Påføring Stereotactic injeksjonsteknikk å studere genetiske effekter på dyreadferd

Summary

Stereotactic injeksjon av lentiviruses uttrykke cDNAs eller shRNAs kan modulere genuttrykk i bestemte hjerneområder mus. Her presenterer vi en protokoll for å kombinere stereotaktiske injeksjoner med atferds oppgaver, for eksempel Open Feltet Test (OFT) og Tvunget Swim Test (FST).

Abstract

Stereotaktisk injeksjon er en nyttig teknikk for å levere høy titer lentiviruses til målrettede hjerneområder hos mus. Lentiviruses kan enten overuttrykker eller knockdown genekspresjon i et relativt fokusert område uten vesentlig skade på hjernevevet. Etter utvinning, kan den injiserte mus testes på ulike atferdsmessige oppgaver som det åpne feltet Test (OFT) og Tvunget Swim Test (FST). Den ofte er konstruert for å vurdere bevegelse og engstelig fenotypen hos mus ved å måle hvor lang tid som en mus tilbringer i sentrum av en ny åpne feltet. En mer engstelig mus vil bruke betydelig mindre tid i sentrum av romanen feltet sammenlignet med kontroller. FST vurderer den anti-depressive fenotype ved å kvantifisere mengden av tid som mus tilbringer immobile når den er plassert i en bøtte med vann. En mus med en anti-depressiv fenotype vil bruke betydelig mindre tid immobile i forhold til kontrolldyrene. Målet med denne protokollen er å bruke stereotactic injeksjon av et lentivirus i forbindelse med atferdstester for å vurdere hvordan genetiske faktorer modulere dyreatferd.

Introduction

Musen har vært mye brukt i neurobiology fordi det er lett å manipulere genetisk. Gene knockout teknikker tillate forskere å undersøke hvordan hver genetisk faktor former muse atferd. Videre gir cre-loxP-systemet et verdifullt verktøy for vevs- og celletypespesifikke gen i knockout mus, noe som gjør det mulig for forskere å undersøke genfunksjon i forskjellige vev. ^1. Men i praksis, ekspresjonsmønster av Cre promotorer er vanskelige å kontrollere og så langt mange etablerte Cre-driverne er ikke oppnådd regionspesifikk uttrykk. ^2,3

Alternativt er stereotaktisk injeksjon en metode som er rettet mot bestemte områder av hjernen til den voksne mus. Ved å injisere genetisk modifiserte virus som uttrykker cDNA eller shRNA, kan oppnås regionspesifikke modulering av genekspresjon. Selv om hjerne størrelsen på hver mus varierer, kan plasseringen av bestemte områder av hjernen bestemmes ved anvendelse av stereotaktisk koordineringNates satt fra landemerker på skallen av musen hjernen. De mest brukte landemerker er bregma, lambda, og interaural linje. Ved hjelp av koordinater hentet fra en hjerne atlas, kan ⁴ den nøyaktige plasseringen av hver hjerneområdet identifiseres av Antero-posterior (A / P), medial-lateral (M / L), og dorsal-ventral (D / V) økser fra bregma / interaural linje krysset. Vanligvis virus injisert inn i hjernen til mus er merket med enten rødt eller grønt fluorescerende protein (RFP eller GFP), slik at injeksjoner kan bekreftes av fluorescerende mikroskopi.

Behavioral vurderinger av mus er spesielt nødvendig for grunnleggende forskning av psykiatriske lidelser. Symptomer på psykiatriske lidelser hos pasienter vanligvis involverer unormal atferd. Noen av disse menneskelige atferd er evolusjonært konservert og kan være direkte etterlignet og observert hos mus. For eksempel kan depresjon være modellert i musen ved å måle atferdsfortvilelse. Mennesker med depresjon often føler som om ingenting de gjør noen gang vil hjelpe, et symptom som til slutt kan føre til selvmord. I gnagere, kan dette være modellert med Forced Swim Test (FST), som måler hvor lang tid en mus svømming versus flytende i et basseng med vann (sett på som å gi opp). Dette paradigmet er validert av redde fenotype med anti-depressiva. ^7,8,9 Mus som har fått antidepressiva vil bruke betydelig mindre tid immobile sammenlignet med ubehandlede kontroller. En annen adferdstest, det åpne feltet Test (OFT) er utviklet for å vurdere locomotion i mus, og i tillegg kan brukes til å analysere engstelig fenotype hos mus. ^5,6 Denne testen er basert på premisset om at musene føler seg tryggere når de er nær til veggen i en roman åpent felt. Villtype mus vil til slutt utforske det nye miljøet som de er nysgjerrige dyr. Imidlertid tilbringer mindre tid i midten av det felt indikerer angst hos mus, som mus ikke vil være i stand til å overvinne innledetl frykt brakt videre av en roman miljø. Angsten av musen, som kvantifiseres ved hvor mye tid tilbrakt i sentrum av et åpent felt, kan sammenlignes med klinisk angst hos mennesker, som er til stede i mange psykiatriske lidelser.

Kombinasjonen av stereotaktisk injeksjon med atferds paradigmer er en ny måte å endre ekspresjonen av et spesifikt gen i et målrettet hjerneområde. Effekten av modulert genekspresjon på mus oppførsel kan deretter bestemmes. I motsetning til hele hjernen knockout Denne metode er spesielt nyttig da det bare er rettet mot spesifikke hjerneområder. I tillegg er stereotaktisk injeksjon typisk utført i voksen villtype mus derfor endogene gen-ekspresjon har blitt opprettholdt gjennom hele utviklingsstadier. Denne metoden vil unngå forvirre virkning hvis genet er nødvendig for å overleve under embryonisk eller postnatal utviklingstrinn. En viktig begrensning er at de eksperimentelle mus trenger å gå through en invasiv kirurgi, der skallen på mus må åpnes. Dessuten er graden av genet modulering bestemt av titer og effektiviteten av viruset. Viruset må injiseres inn i det riktige området ved hjelp av stereotaktisk koordinater, noe som krever spesielle instrumenter. Verifikasjon av riktig injeksjonsstedet kan bare gjennomføres post mortem.

Denne fremgangsmåte er tidligere blitt brukt til å teste involvering av et bestemt gen i forskjellige neurologiske sykdommer. For eksempel, virale mediert RNAi rettet mot Th-genet (som lar dopamin som syntetiserte) ble injisert i substantia nigra compacta og bevegelsesatferd analyse ble utført. ¹⁰ En annen studie benyttet stereotaktisk injeksjon av et lentivirus lyddemping DISC1 å vurdere mus atferd i forhold til schizofreni. Knockdown av DISC1 ført til økt bevegelse i respons til nyhet (paralleller positive symptomer ved schizofreni), og større immobilitet iFST. ¹¹ Tilsvarende ytterligere studie fant at 5-HT _1B overekspresjon ført til økt utforskende atferd i OFT, i samsvar med en anti-angst fenotype ved hjelp av denne metoden. ¹² Stereo injeksjoner kan levere cre virus å indusere rekombinasjon i CRE-loxP mus . Denne metoden ble benyttet for selektivt å slette Y2-reseptoren i mandelen og sengen kjernen av stria termin. Ved adferdsanalysen, ble disse musene syntes et anti-depressive fenotype når genet ble slettet i den sentrale amygdala, men ingen fenotype når genet ble fjernet i basolaterale amygdala eller sengen kjernen av stria termin. ¹³ Således, denne teknikken gir et unikt verktøy for å studere den genetiske effekt på dyreatferd.

Protocol

MERK: Alle protokoller som involverer dyr ble fulgt i samsvar med retningslinjene i The Pennsylvania State University dyr omsorg, IACUC # 44057

1. Lentivirus Produksjon

MERK: Dagen før transfeksjon, bør LentiX-293 celler være på 80% confluency.

1. Rens cellene med DMEM rett før transfeksjon og inkuberes i 10 ml DMEM / 10% FBS med penicillin (100 IU / ml) og streptomycin (100 ug / ml) i 5 min ved RT.
2. Fortynn DNA og polyetylenimin (PEI) (1 mg / ml) i 1: 3 forhold (1 pg av DNA: 3 ul av PEI) i 1 ml DMEM og virvle i 1 min. Volumet av DNA som tilsettes er avhengig av konsentrasjonen av DNA. Inkuber ved RT i 10 min.
   1. For eksempel bruke 20 mikrogram av DNA plasmid, som består av 10 ug vektorplasmidet, 5 mikrogram psPax2 ¹⁴ plasmid, 5 mikrogram av vesikulær stomatitt virus (VSV) med 60 mL av PEI per tallerken.
3. Tilsett 1/10-volum av det totale dyrkningsmedium av DMEM (dvs. 1 ml til 10 ml kulturmedium i en 100 mm skål). Tilsett 1 ml DNA-PEI blanding dråpevis i formen og virvle rundt til fatet til kulturmediet er godt blandet med DNA.
4. Inkuber i 6 timer ved romtemperatur og fjern supernatanten. Tilsett 5 ml av kulturmediet.
5. 48 timer etter transfeksjon, samle virale supernatanten og sentrifugering ved 627 xg i 5 minutter ved 4 ° C i et 50 ml rør. Filtrer 30 ml viral supernatant gjennom et 0,45 um sprøytefilter inn i et ultrasentrifugerør.
6. Legg sterilt vann for å balansere rørene, og omfatter rør med lite stykke parafilm. Spin-rør på 11 249 xg for 120 min ved 4 ° C. Fjern væsken ved hjelp av et vakuum tips.
7. Tilsett 100 ul kald PBS røret. Rist røret ved 4 ° CO / N.
8. Å re-suspen viruset, pipette than PBS tilsatt i trinn 1.8 over pellets 10 ganger, være forsiktig med å berøre pellet med spissen. Pelleten vil ikke bli gjen suspendert inntil dette er fullført.
9. Delmengde viruset på 10-20 mikroliter per rør, flash-fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.

2. Stereotactic Injection

2.1) Fremstilling av Instruments

1. Plasser en saks, butt-end tang, en nål holder, skalpell, bomullspinner, og en klut i en forseglet pakke med en sterilisering indikator, og autoklav før operasjonen. I tillegg får 10% povidon jod, 70% etylalkohol, absorberbare suturer, en varmepute, kunstige tårer, et glass perle sterilisator, drill, en borekrone, to engangssprøyter, en injeksjonssprøyte, elektrisk barberhøvel, analgetisk (ketoprofen), bedøvelse (avertin), hansker, og en stereotaktisk apparat med injeksjonspumpe.
2. Gjør 1,25% avertin løsning frisk den dagen, filter i en steril hetten med en 0,2-# 181; m steril sprøyte filter, og plasser i en steril serum hetteglass. Bland 2,5 g 2,2,2-tribrometyl alkohol i 5 ml tert-amylalkohol, oppløses deretter i 200 ml vann. Hold pH under 5. ¹⁵

2.2) Utarbeidelse av Mouse

1. Administrere Avertin, basert på vekten av mus (375 mg / kg). ¹⁵ Injiser mus med avertin via en intraperitoneal (IP) injeksjon, og deretter plassere tilbake i buret til den er helt bedøvet.
2. Gi et analgetikum via IP injeksjon (ketaprofen, 5 mg / kg), og stedet kunstige tårer på øynene av musen for å hindre uttørking.
3. Sørg for at musen er fullt sover ved å knipe sin fot. Hvis musen svarer til foten klemme, da gi mer bedøvelse (i doser på 50 ul). Barbere hodet av musen med en elektrisk barbermaskin. Barbere området som skal opereres på (typisk fra like bak ørene, til toppen av snuten), og det omkringliggende området.
4. Plasser musen inFor stereotaktisk apparat. Klinke fortennene på fremre klemmen, og senk klemmen og stram den slik at kjeven er helt sikker.
5. Sett øret barene inn i ørekanalen å fullt stabilisere hodet. Vær forsiktig med å sette øret barer for langt inn, som kan skade det indre øret. Når ferdig, bør hoveddelen av mus være i stand til å bli flyttet noe uten å forstyrre stillingen av hodet.
6. Plasser en varmepute under musen for å regulere musekroppstemperatur gjennom hele prosedyren.
7. Rengjør kirurgiske området grundig. Ved hjelp av en bomullspinne, gni 10% povidonjodid i en sirkulær bevegelse, fra midten av det kirurgiske området og bevege seg utover. Deretter bruker du en bomullspinne for å gni 70% etylalkohol på operasjonsstedet på samme måte. Gjenta to ganger.

2.3) The First Incisjon

1. Når musen er preparert, åpner sterilt utstyr bag. Skift hansker før touching instrumentene. Ta ut steril klut og plassere instrumentene på duken. Hvis noen instrument berører en un-steril overflate, bruk glass perle sterilisator for 15 sek å sterilisere den.
2. Ta skalpell i de dominerende hånd og butt-end tang i den ikke-dominerende hånd. Bruk butt-end pinsett til å gripe forsiktig huden på mus, og gjør et snitt bruker skalpell. Begynn snitt ca 1,5 cm over ørene (mot nesen) og strekker seg til ca 0,5 cm under ørene. Utvid snittet vertikalt på midten av musen hode å eksponere bregma (figur 1).
3. Når bregma visualiseres, kan en steril bomullstupp for å forsiktig fjerne blod som dekker overflaten av skallen. Bruk to bomull tips for å skyve huden mot siden av hodet.

2.4) Setup Utstyr

1. Etter at noe blod er fjernet fra overflaten av skallen, og bregma er tydelig visualisert, forberede sprøyten (contrasjon på 10 ⁸ TU / ml, volumet av 1 ul). I avtrekksskap, fylle sprøyten med viruset som skal injiseres. Sørg for at ingen bobler er inne. Plasser sprøyten i stereotaktisk apparat, noe som gjør at det er fullt sikret.
2. Senk sprøyten til den er rett over overflaten av skallen, slik at spissen av den sterile sprøytespissen settes til skjæringspunktet for bregma og interaural linjen. Sett dette punktet som null, og bestemme koordinatene fra dette punktet.
3. Avhengig av hjernen område av interesse, varierer de stereotaktiske koordinater. Bestem koordinatene ved å benytte en ^4-hjerne atlas. Når koordinatene er bestemt, bevege nålen på sprøyten for å matche disse koordinatene. Målrette dentate gyrus ved hjelp av koordinater: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1,82 mm. Senk nålen til høyre over skallen til å visualisere hvor hullet må bores.
4. Hev sprøyten litt, ta drill og plassere bore bit rett over målet borestedet på ca 45 ° vinkel til skallen. Begynn boring, og holde boring inntil skallen gir etter. Når skallen gir måte, kan en nedgang i motstand bli oppdaget. Vær forsiktig med å bore inn i hjernen, slik som å hindre kortikal skade.
5. Ta en steril bomullstupp og tørk vekk blod fra hullet.
6. Senk sprøyten slik at spissen sitter rett på overflaten av hjernen (ikke skallen). Sett D / V-koordinat (dybde) til 0. nedre sprøyten til den ønskede dybde, basert på hjernen Atlas koordinater. For å komme til dentate gyrus, satt D / V til -1,79 mm.
7. Start injeksjon ved en hastighet på 0,2 ul / min. Se å sikre at sprøyten ikke glir lavere enn den ønskede dybde. Hvis dette skjer, forsiktig heve sprøyten til den ønskede dybde på nytt.
8. Etter injeksjonen er ferdig, vente ca 2 min for å sikre at eventuelle gjenværende virus har blitt absorbert. Sakte heve sprøyten og bruke en bomullspinne for å fjerne eventuelle lipund fra injeksjonsstedet.
9. Gjenta for den andre halvkule.

2.5) suturing

1. Fjern den sterile sutur og nål av pakken, og grep den nålen med holdere. Møte den spisse kanten av nålen vekk fra nålen holderen. Hold butt-end tang i den ikke-dominerende hånd, og bruke den til å gripe huden på mus. Start med den dominerende hånd.
2. Skyv sutur gjennom huden og bruke butt-end pinsett til å ta tak i huden på den andre siden av snittet. Trekk suturmateriale gjennom før ca 0,75 tommers gjenstår.
3. Slipp nålen, og bruke butt-end pinsett til å vikle sutur rundt nålholderen én gang, da, ta tak i 0,75 tommers rester sutur med nål holder, og trekk sutur gjennom, slik at nålen og nålholderen ender opp på siden av hodet motsatt til det som de var på opprinnelig. Dette bør danne en knute.
4. Gjenta dette trinnettre ganger, vekslende på siden av hodet nåleholderen ender opp på hver gang.
5. Skjær sutur og gjenta trinn 2.5.1-2.5.3 før snittet er stengt.

2.6) Postoperativ Care

1. Forsiktig fjerne øret barer fra musen, og ta av kjeve fra fremre klemmen.
2. Hold musen på varmeputen før det våkner opp og beveger seg rundt på egen hånd. Overvåke mus daglig, og holde og øye for tegn til smerte, som ikke grooming, spise eller drikke. Gi ekstra smertestillende når det anses nødvendig.

3. Åpne Felt Test

3.1) Konfigurer

1. Skaff en tom rute, plast arena med dimensjoner 50 cm x 50 cm, med 50 cm høye vegger (men kan være litt større). Rens arena med 70% etylalkohol før begynnelsen av forsøket. Kontroller at etylalkohol er helt tørt før du legger en mus inn på arenaen.
2. Plasser arena påetasje, og prøve å sikre belysningen er satt for å redusere skygger og gjenskinn.
3. Hvis du bruker sporing av programvare, plasserer kameraet direkte overhead av det åpne feltet, ca 1,5 fot over marken (langt nok unna til full omfatte hele arenaen, men nær nok til å ha et klart syn på mus).
4. Sett opp en sone i sentrum av boksen (ca. et område på 30 cm x 30 cm). ¹⁶ Slik angir en sone, klikk på sone 1-fanen i sidepanelet.
   1. Velg en form omriss i det øvre felt, og skissere omkretsen av midtsonen. Velg legge sonen, og klikk på innsiden av senteret sonen. Ved hjelp av programmet ber, navnet sonen (dette vil bli referert til som "senter" for denne prosedyren). Dersom atferds test scores for hånd, sørg bunnen av feltet er delt inn i 10 cm x 10 cm kvadrater, merket med tape.
5. Sett opp programvaren slik at innstillingene er riktige, og musen er lett visigjengelig på skjermen. Oppnå dette ved å justere innstillingene gjenkjenning på maskinen for å være kompatibel med testarena (lys) og mus farge.
   MERK: Når innstillingene er riktige, skal systemet spore bare musen, og ingen skygger eller urin / avføring. De spesifikke programvareinnstillingene avhenger av belysningen av arenaen, og fargen på musen.

3.2) Akklimatisering og Test

1. Flytt eksperimentelle mus inn i atferds rom 1 time før testen for å akklimatisere dem til sine omgivelser. La musene i buret sitt for akklimatisering.
2. Slå på kameraet for å tape atferds oppgave og plasserer musen mot midten foran arenaen slik at musen er vendt mot veggen.
3. Sett timeren i 5 min, og gå bort fra arenaen. Hvis mulig, forlate rommet slik at det ikke tilfeldigvis påvirke musen.
4. Når fem minutter er opp, fjerne musen og plassere dem i buret sitt.
5. Bruk 70% etylalkohol å rengjøre ut feltet før du går videre til neste musen. Kontroller at etylalkohol er helt tørt.

3.3) Scoring

1. Betrakt mus som å være i midten av feltet når alle fire poter er inne i midten 30 cm x 30 cm.
2. Kvantifisere mengden av tiden musen bruker i midten. Alternativt bestemme denne gangen ved hjelp av sporing av programvare (for eksempel Noldus ethovison).
   1. For å gjøre dette, gå til kategorien analyse, og klikk på "bevegelse" under analyse profiler. Slett kategorier for tiden satt, og velg deretter "i sone" under fanen plassering. Velg midtsonen. Deretter velger du "analyse output" (under fanen resultater) for å se resultater. Tabell som viser tidsbruk immobile for hvert forsøk skal vises.
3. Ellers scorer OFT for hånd. Det åpne feltet bør ha 25 10 cm x 10 cm kvadrater skissert på bunnen av opeN felt (som beskrevet i trinn 3.1.3). Kvantifisere mengden av tiden musen bruker i sentrum, i tillegg til det antall poster inn i sentrum av arenaen. ¹⁶
   MERK: Senteret 30 cm x 30 cm område anses midten av det åpne feltet. En mus regnes som bebor sentrum regionen dersom alle fire poter er inne på 30 x 30 cm området.

4. Tvungen Swim Test

MERK: Tillat minimum fem dager mellom atferds oppgaver.

4.1) Konfigurer

1. Skaff en 2 L klart bøtte, og fyll med 22 ° C vann. Plasser bøtte på et bord, og prøve å sørge for belysningen er satt for å redusere skygger og gjenskinn.
2. Hvis du bruker sporing av programvare, plasserer kameraet direkte overhead av bøtta.
3. Sett opp programvare, slik at musen er lett synlig på skjermen.

4.2) Akklimatisering og Test

1. Flytt eksperimentell mus inn i atferds room en time før testen for å akklimatisere seg omgivelsene. La musene i buret sitt for akklimatisering.
2. Slå på kameraet for å tape de atferdsmessige oppgave. Forsiktig, plasserer du muse i midten av bøtte med vann. Pass på å ikke slippe musen i. Senk musen, slik at forsiden føttene berøre vannet først. Vær nøye med å hindre hodet fra nedsenke.
3. Sett timeren for 6 min, og gå bort fra atferds området.
4. Når 6 min er opp, fjerne musen fra bøtte, og tørk av overflødig vann før du plasserer muse tilbake i buret sitt.

4.3) Scoring

1. Hvis du bruker sporing, satt prosent immobilitet til 11%, som foreslått av Noldus (dette bør være standardinnstillingen), for å kvantifisere tid flytende vs. svømming.
2. Å kvantifisere bruke sporingssystem, gå til kategorien analyse, og klikk på bevegelse som analyseres profiler. Slett kategorier for tiden satt, og velg deretter mobilitet staten, påpanelet til venstre side (under individuell atferd). Satt immobilitet til 11%.
3. Velge spor visualisering, under fanen resultater. Velg analyse utgang (under fanen resultater) for å se resultater. Tabell som viser tidsbruk immobile for hvert forsøk skal vises.
4. Hvis hånden score, måle tiden musen bruker svømming eller klatring, og hvor lenge musen bruker immobile. I tillegg måle latensen til den første gangen immobile. Se figur 2 i Resultater seksjon.

Representative Results

Nøyaktig stereotaktisk injeksjon stoler tungt på å sette de riktige koordinatene. Tuppen av nålen brukes til å injisere viruset bør settes direkte på skjæringspunktet mellom bregma og interaural linjen (figur 1). Det er nyttig å bruke en stereomikroskop for å fastslå hvorvidt nålen er riktig plassert. Når man ser gjennom mikroskopet, skal kanylen plassert slik at hvis viruset ble injisert, vil det lande direkte på skjæringspunktet mellom bregma og interaural linjen. Det vil si at åpningen i sprøytespissen skal plasseres direkte over krysset. I denne studien ble en lentivirus uttrykker shRNA mot RBM8a, en kjerne faktor i exon junction-komplekset, ble injisert i dentate gyrus. Den uttrykker lentivirus også RFP å merke infiserte nerveceller. Figur 2 viser at viruset ble injisert inn i den riktige region som fremgår av den røde signal (figur 3).

_content "> For å oppnå betydning i atferds oppgaver, bør størrelsen på utvalget spenner 12-15 mus per gruppe. Behavioral oppgaver kan gjennomføres to uker etter stereotaktiske injeksjoner. I OFT, er en engstelig fenotype tilstede hvis mus bruker betydelig mindre tid på midten av det åpne feltet i forhold til kontrollgruppen. Resultatene indikerer at knockdown av RBM8a i dentate gyrus av voksen mus fører til urolige oppførsel (p <0,05, figur 4). I FST, var det ingen observerbar forskjell i immobilitet mellom kontrollen og eksperimentelle mus, tyder på at RBM8a knockdown i gyrus dentatus ikke påvirker anti-depressiv oppførsel (figur 5). Statistisk analyse besto av å utføre en to-halet to-prøve ulik varians t-test.

Figur 1: Skjærings av Bregma og Intergehør Line. For stereotaktiske injeksjoner, bør sprøytespissen være stilt opp med skjæringspunktet mellom bregma og interaural linje. Dette punktet er satt til null.

Figur 2: Skjematisk illustrerer Tidslinje for hele Experiment.

Figur 3: Representant hjernen skive illustrerer vellykket injeksjon av virus i dentate gyrus Målestokk = 100 mikrometer..

Figur 4: Tiden som kontroll- og eksperiment Mus Tilbrakte i sentrum av en Novel Åpne Feltet Eksperimentelle mus tilbringe signif.grad å mindre tid i sentrum av arenaen, noe som indikerer en engstelig fenotype (N = 9-11, *, T ₁₈ = -2,72, p <0,05, mener SEM)

Figur 5:. Tiden som kontroll og eksperimentell Mus er immobile i FST Eksperimentelle mus skiller seg ikke fra kontrollene i tid brukt immobile (N = 9-11, T ₁₈ = 1,25, p> 0,05, mener SEM)

Discussion

Vellykket stereotaktiske injeksjoner stole på tre faktorer: å holde musen i live, sette riktig nullpunktet for koordinatene (nålespissen på skjæringspunktet mellom bregma og interaural line), og sette riktig dybde til nullpunktet (tuppen av nålen bare berøre utsiden av hjernevev). Levedyktigheten til mus er viktig. Kirurgi overlevelse kan bli hjulpet ved å sørge for at musen er skikkelig bedøvet og får tilstrekkelig smertestillende. Smerte er kjent for å være en viktig årsak til dårlig restitusjon etter operasjonen. Å sikre at musen er fullstendig bedøvet hele operasjon (det bør ikke svare på foten klyper), og å gi den korrekte dosen av analgetikum (basert på vekten av musen), bør bidra til å overleve. ¹⁷ I tillegg bør mus holdes i en varmepute gjennom hele operasjonen prosessen til det våkner opp fra bedøvelsen. Mus kan ikke regulere kroppstemperaturen når de er bedøvet. Deres kropp temperamentature vil falle betydelig under operasjonen prosessen. Selv om lengden av stereotaktisk kirurgi er relativt kort, kan hypotermi alvorlig svekke mus overlevelse. Riktig suturering teknikken er også medvirkende i å gjennomføre en vellykket operasjon. Mus vil prøve å plukke på sine sting, så det er viktig å sørge for at suturene er stramt nok til å hindre fjerning, men ikke for stramt som å legge for mye spenning på såret. Fire knop i hver maske bør sikre at musen ikke er i stand til å fjerne sutur. Riktig suturering er viktig som et åpent sår vil øke mottakelighet for infeksjoner, noe som ville negativt påvirke eventuelle atferdseksperimenter.

OFT er et atferds paradigme for å vurdere bevegelse og engstelig fenotype hos mus. Når du skal teste musen atferd, er det viktig å være svært forsiktig ved håndtering av mus og sette opp arenaen. I OFT, er paradigmet utformet for å pare musens pågripelse when plassert i et nytt miljø, med sin naturlige nysgjerrighet og ønske om å utforske nyhet. En villtype mus vil i første omgang være redde for å gå inn i sentrum av det åpne feltet, hvor det er mer sårbar, men vil etter hvert gjøre det, på grunn av sin iboende nysgjerrighet. I en engstelig musen, vil pågripelse av krysset en mer sårbar plass (midt i feltet) være større enn deres naturlige nysgjerrighet og ønske om å utforske, noe som vil resultere i betydelig mindre tid brukt i sentrum. For å sikre at paradigmet fungerer riktig, er det viktig å minimere stress forbundet med de andre enn det åpne feltet faktorer. Stress kan bli minimalisert ved at musen for å akklimatisere seg til de atferdsmessige rom (slik det ytre miljøet er ikke en mulig forvirrer variabel), og rense ut feltet mellom mus, for å garantere at alle lukter i forbindelse med den foregående mus har blitt fjernet. ¹⁸ Disse trinnene bør bidra til å eliminere eventuelle forskjeller som skyldes feil håndtering fasiliteterng mus. I denne studien, RBM8a knockdown mus brukt betydelig mindre tid i midten av en ny åpent felt, sammenlignet med kontroller. Dette er en indikasjon på en engstelig fenotype, siden mus er mer motvillig til å gå inn i midten av den nye åpne feltet, hvor de er mer sårbare, sammenlignet med kontroller.

FST søker å undersøke anti-depressive fenotype hos mus. Når plassert i en bøtte med vann, blir musene som bruker betydelig mindre tid flyter versus svømme ansett for å ha en anti-depressive fenotype. Immobilitet i tvungen svømme test blir tolket som behavioral fortvilelse (f.eks gi opp). Dette paradigmet er validert av antidepressive behandling. ^7,8,9 Mus som får antidepressive legemidler vil bruke betydelig mindre tid flytende i forhold til kontroller, noe som er et tegn på en anti-depressive fenotype. I denne studien fant RBM8a knockdown mus ikke signifikant forskjellig fra kontroll mus i tid brukt immobile. This indikerer at RBM8a knockdown i dentate gyrus av voksne mus ikke fremkaller en depressiv, eller anti-depressive fenotype. I vår forrige undersøkelse, RBM8a overekspresjon i dentate gyrus av voksne mus betydelig redusert tid immobile sammenlignet med kontroller, noe som indikerer en anti-depressiv effekt. ¹⁶

Den stereotaktiske injeksjoner brukes til representasjon i denne artikkelen ble rettet mot dentate gyrus. Dentate gyrus ble valgt som mål-området, ettersom genet av interesse er sterkt uttrykt der i voksen mus. I tillegg har dentate gyrus blitt forbundet med depresjon og angst. For eksempel, en studie benyttet POMC-Chr2 mus for selektivt å aktivere granulene cellene i enten den dorsale eller ventrale dentate gyrus. Aktivering av både dorsale og ventrale dentate gyrus førte til økt utforskning av et nytt miljø, noe som indikerer en potensiell rolle dentate gyrus i angst. ¹⁹ En annen studiefunnet at mus med nedsatt nevrogenesen hadde økt immobilitet i FST, noe som indikerer en depressiv fenotype. ²⁰ Videre, aktivering av Ap OA ₁ i forhjernen fører til en anti-depressiv effekt i FST, nyhet trykkes foring, og sukrose forbruk test. Når VEGF var slått ned i dentate gyrus av Ap oa _1, ble denne anti-depressive fenotype tapt. ²¹ Disse data antyder at dentate gyrus har en rolle i patofysiologien av angst og depresjon, og indikerte at dentate gyrus kan bli et godt område å målrette for vår genetiske modulasjon og atferdsmessige eksperimenter. En lentivirus ble anvendt spesifikt, slik at alle cellene i gyrus dentatus ville bli infisert, i motsetning til bare delende celler (retrovirus).

En kombinasjon av disse tre eksperimentelle design (i tillegg til andre adferdsoppgaver) er en ny måte å vurdere atferdsmessige fenotyper i mus, ettersom et virus kan injiseres i en specific hjerneområdet på spesifikke utviklings ganger. Ved hjelp av stereotaktisk injeksjoner av et lentivirus paret med atferds oppgaver tar bare noen få måneder å fullføre og tillater forskere å samle foreløpige data på atferdsmessige effekter av genuttrykk i en bestemt hjerneområde. I motsetning til dette betingede knockout mus ofte ta flere år for å generere. Videre kan celletype preferanse av virus kan anvendes for ytterligere målceller. For eksempel, kan retrovirus bare infisere delende celler (slik som neural stamceller i gyrus dentatus), mens en lentivirus infiserer alle celletyper. ^22,23 således sammen med co-injeksjon, disse er mye brukt og er individuelt validerte eksperimentelle protokoller gi en rask men omfattende måte å teste rolle bestemt gen i en målrettet hjerneområde, på mus atferd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotactic Apparatus item 51725	Stoelting co.	51725
Quintessential stereotaxic pump	Stoelting co.	53311
Injection Styringe, 65 RN	Hamilton	7633-01
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
PEI	Polysciences Inc.	23966
Scissors	Fine Surgical Tools	14084-08
Blunt end forceps	Fine Surgical Tools	11002-12
Needle holder	Fine Surgical Tools	12001-13
Drill	Ram Products Inc	Microtorque control box, Tech2000 handpiece	with pedal
Glass bead sterilizer	Inotech	IS-400
Absorbable sutures	Unify	M-K518r19	Absorbable, reverse cutting
Cotton swabs	VWR	89031-270
Heating pad	Gaymar	T-pump TP-500 PN11184-000
Artificial tears	Rugby	NDC 0536-6550-91
Disposable syringe	BD Syringe	309623
Cloth
Gloves	Ansell	Senseitouch #7823
Avertin or other anesthetic	see recipe citation
Ketoprofen or other analgesic	see veternarian
Tracking software	Noldus	Ethovision XT
Tracking Camera	Noldus	Media Recorder