak spesifik beyin bölgelerinde yer stereotaktik Coordi kullanılarak belirlenebilirkalça fare beyin kafatası üzerinde simgesel ayarlayın. En sık kullanılan görülecek Bregma, lambda ve interaural çizgi vardır. Beyin atlas elde edilen koordinatları kullanarak, her bir beyin bölgesinden ⁴ tam konumu antero-posterior (A / P), medyal lateral (M / L) ile tespit edilebilir, ve dorsal-ventral (D / V) 'den eksenleri Bregma / interaural hat kavşak. Enjeksiyonlar floresan mikroskobu ile teyit edilebilir ve böylece Tipik farelerin beyinlerinde enjekte virüsler ya kırmızı ya da yeşil floresan protein (RFP veya GFP) ile etiketlenmiş.

Farelerin Davranış değerlendirmeler psikiyatrik bozuklukların temel araştırma için özellikle gereklidir. Hastalarda psikiyatrik bozuklukların belirtileri genellikle anormal davranışları içerir. Bu insan davranışlarının bazıları evrimsel olarak korunmuş olan ve doğrudan taklit ve farede gözlenebilir. Örneğin, depresyon, davranışsal umutsuzluk ölçerek fare örnek alınabilir. Sık sık depresyon olan kişilerHiç yardımcı olacaktır yapmak bir şey sanki tr, sonunda intihara yol açabilir belirti hissediyorum. Kemirgenler, bu suyun bir havuzda yüzen karşı yüzme fare (vazgeçerek olarak görülüyor) süreyi ölçen Zorla Swim Testi (FST) kullanılarak modellenebilir. Bu paradigma, anti-depresanlar ile fenotip tahlisiye tarafından onaylanmıştır. Tedavi edilmeyen kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız hareketsiz anti-depresanlar almış ^7,8,9 Fare. Başka bir davranış testi, Açık Alan Testi (OFT) farelerde lokomosyon değerlendirmek için tasarlanmıştır ve ayrıca farelerde endişeli fenotip analiz etmek için de kullanılabilir. ^5,6 Bu test de yakın zaman fareler daha güvenli hissediyorum önermesine dayanır Bir roman açık alanda duvara. Onlar meraklı hayvanlar vahşi tip fareler sonunda, yeni bir ortam araştıracaktır. Ancak, alanın merkezinde daha az zaman harcama fare geçirme girişimlerini aşmak mümkün olmayacaktır olarak, fare anksiyete gösterirl korku yeni bir ortama getirdiği. Açık alanın merkezinde kaldığı zaman miktarı ile belirlenir olarak fare anksiyete, birçok psikiyatrik bozukluklarda mevcut olduğu, insanlarda klinik anksiyete, karşılaştırılabilir.

Davranış paradigmaları stereotaktik enjeksiyon kombinasyonu hedef beyin alanında, belirli bir genin ekspresyonunu değiştirmek için yeni bir yöntemdir. Fare davranışlar üzerinde modüle edilmiş gen ekspresyonu etkisi daha sonra tespit edilebilir. Tüm beyin nakavt aksine, bu yöntem, yalnızca spesifik beyin alanları hedef olarak özellikle yararlıdır. Buna ek olarak, stereotaktik enjeksiyon, tipik olarak, yetişkin vahşi tip fare gerçekleştirilir, bu nedenle, endojen gen ekspresyonu gelişim aşamalarında içinde muhafaza edilmiştir. Gen gelişim embriyonik veya postnatal aşamasında hayatta kalmak için gerekli ise bu yöntem şaşırtmak etkisini önlemek olacaktır. Bir büyük sınırlama deneysel fareler Throug gitmek gerekir olduğunuH farelerin kafatası sahip olduğu bir invaziv cerrahi, açılacak. Ayrıca, gen modülasyon derecesi virüsün titresi ve verimlilik ile belirlenir. Virüs özel aletler gerektirir stereotaktik koordinatları kullanarak doğru bölgeye enjekte edilmesi gerekmektedir. Doğru enjeksiyon yerinde doğrulanması sadece otopsi tamamlanabilir.

