Stereotaktisk injektion af lentivirus udtrykke cDNA eller shRNAs kan modulere genekspression i bestemte områder i hjernen af mus. Her præsenterer vi en protokol til at kombinere stereotaktiske injektioner med adfærdsmæssige opgaver, såsom Open Field Test (OFT), og den Forced Swim Test (FST).
Stereotaktisk injektion er en nyttig teknik til at levere høj titer lentivira til målrettede hjerneområder hos mus. Lentivirus kan enten overudtrykke eller Knockdown genekspression i et relativt fokuseret regionen uden betydelig skade på hjernevæv. Efter inddrivelsen, kan den injicerede mus testes på forskellige adfærdsmæssige opgaver såsom Open Field Test (OFT), og den Forced Swim Test (FST). OFT er designet til at vurdere bevægelse og den ængstelige fænotype i mus ved at måle mængden af tid, som en mus tilbringer i centrum af en hidtil ukendt åben mark. En mere ængstelig mus vil bruge betydeligt mindre tid i midten af romanen felt sammenlignet med kontroller. FST vurderer anti-depressive fænotype ved at kvantificere mængden af tid, at mus tilbringer immobile når den placeres i en spand vand. En mus med et anti-depressiv fænotype vil markant mindre immobile sammenlignet med kontroldyr. Målet med denne protokol er at bruge stereotactic injektion af en lentivirus i forbindelse med adfærdsmæssige test for at vurdere, hvordan genetiske faktorer modulere dyr adfærd.
Musen har været meget anvendt inden for neurobiologi, fordi det er let at manipulere genetisk. Gene knockout teknikker gør det muligt for forskerne at undersøge, hvordan de enkelte genetiske faktor former mus adfærd. Desuden cre-loxP system giver et værdifuldt redskab til vævs- og celle type- specifikt gen knockout i mus, som gør det muligt for forskerne at studere genfunktion i forskellige væv. 1 I praksis, er vanskelige at kontrol ekspressionsmønstre for CRE promotorer , og indtil videre mange etablerede CRE bilister har ikke opnået region-specifikke udtryk. 2,3
Alternativt stereotaktisk injektion er en metode, der er rettet mod specifikke hjerneregioner hos den voksne mus. Ved injektion af genetisk manipulerede vira, der udtrykker cDNA eller shRNA, kan region-specifik modulering af genekspression opnås. Selvom hjernen størrelsen af hver mus varierer, kan placeringen af specifikke hjerneregioner bestemmes under anvendelse stereotaktisk samordningnater sæt fra landmærker på kraniet af muse hjerne. De mest almindeligt anvendte landmærker er bregma, lambda, og den interaurale linje. Ved hjælp af koordinater opnået fra en hjerneatlas, kan 4 den nøjagtige placering af hver hjerne område identificeres ved antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), og dorsal-ventral (D / V) akser fra bregma / interaurale linje skæringspunkt. Typisk vira injiceres ind i hjernen på mus er mærket med enten røde eller grønt fluorescerende protein (RFP eller GFP), således at injektioner kan bekræftes ved fluorescerende mikroskopi.
Adfærdsmæssige vurderinger af mus er særligt nødvendige for grundforskning af psykiatriske lidelser. Symptomer på psykiatriske lidelser hos patienter typisk involverer unormal adfærd. Nogle af disse humane adfærd er evolutionært bevaret og kan direkte efterlignes og observeret i mus. For eksempel kan depression modelleres i musen ved at måle adfærdsmæssige fortvivlelse. Mennesker med depression OFTen føler som om intet de gør nogensinde vil hjælpe, et symptom, der i sidste ende kan føre til selvmord. I gnavere kan dette modelleres ved hjælp af den Forced Swim Test (FST), som måler den tid en mus svømning versus flydende i en pulje af vand (set som at give op). Dette paradigme er valideret ved at redde fænotypen med anti-depressiva. 7,8,9 Mus, som har modtaget anti-depressiva vil markant mindre immobile sammenlignet med ubehandlede kontroller. En anden adfærdsmæssige test, Open Field Test (OFT) er designet til at vurdere bevægelse i mus, og derudover kan bruges til at analysere den ængstelige fænotype i mus. 5,6 Denne test er baseret på den forudsætning, at mus føle sig sikrere, når de er tæt til væggen i en hidtil ukendt åben mark. Vildtypemus sidste ende vil undersøge det hidtil ukendte miljø, som de er nysgerrige dyr. Dog bruger mindre tid i midten af feltet angiver angst hos mus, når musen ikke vil være i stand til at overvinde den initial frygt forårsaget af en roman miljø. Angst for musen, som kvantificeret ved mængden af tid brugt i midten af et åbent felt, kan sammenlignes med klinisk angst hos mennesker, som er til stede i mange psykiatriske lidelser.
Kombinationen af stereotaktiske injektioner med adfærdsmæssige paradigmer er en ny måde at ændre ekspressionen af et specifikt gen i en målrettet hjerneområde. Virkningen af modulerede genekspression på musen adfærd kan derefter bestemmes. I modsætning til hele hjernen knockout, denne metode er særlig nyttig, da den kun er rettet mod bestemte områder i hjernen. Desuden er stereotaktiske injektioner udføres typisk i den voksne vildtype mus derfor endogent gen ekspression er blevet opretholdt gennem udviklingsstadier. Denne metode vil undgå forvirre virkning, hvis genet er nødvendig for overlevelse under den embryonale eller postnatal udviklingstrin. En væsentlig begrænsning er, at de eksperimentelle mus skal gå through en invasiv kirurgi, hvor kranierne på mus skal åbnes. Desuden er graden af genet modulation bestemmes af titer og effektivitet af virus. Virussen skal injiceres ind i den korrekte region ved anvendelse stereotaktiske koordinater, som kræver specielle instrumenter. Kontrol af korrekt injektionsstedet kan kun udfyldes post mortem.
Denne metode er tidligere blevet anvendt til at teste inddragelse af et specifikt gen i forskellige neurologiske sygdomme. For eksempel viral medieret RNAi målretning Th-genet (som tillader dopamin, der skal syntetiseres) blev injiceret i substantia nigra compacta, og lokomotorisk adfærd analyse blev udført. 10 En anden undersøgelse anvendte stereotaktisk injektion af et lentivirus silencing DISC1 at vurdere museadfærd i forhold til skizofreni. Knockdown af DISC1 førte til øget bevægelse som reaktion på nyheden (paralleller positive symptomer i skizofreni), og større immobilitet iFST. 11 Ligeledes en ekstra undersøgelse viste, at 5-HT 1B overekspression ført til øget udforskende adfærd i OFT, i overensstemmelse med en anti-angst fænotype ved hjælp af denne metode. 12 stereotaktiske injektioner kan levere cre virus til at inducere rekombination i cre-loxP mus . Denne fremgangsmåde blev anvendt til selektivt at slette Y2 receptoren i amygdala og sengen kerne af stria terminalis. Ved adfærdsmæssige analyse blev disse mus fundet at en anti-depressiv fænotype når genet blev slettet i den centrale amygdala, men ingen fænotype når genet blev slettet i den basolaterale amygdala eller sengen kernen i stria terminalis. 13. Således denne teknik giver et unikt værktøj til at studere den genetiske effekt på dyr adfærd.
Vellykket stereotaktiske injektioner afhængige af tre faktorer: at holde musen i live, indstilling af korrekt nulpunkt for koordinaterne (spidsen af nålen på skæringspunktet mellem bregma og interaurale linje), og indstilling den rigtige dybde til nulpunktet (spidsen af nålen netop rører det ydre af hjernevæv). Levedygtigheden af mus er vigtig. Kirurgi overlevelse kan blive hjulpet ved at sikre, at musen er korrekt bedøvet og modtager tilstrækkelig smertestillende. Smerte er kendt for at være…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Stereotactic Apparatus item 51725 | Stoelting co. | 51725 | |
Quintessential stereotaxic pump | Stoelting co. | 53311 | |
Injection Styringe, 65 RN | Hamilton | 7633-01 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
PEI | Polysciences Inc. | 23966 | |
Scissors | Fine Surgical Tools | 14084-08 | |
Blunt end forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
Needle holder | Fine Surgical Tools | 12001-13 | |
Drill | Ram Products Inc | Microtorque control box, Tech2000 handpiece | with pedal |
Glass bead sterilizer | Inotech | IS-400 | |
Absorbable sutures | Unify | M-K518r19 | Absorbable, reverse cutting |
Cotton swabs | VWR | 89031-270 | |
Heating pad | Gaymar | T-pump TP-500 PN11184-000 | |
Artificial tears | Rugby | NDC 0536-6550-91 | |
Disposable syringe | BD Syringe | 309623 | |
Cloth | |||
Gloves | Ansell | Senseitouch #7823 | |
Avertin or other anesthetic | see recipe citation | ||
Ketoprofen or other analgesic | see veternarian | ||
Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
Tracking Camera | Noldus | Media Recorder |