Anvendelse af Stereotaktisk injektionsteknik at studere genetiske virkninger på Animal Behaviors

Summary

Stereotaktisk injektion af lentivirus udtrykke cDNA eller shRNAs kan modulere genekspression i bestemte områder i hjernen af ​​mus. Her præsenterer vi en protokol til at kombinere stereotaktiske injektioner med adfærdsmæssige opgaver, såsom Open Field Test (OFT), og den Forced Swim Test (FST).

Abstract

Stereotaktisk injektion er en nyttig teknik til at levere høj titer lentivira til målrettede hjerneområder hos mus. Lentivirus kan enten overudtrykke eller Knockdown genekspression i et relativt fokuseret regionen uden betydelig skade på hjernevæv. Efter inddrivelsen, kan den injicerede mus testes på forskellige adfærdsmæssige opgaver såsom Open Field Test (OFT), og den Forced Swim Test (FST). OFT er designet til at vurdere bevægelse og den ængstelige fænotype i mus ved at måle mængden af ​​tid, som en mus tilbringer i centrum af en hidtil ukendt åben mark. En mere ængstelig mus vil bruge betydeligt mindre tid i midten af ​​romanen felt sammenlignet med kontroller. FST vurderer anti-depressive fænotype ved at kvantificere mængden af ​​tid, at mus tilbringer immobile når den placeres i en spand vand. En mus med et anti-depressiv fænotype vil markant mindre immobile sammenlignet med kontroldyr. Målet med denne protokol er at bruge stereotactic injektion af en lentivirus i forbindelse med adfærdsmæssige test for at vurdere, hvordan genetiske faktorer modulere dyr adfærd.

Introduction

Musen har været meget anvendt inden for neurobiologi, fordi det er let at manipulere genetisk. Gene knockout teknikker gør det muligt for forskerne at undersøge, hvordan de enkelte genetiske faktor former mus adfærd. Desuden cre-loxP system giver et værdifuldt redskab til vævs- og celle type- specifikt gen knockout i mus, som gør det muligt for forskerne at studere genfunktion i forskellige væv. ¹ I praksis, er vanskelige at kontrol ekspressionsmønstre for CRE promotorer , og indtil videre mange etablerede CRE bilister har ikke opnået region-specifikke udtryk. ^2,3

Alternativt stereotaktisk injektion er en metode, der er rettet mod specifikke hjerneregioner hos den voksne mus. Ved injektion af genetisk manipulerede vira, der udtrykker cDNA eller shRNA, kan region-specifik modulering af genekspression opnås. Selvom hjernen størrelsen af ​​hver mus varierer, kan placeringen af ​​specifikke hjerneregioner bestemmes under anvendelse stereotaktisk samordningnater sæt fra landmærker på kraniet af muse hjerne. De mest almindeligt anvendte landmærker er bregma, lambda, og den interaurale linje. Ved hjælp af koordinater opnået fra en hjerneatlas, kan ⁴ den nøjagtige placering af hver hjerne område identificeres ved antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), og dorsal-ventral (D / V) akser fra bregma / interaurale linje skæringspunkt. Typisk vira injiceres ind i hjernen på mus er mærket med enten røde eller grønt fluorescerende protein (RFP eller GFP), således at injektioner kan bekræftes ved fluorescerende mikroskopi.

Adfærdsmæssige vurderinger af mus er særligt nødvendige for grundforskning af psykiatriske lidelser. Symptomer på psykiatriske lidelser hos patienter typisk involverer unormal adfærd. Nogle af disse humane adfærd er evolutionært bevaret og kan direkte efterlignes og observeret i mus. For eksempel kan depression modelleres i musen ved at måle adfærdsmæssige fortvivlelse. Mennesker med depression OFTen føler som om intet de gør nogensinde vil hjælpe, et symptom, der i sidste ende kan føre til selvmord. I gnavere kan dette modelleres ved hjælp af den Forced Swim Test (FST), som måler den tid en mus svømning versus flydende i en pulje af vand (set som at give op). Dette paradigme er valideret ved at redde fænotypen med anti-depressiva. ^7,8,9 Mus, som har modtaget anti-depressiva vil markant mindre immobile sammenlignet med ubehandlede kontroller. En anden adfærdsmæssige test, Open Field Test (OFT) er designet til at vurdere bevægelse i mus, og derudover kan bruges til at analysere den ængstelige fænotype i mus. ^5,6 Denne test er baseret på den forudsætning, at mus føle sig sikrere, når de er tæt til væggen i en hidtil ukendt åben mark. Vildtypemus sidste ende vil undersøge det hidtil ukendte miljø, som de er nysgerrige dyr. Dog bruger mindre tid i midten af ​​feltet angiver angst hos mus, når musen ikke vil være i stand til at overvinde den initial frygt forårsaget af en roman miljø. Angst for musen, som kvantificeret ved mængden af ​​tid brugt i midten af ​​et åbent felt, kan sammenlignes med klinisk angst hos mennesker, som er til stede i mange psykiatriske lidelser.