Bu yöntem, daha önce çeşitli nörolojik hastalıklarda spesifik bir genin katılımını test etmek için kullanılmıştır. Örneğin, virüslerin aracılık ettiği bir RNAi (dopamin sentezlenebilir sağlar) Th genini hedef substantia nigra compacta'da enjekte edildi ve lokomotor davranışını analizi yapılmıştır. Bir başka çalışmada ¹⁰ ile ilgili olarak, fare davranışını değerlendirmek için bir lentivirüs susturulması DISC1 stereotaktik enjeksiyon kullanılan şizofreniye. DISC1 demonte yenilik tepki olarak artan hareketin neden (paralellikler şizofrenide pozitif belirtiler) ve daha fazla hareketsizlikFST. ¹¹ Benzer bir şekilde, ek bir çalışma, _5-HT1B aşın dışa vurum, OFT artmış büzülmesi için bu yöntemi kullanan bir anti-anksiyete fenotipi ile tutarlı neden olduğunu buldu. ¹² Stereotaksik enjeksiyonlar CRE-loxP farelerde rekombinasyonu azaltmak için cre virüsü sağlayabilir . Bu yöntem, selektif amigdala Y2 reseptörü ve stria terminalisin yatak çekirdeği silmek için kullanılmıştır. Davranış analizi üzerine, bu fareler gen merkezi amigdala silindi bir anti-depresif fenotip bulundu, ancak bulundu gen bazolateral amigdala veya stria terminalisin yatak çekirdeğinde silinmiş hiçbir fenotip. ¹³ Böylece, bu tekniği Hayvan davranışları üzerinde genetik etkisini araştırmak için benzersiz bir araç sağlar.

Protocol

NOT: hayvanlarla ilgili tüm protokoller Pennsylvania State Üniversitesi'nden hayvan bakım yönergelerine uygun olarak takip edildi, IACUC # 44057

1. lentivirüs Üretimi

Not: Transfeksiyondan bir önceki gün, LentiX-293 hücreleri,% 80 birleşme olmalıdır.

1. Sadece transfeksiyondan önce DMEM ile hücrelerin durulayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca penisilin (100 lU / ml) ve streptomisin (100 ug / ml) içeren DMEM /% 10 FBS, 10 ml inkübe edilir.
2. 1 dakika boyunca 1 DMEM ilave edildi ve girdap: 3 oranında (PEI 3 ul DNA 1 ug:) DNA ve polietilenimin (PEI), 1 (1 mg / ml) ile seyreltilir. DNA hacmi DNA konsantrasyonuna bağlıdır ilave edildi. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   1. Örneğin, çanak başına PEI 60 ul vektör plasmidinin 10 ug, psPax2 ¹⁴ plazmidinin 5 ug, veziküler stomatit virüsü (VSV), 5 ug oluşan bir DNA plazmidi 20 ug kullanın.
3. DMEM (100 mm tabak içinde 10 ml kültür ortamı için, yani, 1 ml) 'nin toplam kültür ortamının 1/10 hacim. Çanak içine damla DNA PEI karışımı damla 1 ml ekleyin ve kültür ortamı DNA ile iyi karıştırılmış olduğu için kadar etrafında çanak girdap.
4. Oda sıcaklığında 6 saat süreyle inkübe ve süpernatant kaldırmak. Kültür ortamının 5 ml.
5. Transfeksiyondan 48 saat sonra, 50 ml bir tüp içinde, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 627 x g'de viral süpernatan ve spin toplar. Ultrasantrifüj işlemi tüp içine 0.45 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek viral süpernatanın 30 ml filtre.
6. Tüpler dengelemek ve parafilm küçük bir parça ile tüpler kapsayacak şekilde steril su ekleyin. Spin tüpler 4 ° C'de 120 dakika boyunca 11.249 x g'de. Bir vakum ucu kullanarak sıvı çıkarın.
7. Soğuk PBS 100 ul tüp ekleyin. Yavaşça 4 ° CO / N tüp sallayın.
8. Virüs, pipet t yeniden askıyaO PBS ucu ile pelet dokunmamaya dikkat ederek, pelet 10 defadan fazla adım 1.8 ekledi. Bu tamamlanana kadar pelet yeniden süspansiyon haline edilmeyecektir.
9. -80 ° C sıvı nitrojen ve mağaza tüp, flaş-freeze başına 10-20 ul virüs kısım.

2. Stereotaktik Enjeksiyon

Araçların 2.1) hazırlanması

1. Ameliyat öncesi makas, künt uç forseps, bir iğne tutucu, neşter, pamuklu bir çift ve bir sterilizasyon göstergeli kapalı bir paket içinde bir bez ve otoklav yerleştirin. Ayrıca,% 10 povidon iyot,% 70 etil alkol, emilebilir sütürler, bir ısıtma yastığı, suni gözyaşı edinin cam boncuk sterilizatör, matkap, bir matkap ucu, 2 atılabilir şırınga, enjeksiyon şırınga, elektrikli tıraş makinesi, analjezik (ketoprofen), anestetik (avertin), eldiven ve enjeksiyon pompası ile stereotaktik aparatı.
2. 0.2-kullanılarak steril kaputu% 1.25 avertin taze çözüm o gün, filtre Yap# 181; steril şırınga filtresi m ve steril serum şişenin içine yerleştirin. Tert-amil alkol 5 ml 2,2,2-tribromoetil alkol 2.5 g karıştırın, daha sonra, 200 ml su içinde çözülür. 5. ¹⁵ altında pH'ı tutun

Fare 2.2) Hazırlanması

1. Fare (375 mg / kg) 'nin ağırlığına göre avertin uygulayın. ^15, bir karın içinden (İP) enjeksiyon yoluyla Avertin fare ile enjekte edilir, ve daha sonra tamamen anestezi kadar geri kafes içine yerleştirin.
2. IP enjeksiyonu (ketaprofen, 5 mg / kg), yer ve kurumasını önlemek için fare gözleri yapay gözyaşı yoluyla bir analjezik verin.
3. Fare onların ayak kısma tamamen uykuda olduğundan emin olun. Fare ayak tutam yanıt verirse, o zaman (50 ul dozlarda) daha anestetik verir. Elektrikli tıraş makinesi kullanarak fare kafasını tıraş. (Burnu üstüne, tipik kulakların hemen arkasından) ameliyat edilecek alanı ve çevredeki tıraş.
4. Fare i yerleştirinStereotaktik aparat nto. Anterior kelepçe üzerine ön dişler Mandal ve kelepçe düşürmek ve çene tamamen güvenli olduğunu böylece sıkın.
5. Tam kafa stabilize etmek kulak kanalına kulak çubukları yerleştirin. Iç kulak zarar verebilecek olan, çok kulak çubukları eklemek için dikkatli olun. Bitmiş kez fare vücut başının pozisyonunu bozmadan hafifçe taşınacak gerekir.
6. Prosedür boyunca farenin vücut ısısını düzenlemek için farenin altında bir ısıtma yastığı yerleştirin.
7. İyice cerrahi bölgeyi temizleyin. Bir pamuklu çubuk kullanarak, cerrahi sitenin ortasından başlayarak ve dışa doğru hareket, dairesel hareketlerle% 10 povidon iyot ovalayın. Ardından, aynı şekilde cerrahi sitede% 70 etil alkol ovmak bir pamuklu bir bez kullanın. İki kez tekrarlayın.

2.3) İlk Kesi

1. Fare prepped sonra, steril ekipman çantayı açın. Değişim eldiven touchi öncealetleri ng. Steril bir bez çıkarıp bez üzerine aletleri yerleştirin. Herhangi bir enstrüman bir un-steril bir yüzey dokunursa, sterilize 15 saniye için cam boncuk sterilizatör kullanın.
2. Baskın olmayan el dominant el ve künt uçlu forseps neşter atın. Künt uç forseps yavaşça kavrama fare cilt kullanmak ve neşter kullanılarak bir kesi yapmak. Yaklaşık 1,5 cm (burun doğru) kulakların üstünde kesi başlayın ve kulakları altında yaklaşık 0.5 cm uzatmak. (Şekil 1) bregma maruz farenin kafasının ortasında aşağı dikey kesi uzatın.
3. Bregma görüntülenmiştir sonra, yavaşça kafatasının yüzeyini örten herhangi bir kan çıkarmak için steril pamuk ucu almak. Başın tarafa doğru cilt itmek için iki pamuk ipuçlarını kullanın.

2.4) Ekipman Kurulumu

1. Herhangi bir Kan kafatasının yüzeyine kaldırılır ve açık bir şekilde görünür hale bregma sonra (con şırınga hazırlanması10 ⁸ TU 1 ul / ml hacim) santrasyonu. Davlumbaz, virüs ile şırınga enjekte edilecek doldurun. Hiçbir kabarcıklar içinde olduğundan emin olun. Tam güvenli olduğundan emin olun, stereotaktik aparatı içinde şırınga yerleştirin.
2. Steril şırınga iğne ucu bregma kesiştiği ve interaural hattına ayarlanır böylece, doğru kafatasının yüzeyi üzerinde olduğu kadar yavaşça şırınga indirin. Sıfır olarak bu noktayı ayarlayın ve bu noktadan itibaren koordinatları belirler.
3. Ilgi beyin alanına bağlı olarak, stereotaktik koordinatlar değişir. Bir beyin atlası ⁴ kullanılarak bu koordinatları belirler. Koordinatlar belirlendikten sonra, bu koordinatları maç için şırınganın iğne taşımak. Koordinatları kullanarak dentat girus Hedef: = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm M / L. Delik delinmiş gereken yere görselleştirmek için kafatası üzerinde sağa iğne indirin.
4. Biraz şırıngayı kaldırın matkap almak ve matkap bi yerkafatasına yaklaşık 45 ° açıyla hedef matkap sitenin üstünde t hakkı. Sondaj başlayın ve kafatası yol verir kadar sondaj tutmak. Kafatası yol verdiğinde, direniş bir düşüş tespit edilebilir. Kortikal hasar görmesini önlemek amacıyla, beyne delmek için dikkatli olun.
5. Steril pamuk ucu alın ve delikten herhangi bir kan silin.
6. Ucu sağ beyin (değil kafatası) yüzeyinde oturur, böylece şırınga indiriniz. D / V beyin atlas koordinatlara göre, istenilen derinliğe Alt 0'a şırınga (derinlik) koordinat ayarlayın. -1,79 Mm dentat girus, set D / V ulaşmak için.
7. 0.2 ul / dk'lık bir hızda enjekte başlatın. Şırınga istenilen derinliğe daha düşük kayma olmadığından emin olmak için izleyin. Bu durum ortaya çıkarsa, yavaşça tekrar istenilen derinliğe şırınga yükseltmek.
8. Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, herhangi bir kalıntı virüs absorbe edildiğinden emin olmak için yaklaşık 2 dakika bekleyin. Yavaş yavaş şırınga yükseltmek ve herhangi li kaldırmak için bir pamuk ucu kullanınenjeksiyon yerinde sterlin.
9. Diğer yarımkürede için tekrarlayın.

2.5) Sütür

1. Ambalajından ve kavrama iğne tutucular kullanılarak iğne steril dikiş ve iğne çıkarın. Uzak iğne tutucu iğne sivri kenarını Yüz. Baskın olmayan el künt uç forseps tutun ve fare üzerindeki kavrama cilt kullanabilirsiniz. Dominant elin ile başlayın.
2. Yavaşça deri yoluyla sütür itmek ve kesi diğer tarafında cilt kapmak için künt uçlu forseps kullanabilir. Yaklaşık 0.75 inç kalana kadar yoluyla sütür materyali çekin.
3. Iğne gidelim ve iğne tutucu bir anda etrafında dikiş sarmak için künt uçlu forseps kullanabilir, daha sonra, iğne tutucu ile 0.75 inç kalan dikiş kapmak ve aracılığıyla dikiş çekme iğne ve iğne tutucu, böylece Onlar aslında vardı ki o kafa karşısındaki tarafında sonunda. Bu bir düğüm oluşturmalıdır.
4. Bu adımı yineleyinÜç kez daha, başın yan alternatif iğne tutucu, her zaman biter.
5. Sütür kesin ve adımları tekrarlayın 2.5.1-2.5.3 kesi kapanana kadar.

2.6) Post-operatif Bakım

1. Yavaşça fare kulak çubukları kaldırmak ve ön kelepçe onun çenesini kaldırın.
2. O uyanır ve kendi etrafında hareket edinceye kadar ısıtma yastığı fare tutun. Günlük fare izleyin ve tutmak ve bu, damat yeme ya da içme olarak değil ağrı belirtileri, göz dışarı. Gerekli görüldüğünde ek analjezik verin.

3. Açık Saha Testi

3.1) Kurma

1. 50 cm yüksekliğinde duvarlarla, boyutları 50 cm x 50 cm boş bir kare, plastik arenada edinin (ama biraz daha büyük olabilir). Deney başlamadan önce,% 70 etil alkol ile arena temizleyin. Etil alkol tamamen arenaya fare yerleştirmeden önce kuru olduğundan emin olun.
2. Üzerinde arena yerleştirinZemin ve aydınlatma gölgeler ve parlamayı en aza indirmek için ayarlandığından emin olmak için deneyin.
3. Izleme yazılımı kullanıyorsanız, (fare net bir görünümü var yeterince uzakta tam kapsayacak şekilde bütün arenada, ama yeterince yakın), açık alan doğrudan havai açık alanda üzerinde yaklaşık 1,5 ft kamerayı yerleştirin.
4. Kutu (30 cm x 30 cm yaklaşık bir alan) merkezinde bir bölge oluşturun. ^16, bir dilimini ayarlamak yan paneldeki bölge 1 sekmesine tıklayın.
   1. Üst panelinde bir şekil anahat seçin ve merkez bölgenin çevresini özetlemektedir. Bölge eklemek seçin ve merkez bölgesi iç tıklayınız. Program istemleri kullanarak (bu prosedür için 'merkezi' olarak anılacaktır) bölge adlandırın. Davranışsal deney elle atılır ise, alanın alt bandı kullanılarak işaretlenmiş, 10 cm x 10 cm kareler ayrılmıştır emin olun.
5. Yazılımı kurmak, böylece ayarlarının doğru ve fare kolayca visi olduğunuEkranda ble. Test arena (aydınlatma) ve fare rengi ile uyumlu olacak şekilde makine üzerinde algılama ayarları yaparak bu başarmak.
   NOT: ayarları doğru olduğunda, sistem herhangi bir gölge veya idrar / dışkı sadece fare izlemek ve olmamalıdır. Belirli yazılım ayarları arena aydınlatma ve fare rengine bağlıdır.

3.2) Acclimation ve Test

1. Çevrelerine onları gelmesini amacıyla test öncesi davranışsal oda 1 saat içine deneysel fareler taşıyın. Iklimlendirme için kendi kafesine fareler bırakın.
2. Teybe kameraya davranışsal görev açın ve fare duvara bakacak şekilde arena orta önüne doğru fareyi yerleştirin.
3. 5 dakika boyunca zamanlayıcıyı ayarlayın ve uzak arenada adım. Mümkünse yanlışlıkla fare etkilemediği şekilde, odadan.
4. 5 dk kadar olduğunda, fare kaldırmak ve onların kafese koyun.
5. İyice bir sonraki fare geçmeden önce alanı temizlemek için% 70 etil alkol kullanın. Etil alkol tamamen kuruduktan emin olun.

3.3) Puanlama

1. Dört pençeleri orta 30 cm x 30 cm içeride olduğunda alanın ortasında varlık olarak fareyi düşünün.
2. Fare merkezinde geçirdiği süreyi ölçmek. Alternatif olarak, bu kez (örneğin Noldus ethovison gibi) izleme yazılımı kullanarak belirler.
   1. Bunu yapmak için, analiz sekmesine gidin ve analiz profilleri altındaki "hareketi" üzerine tıklayın. Şu anda belirlenen kategoriler silin ve sonra konum sekmesi altında "bölgesinde" seçeneğini seçin. Merkez dilimini seçin. Sonra, sonuçlarını görüntülemek için (sonuç sekmesi altında) "analiz çıkışını" seçeneğini seçin. Her deneme görünmelidir zaman listeleyen bir tablo hareketsiz geçirdi.
3. Aksi takdirde, elle OFT puan. açık alan ope altındaki ana hatları 25, 10 cm x 10 cm'lik kareler olmalıdırn alan (as adım 3.1.3 belirtilen). Fare arena merkezi haline girişlerin sayısına ek olarak, merkezde geçirdiği süreyi ölçmek. ¹⁶
   NOT: Merkez 30 cm x 30 cm alan açık alanda merkezi olarak kabul edilir. Bir fare dört pençeleri 30 x 30 cm alanı içinde ise merkez bölgesini yaşayan olarak kabul edilir.

4. Zorla Swim Testi

NOT: davranışsal görevleri arasında beş gün en az bekleyin.

4.1) Kurma

1. 2 L açık kova edinin ve 22 ° C su ile doldurun. Bir masanın üzerine kova yerleştirin ve aydınlatma gölgeler ve parlamayı en aza indirmek için ayarlandığından emin olmak için deneyin.
2. Izleme yazılımı kullanıyorsanız, doğrudan havai kepçenin kamerayı yerleştirin.
3. Yazılımı kurmak fare ekranda kolayca görülebilir şekilde.

4.2) Acclimation ve Test

1. Davranışsal ro içine deneysel fareler TaşıTestten önce om 1 saat çevresi ile uyum sağlamaya. Iklimlendirme için kendi kafesine fareler bırakın.
2. Teybe kamera davranışsal görev açın. Yavaşça su kepçenin ortasında fare. Fareyi düşürmemeye dikkat edin. Yavaş yavaş fare düşürmek, ön ayakları ilk suya değecek şekilde. Daldırarak kendi kafasını önlemek için özen gösterin.
3. 6 dakika zamanlayıcı ayarlayın ve davranışsal alandan uzaklaşın.
4. 6 dakika kadar olduğunda, kova fareyi kaldırmak ve onların kafesine geri fare yerleştirmeden önce aşırı su silin.

4.3) Puanlama

1. Yüzme vs yüzen zaman ölçmek için, (bu varsayılan ayar olmalı) Noldus tarafından önerilen izleme yazılımı kullanıyorsanız,% 11 oranında hareketsizliği ayarlayın.
2. Izleme sistemi kullanarak ölçmek için, analiz sekmesine gidin ve analiz profilleri altında hareket tıklayınız. Üzerine, şu anda ayarlanmış kategoriler silin ve sonra hareketlilik durumunu seçin(bireysel davranış altında) sol yan panel. % 11 hareketsizlik ayarlayın.
3. Sonuçlar sekmesinin altında, parça görselleştirme seçin. Sonuçları görmek için (sonuç sekmesi altında) analiz çıkışını seçin. Her deneme görünmelidir zaman listeleyen bir tablo hareketsiz geçirdi.
4. El puanlama, fare, fare hareketsiz geçirdiği zamanın yüzme veya tırmanma ve miktarı harcıyor zamanı ölçmek. Buna ek olarak, ilk kez hareketsiz ila gecikme ölçmek. Sonuçlar Bölüm Şekil 2'ye bakınız.

Representative Results

Doğru stereotaktik enjeksiyon doğru koordinatları ayarı dayanır. virüs enjekte etmek için kullanılan iğnenin ucu bregma kesiştiği ve interaural hat (Şekil 1) doğrudan ayarlanması gerekir. Bu iğne doğru yerleştirilmiş olup olmadığını belirlemek için bir stereomikroskopta kullanmak yararlı olur. Mikroskop ile bakıldığında virüsü enjekte edildi, bu bregma kesiştiği interaural hat üzerinde doğrudan toprak olacaktır, böylece iğne konumlandırılmalıdır. Bu şırınga iğnesi açılış doğrudan kavşak üzerinde yer almalıdır vardır. Bu çalışmada, RBM8a, ekzon birleşim kompleksinde bir çekirdek faktörüne karşı shRNA eksprese eden bir lentivirüs, dentat girus enjekte edilmiştir. lentivirüs da enfekte nöronlar etiket RFP ifade eder. 2 kırmızı sinyal (Şekil 3) ile belirtildiği gibi virüs doğru bölgeye enjekte edildiğini göstermektedir.

davranışsal görevleri önemini ulaşmak için _content ">, örneklem büyüklüğü, grup başına 12-15 fareden aralığında olmalıdır. Davranış görevleri iki hafta stereotaktik enjeksiyondan sonra yapılabilir. OFT olarak, endişeli fenotip mevcut olduğu farelerde önemli ölçüde daha az zaman harcamak Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında açık bir alanın merkez. Sonuçlar Yetişkin farelerin dentat girus RBM8a bu demonte göstermektedir tedirgin davranışları (p <0.05, Şekil 4) yol açar. FST olarak, hareketsizlik hiçbir gözlenebilir bir fark yoktu Kontrol ve dentat girus RBM8a demonte anti depresif davranış (Şekil 5) etkilemediğini de öneren deneysel fareler. arasında istatistiksel analizler, bir, iki kuyruklu, iki numune eşit varyans t-testi oluşuyordu.

Şekil 1: bregma ve Inter Kavşağıişitsel Hattı. stereotaktik enjeksiyonlar için şırınga iğnesi bregma kesiştiği ve interaural hattı ile dizilmiş olmalıdır. Bu nokta sıfır olarak belirlenmiştir.

Şekil 2: Şematik Gösterimi Bütün deneyi için zaman çizelgesi.

Dentat girus içine virüs başarılı bir enjeksiyon gösteren Temsilcisi beyin dilim ölçek çubuğu = 100 mikron: Şekil 3..

Şekil 4:. Kontrol ve bir Roman Açık Alan Merkezi'nde geçirdi Deneysel Fare Deneysel fareler anlaml harcadıkları Zaman Miktarıendişeli bir fenotip gösteren arena merkezinde icantly daha az zaman (n = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0.05, ortalama ± SEM)

Şekil 5:. Kontrol ve Deney Fare FST EDİLMİŞ TAŞINMAZ olduklarını Zaman Miktarı Deneysel fareler hareketsiz geçirdiği süre içinde kontrollerden farklı değildir (N = 9-11 = 1.25 T _18, p> 0.05, ortalama SEM)

Discussion

Başarılı stereotaktik enjeksiyonları üç faktöre dayanır: iğne (uç, canlı fare tutmak (bregma kesiştiği ve interaural hat üzerinde iğne ucu) koordinatları için doğru sıfır noktası ayarlama ve sıfır noktasına doğru derinlik ayarı Sadece) beyin dokusu dış dokunmadan. farelerin canlılığı önemlidir. Cerrahi hayatta kalma fare düzgün anestezi ve yeterli analjezik aldığı olduğundan emin yaparak destekli edilebilir. Ağrı ameliyat sonrası zayıf kazanımı önemli bir nedeni olduğu bilinmektedir. Fare tam ameliyat boyunca anestezi sağlamak (bu ayak tutam yanıt olmamalı) ve analjezik doğru doz vererek hayatta kalma yardımcı olmalıdır (fare ağırlığına göre). ¹⁷ Ayrıca, fare üzerinde tutulmalıdır Ameliyat süreci boyunca bir ısıtma yastığı anestezi uyanır kadar. Onlar anestezi zaman Fareler kendi vücut ısılarını edemez. Onların vücut öfkeçalıçtırdıgınızda ameliyatı sırasında önemli ölçüde düşecek. Stereotaktik cerrahi uzunluğu nispeten kısa olsa da, hipotermi ciddi fare hayatta bozabilir. Uygun sütür tekniği de başarılı bir ameliyat yapılması vesile olduğunu. Fareler onların sütür de almaya çalışın, böylece yaranın üzerine çok fazla gerginlik koymak gibi çok sıkı dikişler kaldırılmasını önlemek için yeterince sıkı olduğundan emin olmak için çok önemlidir, ancak. Her dikiş Dört knot fare dikiş kaldırmak mümkün olmadığına emin olmalıdır. Açık yara olumsuz herhangi bir davranış deneyleri etkileyecek enfeksiyonlara, duyarlılık artacak gibi uygun dikiş önemlidir.

OFT lokomosyon ve farelerde endişeli fenotip değerlendirmek için tasarlanmış bir davranış paradigma olduğunu. Fare davranışı sınarken, bu fareler taşıma ve arena kurarken çok dikkatli olmak önemlidir. OFT olarak, paradigma farenin tutuklanması whe eşleştirmek için tasarlanmıştırn doğal bir merakla, yeni bir ortamda yerleştirilir ve yenilik keşfetmek istiyorlar. Bir vahşi tip fare, başlangıçta daha savunmasızdır açık alan, merkezi girmek için kararsız olacaktır, ama sonunda nedeniyle doğuştan merak, bu yüzden yapacağız. Endişeli bir fare, bir daha savunmasız alan (alan merkezi) geçen yakalanması doğal merak ve merkeze harcanan önemli ölçüde daha az sürede sonuçlanacak olan, keşfetmek arzusu daha büyük olacaktır. Emin paradigma düzgün çalışır hale getirmek için, açık alanda dışındaki faktörler ile ilişkili stresi en aza indirmek için önemlidir. Stres fare davranışsal odası (yani dış ortam olası bir karıştırıcı değişken değildir) gelmesini sağlayan ve önceki fare ile ilişkili tüm kokuyor kaldırılmıştır garanti, farelerin arasında alanını temizleyerek minimize edilebilir. ¹⁸ yanlış neden olduğu herhangi bir farklılık ortadan kaldırmaya yardımcı olmalıdır Bu adımlar handling fareler. Bu çalışmada, RBM8a demonte farenin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, yeni bir açık alan merkezinde önemli ölçüde daha az zaman harcanan. Fareler onlar kontrollere göre, daha savunmasız olan yeni açık alan, orta girmek için daha isteksiz çünkü bu, bir endişeli fenotip göstergesidir.

FST farelerde anti-depresif bir fenotip araştırmak için çalışmaktadır. Bir kova su yerleştirildiğinde, yüzme karşı yüzen önemli ölçüde daha az zaman harcamak fareler bir anti-depresif fenotipe sahip olduğu kabul edilir. Zorla yüzme testinde hareketsizlik (örn vazgeçerek) davranışsal umutsuzluk olarak yorumlanır. Bu paradigma, anti-depresan tedavisi ile doğrulanır. Anti-depresan ilaçlar önemli ölçüde daha az zaman harcayacaksınız alıyorsunuz ^7,8,9 Fareler, bir anti-depresif fenotip göstergesidir kontrollere kıyasla kayan. Bu çalışmada, RBM8a demonte farelerinin gözle görülür şekilde sabit harcanan zaman, kontrol farelerinden gelen farklı değildi. This, yetişkin farelerin dentat girus RBM8a demonte depresif, ya da anti-depresif bir fenotip ortaya etmediğini gösterir. Daha önceki çalışmamızda, erişkin farelerin dentat girus RBM8a aşın ölçüde bir anti-depresif etki gösterir, hangi kontrollerle karşılaştırıldığında zaman hareketsiz azalır. ¹⁶

Bu yazıda gösterimi için kullanılan stereotaktik enjeksiyonları dentat girus hedeflenmiştir. ilgi konusu genin yüksek erişkin fare orada ifade edilir çünkü dentat girus, hedef bölge olarak seçildi. Buna ek olarak, dentat girus depresyon ve anksiyete ile ilişkili olmuştur. Örneğin, bir çalışma seçici dorsal veya ventral dentat girus ya granül hücrelerinin aktive etmek için POMC-CHR2 fareler kullanıldı. Dorsal ve ventral hem kıvrımlarının Aktivasyon anksiyete kıvrımlarının bir potansiyel rolünü gösteren bir roman çevrenin artan keşif yol açtı. ¹⁹ farklı çalışmaengelli nöron o fareler. depresif fenotip gösteren FST içinde hareketsizlik artmıştı ²⁰ Dahası, ön beyin Ap oa ₁ aktivasyonu bir anti-depresif FST yürürlüğe, yenilik bastırılmış beslenme ve sukroz tüketim testi neden buldum. VEGF Ap oa ₁ dentat girus çaldı aşağı iken, bu anti-depresif fenotip ²¹ Bu veriler dentat girus anksiyete ve depresyon patofizyolojisinde bir role sahip olduğunu göstermektedir. Kaybetti ve dentat girus olabileceğini belirtilmiştir İyi bir alan genetik modülasyon ve davranışsal deneyler için hedef. Dentat girus tüm hücreler enfekte böylece yalnızca bölünen hücreler (retrovirüs) karşıt olarak bir lentivirüs, özellikle kullanılmıştır.

Bir virüs Belir enjekte edilebilir yana (diğer davranış görevlere ek olarak), bu üç deney tasarımları bir kombinasyonu, farelerde davranış fenotipleri değerlendirmek için yeni bir yoldurBelirli gelişim zamanlarda ic beyin alanı. Davranışsal görevleri ile eşleştirilmiş bir lentivirüs stereotaktik enjeksiyonları kullanarak sadece tamamlamak için birkaç ay sürer ve araştırmacılar, belirli bir beyin bölgesinde gen ifadesinin davranışsal etkileri üzerine ilk verileri toplamak için izin verir. Buna karşılık, koşullu nakavt fareler genellikle oluşturmak için yıllar sürebilir. Ayrıca, virüslerin, hücre tipi tercih yere hücreleri hedeflemek için kullanılabilir. Örneğin, retrovirüsler, sadece lentivirüs, tüm hücre tipleri enfekte ise (örneğin, dentat girus nöral kök hücreleri gibi) bölünen hücreleri enfekte edebilir. ^22,23 Böylece, birbirine eş enjeksiyonu ile bu yaygın olarak kullanılan ve tek başına doğrulanmış deney protokolleri hızlı sağlamak ancak kapsamlı bir şekilde fare davranışları üzerine, hedeflenen beyin alanda özel genin rolünü test etmek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder