Abstract
Eksperimentelle dyremodeller for slagtilfælde er uvurderlige værktøjer til at forstå slagtilfælde patologi og udvikling af mere effektive behandlingsstrategier. En 2 ugers protokol for gentagne hypoxisk konditionering (RHP) inducerer langsigtet beskyttelse mod centralnervesystemet (CNS) skade i en musemodel af fokal iskæmisk slagtilfælde. RHP består af 9 stokastiske eksponeringer for hypoksi, der varierer i både varighed (2 eller 4 timer) og intensitet (8% og 11% O2). RHP reducerer infarktvolumener, blod-hjerne-barrieren (BBB) forstyrrelser, og efter slagtilfælde inflammatoriske respons i uger efter den sidste eksponering for hypoxi, hvilket antyder en langsigtet induktion af en endogen CNS-beskyttende fænotype. Metoden til den dobbelte kvantificering af infarkt volumen og BBB forstyrrelser er effektiv vurderingen neurovaskulær beskyttelse i mus med RHP eller andre formodede neurobeskyttelsesmidler. Voksne mandlige schweiziske Webster mus blev klargjort af RHP eller varighed-ækvivalent eksponeringer til 21% O
Introduction
Som den førende årsag til voksne handicappede og den fjerde hyppigste dødsårsag, slagtilfælde er en af de mest invaliderende sygdomstilstande overfor den voksne befolkning i USA. 1 Dyremodeller af slagtilfælde tillade eksperimentel undersøgelse af nye metoder til at reducere iskæmisk skade og forbedring efter slagtilfælde opsving. En roman avenue for sådan translationel forskning er prækonditionering. Konditionering er forsætlig anvendelse af et ikke-skadelige stimuli for at reducere skader fra en senere og mere alvorlig, skade. 2 Hypoksisk konditionering har vist sig at producere pleiotropiske ændringer i hjernen, der giver beskyttelse mod slagtilfælde i både in vivo og in vitro-undersøgelser . 3 er dog kun en enkelt eksponering for hypoxi tilbyder kortvarig neurobeskyttelse, overtalelse mindre end 72 timer af tolerance over for iskæmi i voksne mus. 4. Selv efter fire ugers 14 timers daglig eksponering for hypobarisk hypoxi, Lin et al. found der neurobeskyttelse kun blev opretholdt i en uge. 5 Gentagne hypoxisk konditionering (RHP) er kendetegnet ved stokastiske variationer i frekvens, varighed og intensitet hypoxiske engagementer. I modsætning til en enkelt forkonditionering udfordring, RHP inducerer en cerebroprotective fænotype, der varer op til otte uger i mus. 6 RHP reducerede infarktvolumener, blod-hjerne-barrieren (BBB) forstyrrelser, vaskulær inflammation og leukocyt diapedese for uger efter den sidste hypoksisk eksponering . RHP specifikt reduceret inflammation i den iskæmiske hjerne ved at reducere T-celle, monocyt, og makrofag populationer, samtidig med at B cellepopulationer i den iskæmiske hemisfære. 7 Faktisk RHP inducerede en immunosuppressiv fænotype i mus forud for enhver CNS skade, herunder slagtilfælde. RHP-behandlede B-celler isoleret fra RHP-behandlede sunde mus udviste en unik antiinflammatorisk fænotype, med en nedregulering af både antigenpræsentation og antistofproduktion. Densamlet reduktion proinflammatoriske adaptive immune mekanismer gør RHP en fremragende metode til at inducere endogen immunosuppression for ikke kun CNS-specifikke inflammatoriske sygdomme, men også systemiske skader eller sygdomsmodeller, der omfatter en pro-inflammatorisk patologi.
RHP reducerer både infarktvolumen og BBB forstyrrelser efter en transient mellem-cerebral arterieokklusion (tMCAo). Dyremodeller for slagtilfælde, såsom de almindeligt anvendte tMCAo, dramatisk forbedre forståelsen af patofysiologien af slagtilfælde, samt udformningen af mere effektive neurotherapeutics. Først udviklet af Koizumi et al., I 1986, 8 i tMCAo procedure er en meget anvendt fremgangsmåde til induktion slagtilfælde hos gnavere og en af de foretrukne metoder til undersøgelse af inflammation efter reperfusion. Da metoderne til tMCAo udvikle sig, den nyere anvendelse af silikone-coated filamenter yderligere at reducere risikoen for subarachnoid blødning sammenlignet med andre modeller 9,10 </ Sup> og forbedre pålideligheden, men desværre tMCAo ofte producerer en bred variation i infarktvolumener. 11-13 fleste af disse undersøgelser afgrænse infarkt regioner i koronale hjernen sektioner ved farvning med 2,3,5- triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), betragtes som en gold standard for infarkt kvantificering fordi det er en enkel og billig måde at fremstille levende, replikerbare resultater. TTC tjener som et substrat af dehydrogenaser stede i mitochondrier. Når hjernen skiver udsættes for TTC opløsning, TTC taget selektivt i levende celler, hvor dets ikke-opløselige reduktionsprodukt, formazan, udskillelser til en dyb rød farve i levedygtige mitokondrier. På grund af mitokondriel dysfunktion i det iskæmiske væv, dette væv forbliver hvidt, giver mulighed for differentiering af beskadiget og sundt væv. 14
RHP reducerer også BBB forstyrrelser i den iskæmiske hemisfære. 6 Derfor, den dobbelte kvantificering af BBB integritet inden for samme bregnskyl som TTC-baserede infarktvolumen-bestemmelser 15 ville give nyttige oplysninger om den fulde effekt af endogene beskyttelse, og potentielle årsagssammenhænge mellem BBB forstyrrelser og infarkt i ubehandlede og behandlede dyr. Tilstrømningen af perifert blod gennem et afbrudt BBB, som følge af slagtilfælde, øger leukocytpopulationer, pro-inflammatoriske cytokiner, oxidativt stress, vasogent ødem og hæmoragisk transformation i den iskæmiske hemisfære, i sidste ende øge satserne for infektion og mortalitet hos patienter med iskæmisk slagtilfælde . 16,17 En almindelig fremgangsmåde til måling BBB forstyrrelser i dyremodeller er gennem kvantificering af Evans blue (EB) farvestof lække ind i hjernen. 15,18-21 EB selektivt binder til serumalbumin, en kugleformet protein (MW = 65 kDa) som ikke krydser BBB i uskadte dyr. 22 Efter iskæmisk slagtilfælde, EB infiltrerer hjernen, og fluorescerer ved 620 nm, hvilket muliggør måling af optisk densitet within den perfunderede skadet parenkym. 22 Den optiske densitet er direkte proportional med permeabiliteten af BBB, når EB er blevet vasket ud post-mortem cortical vaskulatur ved transcardiac perfusion. Med den umiddelbare behandling af TTC-farvede hjerner i dyr med EB administration, kan både infarkt volumen og BBB forstyrrelser effektivt kvantificeres. Det skal dog bemærkes, at neuronal skade og BBB forstyrrelser er ikke samtidige processer i efter slagtilfælde hjerne, 23,24 så valget af tidspunktet for aflivning er en vigtig overvejelse.
Den protokol, der følger detaljer RHP metoden, tMCAo fremgangsmåde til induktion en midlertidig arterieokklusion som modeller midterste cerebrale arterie okklusion i humane patienter, og de dobbelte histologiske metoder til bestemmelse neurale og vaskulære slagtilfælde skade endepunkter. TTC måler celledød og kumulative vævsskade, der giver mulighed for kvantificering af en samlet infarkt volume, mens EB foreskriver hemisfærisk kvantificering af BBB skader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved UT Southwestern Medical Center, som overholder National Institutes for Health (NIH) politik for brug forsøgsdyr.
1. Gentagne Hypoksisk Forkonditionering
- Custom design fire flowmålere på gas regulatorer og tillægger standard 15 L induktion kamre med PVC-rør til at tillade komprimeret gas fra oxygen (O 2) tanke til at flyde ind i kamrene via en indgangsport. Se Udstyr og Materialer til flere detaljer om custom design.
- Opdel mus i 2 grupper: Gentagne Hypoksisk Forkonditionering (RHP) Gruppe, der modtager eksponeringer til 8% og 11% O 2, og kontrolgruppen, der modtager eksponeringer til 21% O 2 (rumluft) samtidigt. Se tabel 1 for de variationer i frekvens, intensitet (8 og 11% O 2 eller 21% O 2) og varighed (2 eller 4 timer) i RHP engagementer. </ Li>
- Fjern det øverste filter låget på hvert bur og placere buret, med mad og vand flasker intakte, i kamrene forbundet til deres respektive O 2 tanke. Luk og fastgør låget af kammeret.
- Åbn vigtigste gasventil for tankene og indstille den indledende flow for hver induktion kammer til 2 L per min (LPM) for de første 5 minutter af eksponering. Reducere strømningshastigheden til 1 LPM for resten af eksponeringen.
- Ved slutningen af eksponeringen, reducere strømmen til til 0 LPM og luk gashanen til tankene.
- Åbn kammeret låg og udskifte filteret top låg på hvert bur. Placer bure i standard hus indtil næste hypoksisk eksponering.
- Spray ned hver induktion kammer med NPD (Steris) eller en tilsvarende desinfektionsmiddel / deodorizer efter hver brug.
- Udsætte både 21% og RHP musene på samme tidspunkt af dagen i løbet af to uger som beskrevet i tabel 1.
2. TransientMellem-cerebral arterieokklusion (tMCAo)
- Se Diskussion for flere detaljer om tidsplanen for slagtilfælde følgende endelige RHP eksponering.
- Forbered en aseptisk kirurgi arbejdsplads. Ren omgivende arbejdsplads med 70% ethanol eller en tilsvarende desinfektionsmiddel og autoklaver alle kirurgiske redskaber.
- Opsæt Laser Doppler flowmetri (LDF) instrument til at måle relative ændringer i cerebral blodgennemstrømning (CBF). Tænd varmepude til 37 ° C. Tænd inkubatoren til 34 ° C.
- Bedøver mus med en kort udsættelse for en blanding af 4% isofluran / 70% NO 30/02% O 2 i en lille induktion kammer. Bekræft ordentlig anæstesi ved let at klemme poten. Hvis musen trækker sin pote, returnere musen til induktion kammeret og fortsætte isofluran eksponering.
- Fjerne mus fra anæstesi induktion kammeret og hurtigt at indsætte musens næse i næse kegle. Åbn gasstrømmen til næsekeglen, lukker gastilførslen til Anesvelse induktion kammer.
- Uden at ændre 70% NO 2/30% gasblanding O 2, fastsætte isofluran på 1,8% som den dosis for den resterende del af proceduren vedligeholdelse. Vejrtrækning bør forblive langsom og regelmæssig hele proceduren, men hvis åndedrættet bliver hurtig og overfladisk, øge isofluran dosis. Vedligeholdelsesdosis kan variere mellem fremstilling udstyr og dyr, der anvendes i eksperimentet.
- Ved hjælp af en microshaver, barbere håret på den tidsmæssige regionen mellem hjørnet af øjet og øret samt ventral midterlinjen af halsen. Fjern overskydende pels og anvende okulær smøremiddel med en steril vatpind til at holde hornhinderne tørrer ud under proceduren. Tør snit område med alkohol pads og vatpind providon-jod med en steril vatpind for at opretholde aseptiske forhold.
- Administrere analgetika ifølge gnaver kirurgiske retningslinjer.
- Lave et snit gennem den tidsmæssige huden mellem øjet og øret.Udsætte temporalis musklen. Ved hjælp af kirurgiske mikro-saks, klippe den tidsmæssige muskel ledbånd ved den tidsmæssige højderyg inden for området hvide muskel riller.
- Skub forsigtigt musklen hovedparten lateralt med en pincet for at visualisere den midterste cerebrale arterie (MCA) gennem kraniet. Efter indsnit i den tidsmæssige muskler, kan området fyldes med blod. Brug forsigtigt en vatpind til at stålsatte eventuelle blødninger.
- Målrette den LDF sonden til den MCA-området. Optage det valgte da dette område varierer mellem mus fartøj.
- Hold LDF på plads og flugter med kraniet, indtil et stabilt røde blodlegemer flux er læst og registrere denne værdi som baseline CBF. Ideel baseline CBF på en Laser Doppler-flowmetri er> 600 flux, men dette vil variere med producenten. Hvis baseline CBF er <400 flux, strømmen optagelse er mest sandsynligt fra en nærliggende vene eller en ufuldstændig placering af sonden over målet fartøj.
- Efter baseline CBF er etableret, repositipå musen, således at halsen er udsat for. Støt hovedet og holde musen under konstant anæstesi fra næsekeglens.
- Lav en ventral midtliniesnit fra lige under underkæben til kravebenet.
- Ved hjælp af pincet, stumpt dissekere alle overfladiske fascia for at blotlægge den venstre almindelige carotidarterie (CCA). Adskil CCA fra bindevæv og vagus nerve.
- Permanent ligere CCA med en 6,0 silke sutur. Placer ligere sutur som proksimalt som muligt for at give plads nok til okklusion endeløse placering.
- Loop og løst binde en anden silke 6,0 sutur omkring CCA distalt for okkluderende sutur. Pas på ikke at okkludere arterien som den lukkende glødetråd efterfølgende vil blive ført gennem carotis.
- Brug en 8 x 2 mm lys micro serrafine areterial klemme til klemme CCA distalt for løst bundet silke sutur. Løft forsigtigt CCA med pincet og lave en lille langsgående snit, som nærmest ligeringsinstrumentet sutur sommuligt med 3 mm Vannas.
- Tråd en 12 mm silicium-coatede 6,0 gauge nylon okkluderende filament gennem snittet til at komme ind arterie lumen, og derefter rykke det et par mm. Løst stramme anden løs silkesutur omkring spidsen af den lukkende filament at sikre blodgennemstrømning ikke skubbe glødetråden ud af CCA og fjern den arterielle klemme.
- På det første tvedeling af CCA ind i den indre carotidarterie (ICA), og den ydre carotidarterie (ECA), trådes den lukkende filament i den højre gren af den første bifurkation at indtaste ICA.Advance den lukkende filament 9-10,5 mm forbi den anden silkesutur i den venstre interne carotidarterie (ICA).
- Kort tid efter ind i ICA, fremføre okkluderende glødetråd ind i venstre gren på den anden tvedeling mellem ICA og pterogopalantine arterie (PPA). Visualisering af PPA er usandsynligt, så fortsæt, indtil du føler en mild modstand med fuld placering af okkluderende glødetråd.Løft af ICA med pincet kan hjælpe glødetråden til tråd lettere ind i venstre gren af den anden birfurcation. Spænd den anden silke sutur.
- Vend musen så snittet over MCA er synlig. Med LDF udstyr, bekræfter, at CBF er blokeret via LDF aflæsninger. En vellykket okklusion er en reduktion> 80% fra baseline CBF.
- Helt stramme og dobbeltklik knude den anden silkesutur omkring okkluderende glødetråd når den korrekte position er opnået. Hvis det er nødvendigt, let skub i eller træk den lukkende glødetråd til at opnå CBF kriterier for en succesfuld okklusion (f.eks> 80% reduktion fra baseline CBF).
- Luk hals og hoved åbning med 6,0 nylonsuturer.
- Placer mus i 34 ° C inkubator for varigheden af okklusionen. Anbefalet længde okklusion er 60 min, men dette varierer for alder, strain-afhængige forskelle i cerebrovaskulær anatomi, 25 og omfanget af injury ønskes (mild, moderat, svær). Sørg for, at dyrene kommer til bevidsthed inden minutter af bænken anæstesi.
- Re-bedøver dyrene med isofluran, som beskrevet i trin 2.3, 5 min før udgangen af den foruddefinerede okklusion periode, åbne hovedbunden incision og bekræfte, at MCA perfusion stadig reduceres ved hjælp Transkranial LDF aflæsninger. Hvis CBF ikke reduceres i tilstrækkelig grad (f.eks <20% baseline CBF) har MCA reperfunderes på et tidspunkt i løbet af okklusion og musen bør udelukkes fra yderligere eksperimenter.
- Åbne midterlinjen hals indsnit og løst binde en tredje silkesutur omkring CCA, distalt til den anden silkesutur men proksimalt i forhold til CCA bifurkationen for at sikre, at den eksterne carotidarterie (ECA) forbliver levedygtigt efter glødetråden er fjernet.
- Klip eller løsne knuden, der holder okkluderende glødetråd (dvs. andet silke sutur) og langsomt trække den lukkende glødetråd. Når fjernet, hurtigt lukketredje silkesutur omkring CCA at minimere tilbagestrømning af blod fra ICA. Dobbeltklik knude denne sutur og lukke snittet med 6,0 nylonsuturer.
- Flyt musen til at kvantificere niveauet for CBF efter 5 min af reperfusion. Vellykket reperfusion er generelt defineret som en CBF på> 50% af baseline CBF, men som med okklusion flow, kan undersøgere etablere deres egen kriterium. Hvis dyrene udviser en CBF under 50% af deres baseline, er det sandsynligt at MCA er "permanent" tilstoppet, og dermed repræsenterer en anden undersøgelse udelukkelse kriterium.
- Luk begge incisioner med 6,0 nylonsuturer. Give saltvand, bedøvelsesmiddel (Lidocain), og antibiotika i henhold til retningslinjerne gnaver. Men nogle små doser af antibiotika (3 mg / kg af minocyclin) har vist sig at være neurobeskyttende hjerneblødninger. 26
- Efter at have fået bevidsthed i den opvarmede inkubator efter operationen, sted mus i en ren, steril bur. Giv fugtet food eller ernæringsmæssige hydrering kosten gel kosttilskud og en petriskål af vand som dyrene vil have begrænset mobilitet efter slagtilfælde. Overvåg dyr tæt under opsving for overdreven post-operative smerter og død.
3. Evans Blå (EB) Injektion
- Injicere EB 22 timer efter reperfusion og bør cirkulere i blodbanen i 2 timer forud for ofre og TTC farvning.
- Få et EB injektionsvæske, opløsning (2% EB i saltvand) og forsigtigt blandes ved stuetemperatur. Filter opløsning gennem filtrerpapir eller skubbe gennem et 0,2 um filter knyttet til en lille sprøjte for at fjerne uopløst EB og opbevares ved stuetemperatur.
- Forberede mængden af EB nødvendige til injektion (4 ml / kg legemsvægt) Tegn den ønskede mængde farvestof i en 0,3 cc insulinsprøjte med en 29 gauge nål og sikre, at opløsningen har stuetemperatur
- Begrænse mus ved hjælp flad bund harpiksstopperen. Holde halen, således at den laterale vene er uppermost. Laterale vener er placeret på hver side af midterlinien af halen. Hold spidsen af halen for at holde musen stabil til injektion.
- Stik nålen i venen ca. 3,5 mm, og pas på ikke at perforere venen. Bekræft, at nålen er i venen ved at trække tilbage på sprøjten og leder efter spor af blod.
- Injicere hele af farvestoffet i løbet af 1 min. Hvis opløsningen kommer ind i venen der bør være minimal modstand som påføres tryk på sprøjten. Bekræft vellykket systemisk venøs administration af EB med en øjeblikkelig farveændring i halen, lemmer, og øjne med musen.
- Fjern nålen fra halen og forsigtigt lægge pres med rent gaze for at stoppe blødningen.
- Begynd timing når musen hud bliver blå. Lad EB cirkulere i 2 timer til at trænge den svækkede BBB.
4. 2,3,5- triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Farvning
- Når pulveret er helt opløst, straks overføre til en flaske, dække i folie, og opbevares ved 4 ° C. TTC og væv farvet med TTC er lysfølsomme.
- Start perfusion pumpen ved 5 ml / min strømningshastighed med en 60 ml sprøjte fyldt med iskold 0,01 M PBS og forbundet med en 27 gauge vinget infusionsnålen. Placér spidsen af nålen ca. 0,5 cm ind i den venstre ventrikel af hjertet og sender en højre atrium. Gradvis fortyndet veneblod skal flyde ud af atrium under perfusion, indtil veneblod vises farveløs. Transkardialt perfundere 30 ml 0,01 M phosphatbufret saltvand (PBS) gennem hjertet.
- Fjern de olfaktoriske pærer ved at indsætte en rustfri stål 0,21 mm tyk klinge ind i den anden spalte fra den rostrale side af matrixen.
- Fjern cerebellum ved at indsætte et blad i fjerde spalte fra den caudale side af matrixen.
- Sæt en kniv ind i midten slot af resterende slots i matricen. Sæt de resterende blade, jævnt skærer det resterende væv for at sikre den mest jævne fordeling af væv under udskæring.
- Når alle knive er blevet indsat, tilsættes 1 til 2 dråber af PBS til hjernen til at fugte det.
- Tag klingens et ad gangen fra matricen begynder med den rostrale region. Hold de første 7 skiver for TTC analyse efter tMCAo. Brug en lille spatel til forsigtigt overføre skiver fra bladet til TTC-fyldte hætteglas.
- Når sektionerne er anbragt på objektglasset, scan objektglasset under anvendelse af en standard scanner. Indstil opløsningen i minimum 600 dpi for billedanalyse. Sørg for at medtage navnet på dyret og en metrisk lineal i det scannede billede.
- Flip over slideog scanne bagsiden for at sikre alle data indsamles.
5. infarktvolumen Kvantificering
- Kvantificere den infarkt volumen ved hjælp af en standard billede analyse software (f.eks ImageJ).
- Scan billeder på en høj opløsning (f.eks 600 dpi) for tilstrækkelig analyse. Beskær billeder. Standardisere skalaen for alle billeder ved hjælp af metriske hersker indgår i det scannede billede.
- Beregn det samlede volumen af den kontralaterale hemisfære efter følgende formel. Gentag denne formel til at beregne det samlede volumen af den ipsilaterale hemisfære.
Summen af den samlede kontralaterale hemisfære af hver skive x skivetykkelse - Beregn den indirekte infarktvolumen. . Kontrol for ipsilateral ødem af slagtilfælde ved at bruge den sunde, kontralaterale hemisfære som en kontrol 27 Brug følgende formel til at beregne den indirekte infarktvolumen:
Samlet volumen af kontralaterale hemisfære -
(Total volue af ipsilaterale hemisfære -Gennemsnitlig volumen på 3 målinger af infarkt)
6. blod-hjernebarrieren (BBB) Integrity Kvantificering
- For at forberede EB kvantificering, først vejer 2,5 tommer vejer både. Noterer vægten og mærke to veje både til hvert dyr: en for den ipsilaterale hemisfære og en til den kontralaterale hemisfære.
- Efter scanning TTC-farvede sektioner, gennemskære hver sektion med en engangs barberblad i ipsilaterale og kontralaterale halvkugle. Placer ipsilaterale halvkugler fra alle 7 sektioner i en vejer båd, og massen noteres. Gentag for kontralaterale hemisfære.
- Straks at overføre vægten både til en ovn sæt til 56 ° C i 48 timer.
- De tørrede sektioner afvejes. Overfør begge hemisfærer i separate 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Beregne mængden af formamid nødvendige for hvert halvkugle (8 ml / g tør væv), og tilføje til deres respektive microcentrifuge rør. Formamid er lysfølsomt og dække alle formamid-behandlede prøver i folie fra dette punkt og fremefter.
- Overfør mikrocentrifugerør til en inkubator indstillet til 56 ° C i yderligere 48 timer.
- Efter 48 timer, pipette ud det blå supernatant til et andet sæt af mærkede mikrocentrifugerør. Skub væv til bunden af røret for at maksimere omfanget af ekstraherede supernatant. Hold rørene supernatant og bortskaffe al væv.
- Forbered eksponentielle seriefortyndinger af EB i formamid for standardkurven. Omfatter 1 tomme (formamid kun) og derefter 10 eksponentielle løsninger fra 0,125 ug / ml gennem 64 ug / ml EB i formamid.
- Pipette 300 pi fortyndingerne lavet til standardkurven i en 96-brønds plade. Pipette 300 pi af supernatanten i tilsvarende brønde.
- Mål absorbansen på et spektrofotometer ved 620 nm.
- Sammenlign standardkurven af EB fortyndinger med absorbansen of supernatant prøver. Den optiske densitet er direkte proportional med integriteten af BBB.
- Antag den optiske densitet af den kontralaterale hemisfære som baggrund og bruge formlen (ipsilaterale-kontralateral) / kontralateral at bestemme gange ændring. For yderligere oplysninger om statistisk analyse se Martin et al., 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse omfattede 25 mandlige Swiss Webster-mus, der var 10 uger gamle ved starten af randomisering i RHP (n = 10) eller 21% O 2 (n = 15) grupper. To uger efter den sidste RHP eksponering blev kirurgiske procedurer udført, med grupper blindet og opvejes mellem dag. Efter tMCAo, 1 mus døde under det postoperative forløb og 1 mus blev udelukket fra undersøgelsen, fordi det ikke opfylder reperfusion CBF kriterium. Begge udelukkede mus var fra 21% O 2-gruppe. I overensstemmelse med ANKOMMER retningslinjer 28 Tabel 2 viser kirurgiske parametre. Indirekte infarktvolumener, halvkugleformet hævelse (dvs. ødem) og Evans-blåt (EB) ekstravasation er vist i figur 2. Alle data blev analyseret med uparrede t-test (gennemsnit, standardafvigelse vist) og outliers påvist med et False Discovery Rate mindre end 1% (Graphpad Prism), som fjernede 4 outliers (2 fra 21%, 2 fra RHP) fra EB datasættet.
3) i forhold til 21% O 2 -behandlet mus (62,6 ± 42,6 mm 3), men denne forskel var ikke-signifikant (p = 0,10). Men en a priori Power analyse forudsagde en nødvendig n = 10 pr gruppe, som vi ikke opnå med de RHP-behandlede mus efter outliers blev fjernet. Dette bør overvejes i udformningen af fremtidige eksperimenter ved hjælp af RHP. Der var ingen virkning af RHP til halvkugleformet hævelse, en metrik afledt af volumenet analyse TTC der kunne sidestilles med ødem. 6 RHP-behandlede mus udviste en tendens (p = 0,05) i reduktionen af BBB forstyrrelser inden den iskæmiske hemisfære normaliseret til den kontralaterale hemisfære. Figur 2D viser et interval af værdier for EB lækage for begge behandlingsgrupper.
Figur 1:. Skræddersyede RHP kamre Overpanel afbilder specialbyggede flowmålere til individuel overvågning af luftstrømmen i op til fire kamre. Luftimpermeabelt slanger er vist forlader flowmåleren og fastgørelse til indløbsåbningen af de 15 L induktion kammer i det nederste panel. Udgangsport forbliver åben under RHP at give mulighed for luftcirkulation.
Figur 2:.. RHP reducerer infarktvolumener og BBB forstyrrelser RHP (A) reducerer infarktvolumener med 46% i forhold til at styre mus, men har (B) ingen indflydelse på hemisfærisk hævelse afledt af TTC data (C) I de samme dyr, RHP reducerer BBB forstyrrelser (p = 0,05) som defineret af Evans Blå lække normaliseret til den kontralaterale hemisfære. (D) repræsentant TTC pletter fra både RHP-behandlede og 21% O2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkelt eksponering for systemisk hypoxi (dvs. 2 timer på 11% O 2) i mus "forbigående" beskytter hjernen mod tMCAo, 29 hvilket betyder, at epigenetiske svar på den hypoxiske forbehandling udfordring er kort-varig, og baseline fænotype genoprettes inden dage. Gentagne præsentationer af den hypoxiske forkonditionering stimulus dramatisk forlænge varigheden af den neurobeskyttende fænotype. 6 Mange undersøgelser har vist, at hyppigheden, omfanget og varigheden af den gentagne stimulus toget er kritiske determinanter for denne reaktion. For eksempel blot at gentage den samme intensitet og varighed af hypoxi (2 timer på 11% ilt) 3 gange om ugen (MWF) over 2 uger ikke udvide det terapeutiske vindue for neurovaskulær beskyttelse mod tMCAo, 6, men var tilstrækkelig til at fremkalde lang sigt iskæmisk tolerance i nethinden. 30. Det er interessant, selv om 5 eksponeringer for systemisk hypoxi (5 timer på 8% O 2 </ Sub>) afstand 6 dage fra hinanden beskyttet mod tMCAo induceret 3 dage efter den sidste hypoksisk eksponering, neurobeskyttelse blev tabt, hvis de 5 hypoxiske eksponeringer blev placeret 3 dages mellemrum. 31 Årsagen til denne forskel er fortsat uklart, men kan have været på grund af den varigheden af den alvorlige hypoxi i forhold til denne protokol og / eller utilstrækkelig restitutionstid mellem hypoxiske udfordringer i denne sværhedsgrad.
Kort sagt, titrering af gentagne hypoksisk udfordring på tværs af domæner frekvens, omfang og varighed, synes afgørende for udviklingen af tolerance uden at fremkalde skade, for ikke at nævne vævsspecifikke og måske species-specifikke effekter. For eksempel 3 af 9 af RHP eksponeringer involverer eksponering til 8% O 2 i 4 timer, selv om 6 timer på 8% O 2 inducerer hippocampus neuronal død. 32 Derfor skal der være en streng overholdelse af RHP-protokollen med hensyn til varighed og sværhedsgrad af hypoxiske eksponeringer at inducere endogenbeskyttelse. Selv om den potentielle effekt af døgnrytme på konditionering-induceret beskyttelse kræver yderligere udforskning, 33 udfører RHP eksponeringer på samme tidspunkt af dagen for en bestemt kohorte reducerer risikoen for en potentiel confounding effekt. I form af dosis-respons og effekt, forekom de mest robuste RHP-medieret beskyttelse mod fokalt slagtilfælde når tMCAo blev induceret i 2 uger efter den endelige hypoksisk eksponering, 3 i en tid hvor RHP-behandlede raske mus udviser en immunosuppressiv fænotype (i fravær af iskæmisk skade). 7. Dette 2 ugers tidspunktet ikke nødvendigvis falder sammen med perioden for maksimal beskyttelse mod andre akutte CNS-skader, eller i andre organsystemer. Både RHP-protokollen, og de tidsmæssige funktioner i epigenetiske respons, vil uden tvivl brug for optimering for hver ny translationel brug.
En af de største begrænsninger i tMCAo procedure er den heterogene fordeling af infarkt voLumes, som det fremgår af denne repræsentativt datasæt. Sikkerhedsstillelse cirkulation leveres af Circle of Willis, leptomeningeal anastomoser, og dorsale sikkerhedsstillelse vejkryds kan føre til inkonsistente infarktvolumener. 34 Variationer mellem Circle of Willis i forskellige stammer af mus, samt tilstedeværelse og åbenheden af posterior kommunikere arterier, 25 35 kan yderligere reducere sammenhæng i infarktvolumener inden for grupper. Robuste stikprøvestørrelser og replikation er ofte nødvendig for at producere overbevisende resultater, og bør indgå i udformningen af forsøget efter kraftoverførsel i overensstemmelse hermed. Andre fremgangsmåder til slagtilfælde induktion, især distale fokale iskæmiske metoder såsom okklusion af MCA primære gren via en borehul i den laterale kraniet eller photothrombosis distale grene af MCA, ofte producerer mindre variation i slagvolumen. Photothrombotic slagtilfælde er imidlertid begrænset, da de producerer samtidig ekstracellulære og intracellulære ødem, en phenomenon ikke set i iskæmisk slagtilfælde hos mennesker. 36 Omvendt tMCAos er mere umiddelbart til den kliniske indstilling som over 60% af alle slagtilfælde i mennesker forekomme på grund af obstruktion af den midterste cerebrale arterie. 37 Endelig anæstesi anvendes under tMCAo, isofluran , har vist sig at inducere neurobeskyttelse. 38 Med henblik på at tage højde for dette neurobeskyttelse, bør isofluran niveauer være konsistent mellem operationer og mellem behandlede og ubehandlede forsøgsgrupper, og holdt ved <3% for at reducere dets potentielle neurobeskyttende virkninger. 39
Tid er også kritisk i TTC farvning proces. Selv om der er stor variation i slaget litteratur om den tid, hvor TTC farvning kan udføres efter iskæmi, varierende fra 4 timer til 7 dage efter slagtilfælde, bør 18,40 TTC farvning forekomme på 24 til 48 timer efter slagtilfælde for de mest konsekvente og klart afgrænset infarktvolumener. TTC infarktvolumener har bin fundet at stabilisere 24 timer efter slagtilfælde, men efter 48 timer, en tilstrømning af makrofager i den iskæmiske hjerne gør definere infarktvolumen vanskelig. 14,40 Endvidere bør farvningen af hjernevæv med TTC følge umiddelbart efter aflivning. Forsinke farvning vil reducere kvaliteten af pletten på grund af forøget mitokondriel dødsfald som følge af animalsk død, ikke cerebral infarkt. En tilsvarende stigning i mitokondrie død vil opstå, hvis hjernen ikke holdes fugtig i indsættelsen af bladene. Mens denne protokol illustrerer tydeligt fordelen ved infarkt analyse med TTC farvning, kan andre immunhistologiske pletter bruges til at kvantificere infarkt volumen efter tMCAo. Cresylviolet eller fluor-jade farvning har mindre stive tid krav til farvning efter aflivning, men disse klassiske pletter kræver meget tynde sektioner fremstillet ved cryostat eller mikrotom, og derfor kræver mere tid til integrativ summering og analyse. 14 Desuden disse stains kan ikke anvendes sammen med EB kvantificering af BBB forstyrrelser, som er udviklet af andre, 15 fjerne muligheden for direkte sammenligning mellem infarktvolumen og BBB integritet i en given hjerne. Det skal bemærkes, at RHP-behandlede dyr udviste typisk pink i modsætning til rene hvide bind. 6 For at undgå udvaskning af infarkt i RHP-behandlede mus, bruger vi en kortere farvning periode TTC, som resulterer i mere lyserød sunde væv i modsætning til mørkerød. Evans Blå behandling kan også mørkere infarkt området så rene hvide infarkter er usandsynligt med det dobbelte kvantificering farvning præsenteres i denne protokol.
For at sammenligne EB kvantificering i og mellem grupper, skal alle dyr underkastes ækvivalente cirkulationstider for EB. Andre har injiceret EB umiddelbart efter reperfusion og tillod EB at cirkulere i op til 72 timer, 41 eller ved 4 timer efter tMCAo cirkulere i 4 timer, 15 som alternative tilgange. Mængden af EB, der krydser forstyrret BBB og går hjernevæv repræsenterer den integrerede ophobning af albumin-bundne farvestof fra tidspunktet for injektion til tidspunktet for aflivning. Således beskrives i dette dokument metode afslører status for BBB netop på et tidspunkt mellem 22 og 24 timers reperfusion, og kan gå glip tidligere eller senere åbninger eller lukninger af barrieren. Omvendt ansat af Wang et al. afslører status for BBB i 72 timer efter slagtilfælde, herunder alle ændringer i BBB-status i at 3 dag efter slagtilfælde tid 42 Hverken protokollen er bedre eller værre.; selv om der stadig er en risiko for "manglende" en forbigående åbning af BBB ved hjælp kortere cirkulationstider, det giver efterforskerne at identificere specifikke tidsmæssige funktioner i BBB patofysiologi og at parre den med andre metoder, som vist her. Andre har kombineret TTC og EB ved injektion EB intrakardial 1 min efter transcardial perfusion. 18. Men dette mødtehod produceret inkonsistente resultater og er en langt mere kompliceret procedure end den ovenfor beskrevne protokol.
En af de mest lovende fremtidige retninger for RHP er translationel anvendelse af denne konditionering protokol til andre sygdomstilstande. Periodiske hypoxiske engagementer har vist sig at være beskyttende i proinflammatoriske andre end iskæmi CNS betingelser. I en rotte model af Alzheimers, 2 uger af 4 timers daglig eksponering for hypobarisk hypoxi reducerede svækkelse af hukommelsen retention og tab af kortikale neuroner efter intracerebrale injektioner af beta-amyloid. 43 Intermitterende hypoxi (2 uger af 15 timers daglig eksponering for hypobarisk hypoxi ) viste sig også at være beskyttende i rotter efter L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) infusion, en model af Parkinsons som forringer striatale dopaminerg transmission. 44 er dog kun disse modeller på Alzheimers og Parkinsons undersøgte kortsigtede effekter afhypoxisk konditionering. 43,44 Undersøgelse den langsigtede neurobeskyttelse induceret af RHP kan være en frugtbar fremtidige retning for forskning. Endvidere kan neurobeskyttelse induceret af RHP omfatte forbedret BBB integritet i musemodeller for Alzheimers, der kunne analyseres med EB. 45 Den dobbelte TTC og EB-analyse ville være endnu mere nyttig i Parkinsons model, da det får striatale læsioner 46 og BBB forstyrrelser, 47, som kan kvantificeres med TTC 48 og EB, 49 hhv. Samlet RHP er en enkel, kraftfuld form for forbehandling med stor translationel potentiale som det entydigt inducerer langsigtet, anti-inflammatorisk, og neurobeskyttende effekter. Den dobbelte kvantificering af TTC og EB kunne også nemt anvendes på andre sygdomstilstande, der involverer mitokondrier forstyrrelser, celledød, og BBB lækage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