Kombinationen af ​​stereotaktiske injektioner med adfærdsmæssige paradigmer er en ny måde at ændre ekspressionen af ​​et specifikt gen i en målrettet hjerneområde. Virkningen af ​​modulerede genekspression på musen adfærd kan derefter bestemmes. I modsætning til hele hjernen knockout, denne metode er særlig nyttig, da den kun er rettet mod bestemte områder i hjernen. Desuden er stereotaktiske injektioner udføres typisk i den voksne vildtype mus derfor endogent gen ekspression er blevet opretholdt gennem udviklingsstadier. Denne metode vil undgå forvirre virkning, hvis genet er nødvendig for overlevelse under den embryonale eller postnatal udviklingstrin. En væsentlig begrænsning er, at de eksperimentelle mus skal gå through en invasiv kirurgi, hvor kranierne på mus skal åbnes. Desuden er graden af ​​genet modulation bestemmes af titer og effektivitet af virus. Virussen skal injiceres ind i den korrekte region ved anvendelse stereotaktiske koordinater, som kræver specielle instrumenter. Kontrol af korrekt injektionsstedet kan kun udfyldes post mortem.

Denne metode er tidligere blevet anvendt til at teste inddragelse af et specifikt gen i forskellige neurologiske sygdomme. For eksempel viral medieret RNAi målretning Th-genet (som tillader dopamin, der skal syntetiseres) blev injiceret i substantia nigra compacta, og lokomotorisk adfærd analyse blev udført. ¹⁰ En anden undersøgelse anvendte stereotaktisk injektion af et lentivirus silencing DISC1 at vurdere museadfærd i forhold til skizofreni. Knockdown af DISC1 førte til øget bevægelse som reaktion på nyheden (paralleller positive symptomer i skizofreni), og større immobilitet iFST. ¹¹ Ligeledes en ekstra undersøgelse viste, at 5-HT _1B overekspression ført til øget udforskende adfærd i OFT, i overensstemmelse med en anti-angst fænotype ved hjælp af denne metode. ¹² stereotaktiske injektioner kan levere cre virus til at inducere rekombination i cre-loxP mus . Denne fremgangsmåde blev anvendt til selektivt at slette Y2 receptoren i amygdala og sengen kerne af stria terminalis. Ved adfærdsmæssige analyse blev disse mus fundet at en anti-depressiv fænotype når genet blev slettet i den centrale amygdala, men ingen fænotype når genet blev slettet i den basolaterale amygdala eller sengen kernen i stria terminalis. ^13. Således denne teknik giver et unikt værktøj til at studere den genetiske effekt på dyr adfærd.

Protocol

BEMÆRK: Alle protokoller, der involverer dyr blev fulgt i overensstemmelse med retningslinjerne fra The Pennsylvania State University dyr pleje, IACUC # 44057

1. Lentivirus Produktion

BEMÆRK: Dagen før transfektion bør LentiX-293 celler være på 80% konfluens.

1. Skyl celler med DMEM lige før transfektion og inkuberes i 10 ml DMEM / 10% FBS med penicillin (100 IE / ml) og streptomycin (100 ug / ml) i 5 minutter ved stuetemperatur.
2. Fortynd DNA og polyethylenimin (PEI) (1 mg / ml) i forholdet 1: 3 (1 pg DNA: 3 pi PEI) i 1 ml DMEM og vortex i 1 min. Volumenet af DNA tilsættes, er afhængig af koncentrationen af ​​DNA'et. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
   1. Brug f.eks 20 ug DNA-plasmid, der består af 10 ug vektorplasmid, 5 pg psPax2 ¹⁴ plasmid, 5 ug af vesikulær stomatitis-virus (VSV) med 60 ul PEI pr fad.
3. Tilsæt 1 / 10th af den samlede mængde dyrkningsmedium DMEM (dvs. 1 ml til 10 ml dyrkningsmedium i en 100 mm skål). Der tilsættes 1 ml DNA-PEI-blanding dråbe for dråbe i fadet og vend skålen rundt, indtil til dyrkningsmediet er velblandet med DNA.
4. Der inkuberes i 6 timer ved stuetemperatur og fjern supernatanten. Der tilsættes 5 ml dyrkningsmedium.
5. 48 timer efter transfektion, indsamle viral supernatant og centrifugering ved 627 xg i 5 minutter ved 4 ° C i et 50 ml rør. Filter 30 ml viral supernatant gennem et 0,45 um sprøjte filter over i en ultracentrifugerør.
6. Tilføj sterilt vand at balancere rørene, og dække rør med lille stykke parafilm. Spin rør ved 11.249 xg i 120 minutter ved 4 ° C. Fjerne væske under anvendelse af en vakuum spids.
7. Tilføj 100 pi kold PBS røret. Forsigtigt rocke røret ved 4 ° CO / N.
8. At re-suspendere-virus, pipette than PBS tilføjede i trin 1.8 over pellet 10 gange, og pas på ikke at røre pillen med spidsen. Pillen vil ikke være re-suspenderes, indtil dette er gennemført.
9. Alikvot virus på 10-20 pi pr rør, flash-freeze i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.

2. Stereotaktisk Injektion

2.1) Fremstilling af instrumenter

1. Placer en saks, stump-end pincet, en nåleholder, skalpel, vatpinde og en klud i en forseglet pakke med sterilisering indikator, og autoklave før operation. Derudover får 10% povidon jod, 70% ethanol, absorberbare suturer, en varmepude, kunstige tårer, en glasperle sterilisator, boremaskine, en boret, 2 engangssprøjter, en injektionssprøjte, elektrisk barbermaskine, analgetikum (ketoprofen), bedøvelsesmiddel (avertin), handsker og en stereotaktisk apparat med indsprøjtningspumpen.
2. Gøre 1,25% avertin opløsning friske dag, filter i en steril hætte ved anvendelse af en 0,2 &# 181; m steril sprøjte filter, og anbringes i et sterilt serum hætteglas. Bland 2,5 g 2,2,2-tribromethyl alkohol i 5 ml tert-amylalkohol, derefter opløses i 200 ml vand. Holde pH under 5. ¹⁵

2.2) Fremstilling af musen

1. Administrere avertin baseret på vægten af musen (375 mg / kg). ¹⁵ Injicer musen med avertin via en intraperitoneal (IP) injektion, og derefter placere tilbage i sit bur indtil fuldt bedøvet.
2. Giv en analgetisk via IP injektion (ketaprofen, 5 mg / kg), og sted kunstige tårer på øjnene af musen for at forhindre udtørring.
3. Sørg for, at musen er fuldt i søvn ved at klemme deres mund. Hvis musen reagerer på foden knibe, derefter give mere bedøvelse (i doser på 50 pi). Barbere lederen af ​​mus under anvendelse af en elektrisk barbermaskine. Barbere det område, der skal drives på (typisk fra lige bag ørerne, til toppen af ​​snuden), og det omkringliggende område.
4. Placer musen into stereotaktisk apparat. Lås fortænderne på den forreste klemme, og sænk klemmen og stram den, så kæben er helt sikker.
5. Sæt øre barer i øregangen til fuldt ud at stabilisere hovedet. Pas på ikke at indsætte øre barer for langt ind, hvilket kan beskadige det indre øre. Når færdig, bør selve musen kunne bevæges lidt uden at forstyrre positionen af ​​hovedet.
6. Placer en varmepude under musen for at regulere musens kropstemperatur hele proceduren.
7. Rengør kirurgiske område grundigt. Med en vatpind, gnide 10% povidon-iod i en cirkulær bevægelse, startende fra midten af ​​det kirurgiske sted og bevæger sig udad. Brug derefter en vatpind til at gnide 70% ethylalkohol på operationsstedet på samme måde. Gentag to gange.

2.3) Den første Incision

1. Når musen er prepped, åbnes sterilt udstyr taske. Skift handsker før Touching instrumenterne. Tag den sterile klud og placere instrumenterne på kluden. Hvis et instrument rører en un-steril overflade, bruge glaskugle sterilizer i 15 sek til at sterilisere det.
2. Tag skalpel i de dominerende hånd og stump-end pincet i den ikke-dominerende hånd. Brug stumpendet pincet til forsigtigt greb huden af ​​mus, og lave et snit ved hjælp af skalpel. Begynd snittet omkring 1,5 cm over ørerne (mod næsen) og strækker sig til ca. 0,5 cm under ørerne. Forlænge snittet lodret ned midt på musens hoved for at blotlægge bregma (figur 1).
3. Når bregma visualiseres, tage en steril vatpind til forsigtigt at fjerne noget blod dækker overfladen af ​​kraniet. Brug to vatpind til at skubbe huden mod siden af ​​hovedet.

2.4) Udstyr Setup

1. Efter noget blod fjernes fra overfladen af ​​kraniet, og bregma klart visualiseret, forberede sprøjten (concentration på 10 ⁸ TU / ml, volumen på 1 pi). I stinkskab, fylde sprøjten med virus, der skal injiceres. Sørg for, at ingen bobler er inde. Placer sprøjten i stereotaktisk apparat, og sørg for at den fuldt ud er sikret.
2. Sænk langsomt sprøjten, indtil det er ret over overfladen af ​​kraniet, således at spidsen af ​​den sterile kanyle er indstillet til skæringspunktet mellem bregma og den interaurale linje. Indstil dette punkt som nul, og bestemme koordinaterne fra dette punkt.
3. Afhængigt af hjernen interesseområde, varierer de stereotaktiske koordinater. Bestemme disse koordinater ved anvendelse af en hjerne atlas ^4. Når koordinaterne bestemmes, flytte nålen af ​​sprøjten for at matche disse koordinater. Målrette den tandede gyrus ved hjælp af koordinater: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Sænke nålen til højre over kraniet at visualisere hvor hullet skal bores.
4. Hæv sprøjten lidt, tage boret og placere boret bit lige over målet borestedet på omkring en 45 ° vinkel til kraniet. Begynd boring, og holde boringen, indtil kraniet viger. Når kraniet giver måde, kan et fald i modstanden detekteres. Pas på ikke at bore ind i hjernen, således at forhindre cortical beskadigelse.
5. Tag en steril vatpind og tørre væk enhver blod fra hullet.
6. Sænk sprøjten, således at spidsen sidder på overfladen af ​​hjernen (ikke kraniet). Sætte D / V koordinat (dybde) til 0. Sænk sprøjten til den ønskede dybde, baseret på hjerneatlas koordinater. For at nå den tandede gyrus, sæt D / V til -1,79 mm.
7. Start injektion med en hastighed på 0,2 ul / min. Vagt over for, at sprøjten ikke glider lavere end den ønskede dybde. Hvis dette sker, forsigtigt hæve sprøjten til den ønskede dybde igen.
8. Efter injektionen er færdig, skal du vente ca. 2 min til at sikre, at enhver resterende virus er blevet absorberet. Langsomt hæve sprøjten og bruge en vatpind for at fjerne enhver liquid fra injektionsstedet.
9. Gentag for den anden halvkugle.

2.5) suturering

1. Fjern den sterile sutur og nål ud af emballagen og greb nålen ved hjælp af nål indehavere. Face den spidse kant af nålen væk fra nåleholderen. Hold stump-end pincet i den ikke-dominerende hånd, og bruge det til at gribe huden på musen. Start med den dominerende hånd.
2. Skub forsigtigt suturen gennem huden og bruge stumpendet pincet til at få huden på den anden side af snittet. Træk suturmaterialet igennem indtil ca. 0,75 inch tilbage.
3. Give slip på nålen, og brug stumpendet pincet til at vikle suturen omkring nåleholderen én gang, derefter, tag fat i 0,75 tommer resterende sutur med nåleholderen, og træk suturen igennem, således at nålen og nålen indehaveren ender på den side af hovedet modsat den, som de var på oprindeligt. Dette skulle danne en knude.
4. Gentag dette trinyderligere tre gange, skiftevis den side af hovedet nåleholderen ender på hver gang.
5. Skær suturen og gentage trin 2.5.1-2.5.3 indtil snittet lukkes.

2.6) Postoperativ pleje

1. Fjern forsigtigt øre stænger fra musen, og fjern dens kæbe fra den forreste klemme.
2. Hold musen på varmepuden indtil det vågner op og bevæger sig rundt på egen hånd. Overvåg musen dagligt, og holde og øje for tegn på smerte, såsom ikke grooming, spise eller drikke. Give yderligere smertestillende når det skønnes nødvendigt.

3. Åbn Field Test

3.1) Opsætning

1. Anskaf en tom firkant, plast arena med dimensioner 50 cm x 50 cm, med 50 cm høje mure (men kan være lidt større). Rengør arenaen med 70% ethylalkohol før begyndelsen af ​​forsøget. Sørg for, at ethylalkohol er helt tørt, før du placerer en mus ind i arenaen.
2. Placer arena pågulvet, og forsøge at sikre belysningen er indstillet til at minimere skygger og blænding.
3. Hvis du bruger tracking software, placere kameraet direkte overhead for åben mark, ca. 1,5 ft over åben mark (langt nok væk til fuld omfatte hele arena, men tæt nok til at have et klart billede af musen).
4. Oprette en zone i midten af boksen (ca. et område på 30 cm x 30 cm). ^16. For at indstille en zone, skal du klikke på fanen i sidepanelet zone 1.
   1. Vælg en form kontur i det øverste panel, og skitsere omkredsen af ​​midterzonen. Vælg tilføje zone, og klik på indersiden af ​​center zone. Brug af programmet prompter, navngive zone (dette vil blive benævnt "centret" for denne procedure). Hvis adfærdsmæssige test vil blive scoret med hånden, skal du sørge for bunden af ​​feltet er opdelt i 10 cm x 10 cm firkanter, mærket ved hjælp af tape.
5. Opsætning af software, så indstillingerne er korrekte, og musen er let visible på skærmen. Opnå dette ved at justere indstillingerne afsløring på maskinen til at være kompatible med test arena (belysning) og mus farve.
   BEMÆRK: Når indstillingerne er korrekte, skal systemet spore kun musen, og ikke nogen skygger eller urin / afføring. De specifikke software-indstillinger afhænger af belysningen af ​​arenaen, og farven på musen.

3.2) akklimatisering og test

1. Flyt eksperimentelle mus ind i det adfærdsmæssige rum 1 time før testen for at akklimatisere dem til deres omgivelser. Lad musene i deres bur for akklimatisering.
2. Tænd kameraet til bånd adfærdsmæssige opgave og placere musen mod midten foran Arenaen, så musen mod væggen.
3. Indstil timeren i 5 min, og skridt væk fra arenaen. Hvis det er muligt, forlade lokalet, således at der ikke ved et uheld at påvirke musen.
4. Når 5 min er op, fjerne musen og placere dem i deres bur.
5. Brug 70% ethylalkohol til grundigt at rense ud marken før du fortsætter til næste mus. Sørg for, at ethylalkohol er helt tørt.

3.3) Scoring

1. Betragt musen som værende i midten af ​​feltet, når alle fire poter er inde midten 30 cm x 30 cm.
2. Kvantificere mængden af ​​tid musen tilbringer i midten. Alternativt, fastlægge denne gang ved hjælp af tracking software (såsom Noldus ethovison).
   1. For at gøre dette, skal du gå til fanen analyse, og klik på "bevægelse" under analyse profiler. Slet kategorierne øjeblikket fastsat, og vælg derefter "i område" under fanebladet placering. Vælge det midterste zone. Dernæst skal du vælge "analyse output" (under fanen resultater) for at se resultater. En tabel notering den tid immobile for hvert forsøg skal vises.
3. Ellers score OFT i hånden. Åben mark skal have 25 10 cm x 10 cm kvadrater skitseret på bunden af ​​OPEn felt (som skitseret i trin 3.1.3). Kvantificere mængden af tid musen tilbringer i centrum, ud over antallet af indgange ind i midten af arenaen. ¹⁶
   BEMÆRK: I midten 30 cm x 30 cm område betragtes midten af ​​det åbne felt. En mus anses bebo centerområdet, hvis alle fire poter er inde i 30 x 30 cm område.

4. Tvungen Swim Test

BEMÆRK: Lad mindst fem dage mellem adfærdsmæssige opgaver.

4.1) Opsætning

1. Anskaf en 2 L klar spand, og fyld med 22 ° C vand. Placer spanden på et bord, og forsøge at sikre belysningen er indstillet til at minimere skygger og blænding.
2. Hvis du bruger tracking software, placere kameraet direkte overhead af spanden.
3. Opsæt software, så musen er let synlige på skærmen.

4.2) akklimatisering og test

1. Flyt eksperimentel mus ind i det adfærdsmæssige roabout 1 time før testen at akklimatisere omgivelserne. Lad musene i deres bur for akklimatisering.
2. Tænd kameraet til bånd det adfærdsmæssige opgave. Forsigtigt placere musen i midten af ​​spand vand. Sørg for ikke at tabe med musen i. Sænk langsomt musen, så de forreste fødder rører vandet først. Vær omhyggelig med at forhindre deres hoved fra nedsænkning.
3. Indstil timeren i 6 min, og skridt væk fra adfærdsmæssige område.
4. Når 6 minutter er gået, fjerne musen fra spanden, og tør overskydende vand før placere musen tilbage i deres bur.

4.3) Scoring

1. Hvis du bruger tracking software, sæt procent immobilitet til 11%, som foreslået af Noldus (dette bør være standardindstillingen), at kvantificere tid flydende vs. svømning.
2. For at kvantificere bruge tracking system, gå til fanen analyse, og klik på bevægelse under analyse profiler. Slet kategorierne øjeblikket fastsat, og vælg derefter mobilitet tilstand påden venstre sideplade (under individuel adfærd). Sæt immobilitet til 11%.
3. Vælge spor visualisering, under fanen resultater. Vælg analyse output (under fanen resultater) for at se resultater. En tabel notering den tid immobile for hvert forsøg skal vises.
4. Hvis hånden scoring, måle tiden musen tilbringer svømme eller klatre, og mængden af ​​tid musen tilbringer immobile. Desuden måle latensen til første gang immobile. Se figur 2 i Resultater afsnit.

Representative Results

Nøjagtig stereotaktisk injektion stærkt afhængig indstille de korrekte koordinater. Spidsen af nålen anvendes til at injicere virussen bør indstilles direkte på skæringspunktet mellem bregma og den interaurale linje (figur 1). Det er nyttigt at bruge et stereomikroskop at fastslå, om nålen er placeret korrekt. Ses gennem mikroskopet skal nålen være placeret således, at hvis virus blev injiceret, ville det lander direkte på skæringspunktet mellem bregma og den interaurale linje. Det vil sige, åbningen i kanylen skal placeres direkte over krydset. I denne undersøgelse et lentivirus udtrykker shRNA mod RBM8a, en kerne faktor i exon junction komplekset, blev injiceret i gyrus dentatus. Lentivirus udtrykker også RFP at mærke inficerede neuroner. Figur 2 viser, at virus blev injiceret i den korrekte region som angivet af den røde signal (figur 3).

_content "> For at opnå betydning i adfærdsmæssige opgaver bør prøven størrelse spænder fra 12 til 15 mus per gruppe. kan gennemføres Adfærdsmæssige opgaver to uger efter, stereotaktiske injektioner. I OFT, en ængstelig fænotype er til stede, hvis mus bruger betydeligt mindre tid på midten af det åbne område i sammenligning med kontrolgruppen. Resultaterne viser, at Knockdown af RBM8a i gyrus dentatus fra voksne mus fører til ivrige adfærd (p <0,05, figur 4). I FST, var der ingen observerbar forskel i immobilitet mellem kontrol og eksperimentelle mus, hvilket antyder, at RBM8a knockdown i den tandede gyrus ikke påvirker anti-depressiv adfærd (Figur 5). Statistisk analyse bestod af at udføre en to-halet, to prøve-ulige varians t-test.

Figur 1: Skæringspunktet Bregma og Interfonetisk Line. For stereotaktiske injektioner bør sprøjtenålen være foret med skæringspunktet mellem bregma og den interaurale linje. Dette punkt er sat til nul.

Figur 2: Skematisk illustrerer Tidslinje for Hele Experiment.

Figur 3: Repræsentativ hjerne skive illustrerer vellykket injektion af virus ind i gyrus dentatus Målestokken = 100 um..

Figur 4: Den tid, der styrer og Eksperimentelle mus brugt i centrum af en Novel Open Field Eksperimentelle mus tilbringer bety.icantly mindre tid i midten af arenaen, hvilket indikerer en ivrig fænotype (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, mean ± SEM)

Figur 5:. Den tid, der styrer og Eksperimentel Mus er immobile i FST Eksperimentelle mus afviger ikke fra kontrol i tid brugt immobile (N = 9-11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, middelværdi SEM)

Discussion

Vellykket stereotaktiske injektioner afhængige af tre faktorer: at holde musen i live, indstilling af korrekt nulpunkt for koordinaterne (spidsen af ​​nålen på skæringspunktet mellem bregma og interaurale linje), og indstilling den rigtige dybde til nulpunktet (spidsen af ​​nålen netop rører det ydre af hjernevæv). Levedygtigheden af ​​mus er vigtig. Kirurgi overlevelse kan blive hjulpet ved at sikre, at musen er korrekt bedøvet og modtager tilstrækkelig smertestillende. Smerte er kendt for at være en væsentlig årsag til dårlig genopretning efter kirurgi. Sikring af, at musen er fuldt bedøvet hele operationen (det bør ikke reagere på fod pinches), og give den korrekte dosis af analgetikum (baseret på vægten af musen), skal hjælpe overlevelse. ¹⁷ Desuden bør musen holdes på en varmepude under hele operationen processen, indtil den vågner op fra bedøvelsen. Mus kan ikke regulere deres kropstemperatur, når de bedøves. Deres krop temperamentratur vil falde markant under operationen processen. Selv om længden af ​​stereotaktisk kirurgi er forholdsvis kort, kunne hypotermi alvorligt forringe muse overlevelse. Korrekt suturering teknik er også medvirkende til at gennemføre en vellykket operation. Mus vil forsøge at hente på deres suturer, så det er afgørende at sikre, at suturerne er stramme nok til at forhindre fjernelse, men ikke for stramt, da at lægge for meget spænding på såret. Fire knob i hvert sting bør sikre, at musen ikke er i stand til at fjerne sutur. Korrekt suturering er vigtigt som et åbent sår vil øge modtageligheden for infektioner, som ville indvirke negativt på nogen adfærdsmæssige eksperimenter.

OFT er en adfærdsmæssig paradigme designet til at vurdere bevægelse og den ængstelige fænotype i mus. Ved test mus adfærd, er det vigtigt at være meget forsigtig, når du håndterer musene og opsætning af arenaen. I OFT, er paradigmet designet til at parre musens ængstelse when placeres i et nyt miljø, med sin naturlige nysgerrighed og lyst til at udforske nyhed. En vildtype mus vil i første omgang være tilbageholdende med at gå ind i midten af ​​det åbne område, hvor det er mere sårbare, men i sidste ende vil gøre det, på grund af sin medfødte nysgerrighed. I en ivrig mus, vil frygt for at krydse en mere sårbar rum (midten af ​​marken) være større end deres naturlige nysgerrighed og lyst til at udforske, hvilket vil resultere i betydeligt mindre tid i midten. For at sikre at paradigme fungerer korrekt, er det vigtigt at minimere stress i forbindelse med de andre end det åbne felt faktorer. Stress kan minimeres ved at tillade musen til at akklimatisere sig til den adfærdsmæssige rum (så det ydre miljø ikke er en mulig confounding variabel), og rengøring ud feltet mellem mus, at sikre enhver lugt forbundet med den foregående mus er blevet fjernet. ¹⁸ Disse skridt bør hjælpe eliminere eventuelle forskelle, der er forårsaget af forkert handling mus. I denne undersøgelse RBM8a Knockdown mus tilbragte signifikant mindre tid i centrum af en hidtil ukendt åben mark, sammenlignet med kontroller. Dette er tegn på en ængstelig fænotype, da mus er mere tilbageholdende med at gå ind i midten af ​​romanen åben mark, hvor de er mere sårbare, sammenlignet med kontrolgruppen.

FST søger at undersøge den anti-depressive fænotype i mus. Når de placeres i en spand vand, mus, der bruger væsentligt mindre tid flyder versus svømning anses for at have en anti-depressiv fænotype. Immobilitet i den tvungne svømme test fortolkes som adfærdsmæssige fortvivlelse (f.eks opgiver). Dette paradigme er valideret af antidepressiv behandling. ^7,8,9 Mus, som modtager anti-depressive lægemidler vil markant mindre flydende sammenlignet med kontroller, hvilket er indikativt for et anti-depressiv fænotype. I denne undersøgelse havde RBM8a knockdown mus ikke afvige væsentligt fra kontrolmus i tidsforbrug immobile. This indikerer, at RBM8a knockdown i gyrus dentatus fra voksne mus ikke udløser en depressiv eller anti-depressiv fænotype. I vores tidligere undersøgelse, RBM8a overekspression i gyrus dentatus fra voksne mus signifikant nedsætter tid immobile sammenlignet med kontroller, hvilket indikerer en anti-depressiv virkning. ¹⁶

De stereotaktiske injektioner anvendes til repræsentation i dette papir var rettet til den tandede gyrus. Den tandede gyrus blev valgt som målstedet, idet genet af interesse udtrykkes kraftigt der i den voksne mus. Desuden har den tandede gyrus blevet forbundet med depression og angst. For eksempel er en undersøgelse anvendte POMC-CHR2-mus til selektivt aktiverer de granulerede celler i enten den dorsale eller ventrale gyrus dentatus. Aktivering af både den dorsale og ventrale gyrus dentatus medført øget udforskning af et hidtil ukendt miljø, hvilket indikerer en mulig rolle af gyrus dentatus i angst. ¹⁹ En anden undersøgelsefandt, at mus med nedsat neurogenese var steget ubevægelighed i FST, hvilket indikerer en depressiv fænotype. ²⁰ Endvidere aktivering af Ap oa ₁ i forhjernen fører til en anti-depressiv virkning i FST, nyhedsværdi undertrykt fodring og saccharose forbrug test. Når VEGF blev slået ned i gyrus dentatus fra Ap oa _1, var dette anti-depressiv fænotype tabt. ²¹ Disse data antyder, at den tandede gyrus har en rolle i patofysiologien af angst og depression, og indikerede, at den tandede gyrus, kan være et godt område til at målrette for vores genetiske modulation og adfærdsmæssige eksperimenter. En lentivirus blev anvendt specifikt, således at alle celler i den tandede gyrus ville blive inficeret, i modsætning til kun delende celler (retrovirus).

En kombination af disse tre eksperimentelle design (i tillæg til andre adfærdsmæssige opgaver) er en hidtil ukendt måde at vurdere adfærdsmæssige fænotyper i mus, da en virus kan injiceres i en specific hjerne område på bestemte udviklingsmæssige tidspunkter. Ved hjælp stereotaktiske injektioner af et lentivirus parret med adfærdsmæssige opgaver tager kun et par måneder til at færdiggøre og tillader forskerne at indsamle foreløbige data på de adfærdsmæssige effekter af genekspression i et bestemt hjerne område. I modsætning hertil betingede knockout-mus ofte tage år at generere. Desuden kan celletype præference for vira anvendes til yderligere målceller. For eksempel kan retrovira kun inficere delende celler (såsom neurale stamceller i gyrus dentatus) en lentivirus inficerer alle celletyper. ^22,23 således sammen med co-injektion, disse udbredte og individuelt validerede eksperimentelle protokoller giver et hurtigt men omfattende måde at teste rollen som specifikt gen i en målrettet hjerne område på muse adfærd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder