Abstract
Eksperimentelle dyremodeller av hjerneslag er uvurderlig verktøy for å forstå hjerneslag patologi og utvikle mer effektive behandlingsstrategier. En to ukers protokoll for repeterende hypoksisk prekondisjonering (RHP) induserer langsiktig beskyttelse mot sentralnervesystemet (CNS) skade i en musemodell for focal hjerneinfarkt. RHP består av 9 stokastiske eksponeringer til hypoksi som varierer både i varighet (2 eller 4 timer) og intensitet (8% og 11% O 2). RHP reduserer infarktvolum, blod-hjerne-barrieren (BBB) forstyrrelsen og etter slag inflammatorisk respons i flere uker etter den siste eksponering for hypoksi, noe som tyder på en langsiktig induksjon av et endogent CNS-beskyttende fenotype. Metodikken for dual kvantifisering av infarktvolum og BBB avbrudd er effektiv i å vurdere neurovascular beskyttelse i mus med RHP eller andre antatte neuroprotectants. Voksne mannlige sveitsiske Webster mus ble preconditioned av RHP eller varighets-ekvivalent eksponeringer til 21% O
Introduction
Som den ledende årsaken til uførhet og den fjerde største dødsårsaken, er hjerneslag en av de mest ødeleggende sykdomstilstander som vender den voksne befolkningen i USA. En dyremodeller av hjerneslag tillate for eksperimentell undersøkelse av nye metoder for å redusere iskemisk skade og forbedring av post-takts utvinning. En roman avenue for eksempel translasjonell forskning prekondisjonering. Prekondisjonering er tilsiktet bruk av en ikke-skadelig stimulus for å redusere skader ved en etterfølgende, og mer alvorlige personskader. 2 hypoksiske prekondisjonering har vist seg å produsere pleiotrope forandringer i hjernen som gir beskyttelse mot slag både i in vivo og in vitro studier . 3 Men en enkelt eksponering for hypoksi bare tilbyr kortsiktig neuroprotection, indusere mindre enn 72 timer av toleranse mot iskemi hos voksne mus. 4 Selv etter fire uker med 14 timers daglig eksponering til hypobar hypoksi, Lin et al. found at nevro ble bare opprettholdes i en uke. 5 Repetitive hypoksisk prekondisjonering (RHP) er preget av stokastiske variasjoner i hyppighet, varighet og intensitet av hypoksiske eksponeringer. I motsetning til en enkelt preconditioning utfordring, induserer RHP en cerebroprotective fenotype som varer opp til åtte uker i mus. 6 RHP redusert infarktvolum, blod-hjerne-barrieren (BBB) avbrudd, vaskulær betennelse, og leukocytt-diapedese i flere uker etter den siste eksponering hypoksisk . RHP spesielt redusert inflammasjon i iskemisk hjerneskade ved å redusere T-celle, monocytter og makro populasjoner, samtidig som B-cellepopulasjoner i den ischemiske hjernehalvdelen. 7 faktisk RHP indusert et immunsuppressivt fenotype hos mus før enhver CNS-skade, inklusive slag. RHP-behandlede B-celler isolert fra RHP-behandlede friske mus utviste en unik anti-inflammatorisk fenotype, med en nedregulering av både antigen-presentasjon og antistoffproduksjon. Densamlet reduksjon i proinflammatoriske adaptive immunmekanismer gjør RHP en utmerket metode for å indusere endogen immunsuppresjon for ikke bare CNS-spesifikke inflammatoriske sykdommer, men også systemiske skade eller sykdom modeller som er pro-inflammatorisk patologi.
RHP reduserer både infarktvolum og BBB avbrudd etter en forbigående midten cerebral arterie okklusjon (tMCAo). Dyremodeller av hjerneslag, som vanligvis brukes tMCAo, dramatisk forbedre forståelsen av patofysiologien ved hjerneslag, samt utforming av mer effektive neurotherapeutics. Først utviklet av Koizumi et al., I 1986, er 8 den tMCAo prosedyren en mye brukt metode for å indusere slag hos gnagere og en av de foretrukne fremgangsmåter for å undersøke inflammasjon etter reperfusjon. Som metoder for tMCAo utvikle seg, jo mer nylig bruk av silikon-belagte filamenter ytterligere å redusere risikoen for subaraknoid blødning, sammenlignet med andre modeller 9,10 </ Sup> og bedre pålitelighet, men dessverre tMCAo gir ofte store variasjoner i infarktvolum. 11-13 De fleste av disse studiene avgrense infarkt regioner i koronale hjernen seksjoner ved farging med 2,3,5- trifenyltetrazoliumklorid (TTC), regnes som en gullstandarden for infarkt kvantifisering fordi det er en enkel og rimelig måte å produsere levende, kopier resultater. TTC tjener som et substrat av dehydrogenaser til stede i mitokondriene. Når hjerneskiver blir utsatt for den TTC oppløsningen blir TTC selektivt tas inn i levende celler, hvor dets ikke-oppløselige reduksjonsprodukt, formazan, utfelles til en dyp rød farge i levedyktige mitokondriene. På grunn av mitokondriell dysfunksjon i iskemisk vev, forblir dette vevet hvit, noe som åpner for differensiering av skadet og friskt vev. 14
RHP reduserer også BBB avbrudd i den ischemiske hjernehalvdelen. 6 Derfor, den doble kvantifisering av BBB integritet i samme bRegnet som TTC-basert infarktvolum bestemmelser 15 vil gi nyttig informasjon om den fulle effekten av endogen beskyttelse, og potensielle årsaksforhold mellom BBB avbrudd og infarkt i ubehandlede og behandlede dyr. Tilstrømningen av perifert blod gjennom en forstyrret BBB, sekundært til hjerneslag, øker leukocyttpopulasjoner, proinflammatoriske cytokiner, oksidativt stress, vasogenic ødem og hemoragisk transformasjon i iskemisk halvkule, slutt å øke satsene for infeksjon og dødelighet hos pasienter med iskemisk hjerneslag . 16,17 En vanlig metode for å måle BBB avbrudd i dyremodeller er gjennom kvantifisering av Evans blue (EB) fargestoff lekkasje inn i hjernen. 15,18-21 EB bindes selektivt til serumalbumin, et globulært protein (molekylvekt = 65 kDa) som ikke krysser BBB i uskadde dyr. 22 Etter iskemisk hjerneslag, infiltrerer EB hjernen, og fluoresces ved 620 nm, noe som åpner for måling av optisk tetthet within perfusert skadde parenchyma. 22 Den optiske tetthet er direkte proporsjonal med permeabiliteten av BBB når EB har blitt vasket ut av post-mortem cortical blodkar ved transcardiac perfusjon. Med umiddelbar behandling av TTC-farget hjernen hos dyr med EB administrasjon, kan både infarktvolum og BBB avbrudd effektivt kvantifiseres. Det bør imidlertid bemerkes, at neuronskade og BBB avbrudd ikke er samtidige prosesser i post-slag hjerne, 23,24 slik at utvalget av avlivningstiden er en viktig faktor.
Protokollen som følger beskriver RHP metoden, tMCAo metode for å indusere en midlertidig arteriell okklusjon som modeller midtre cerebralarterie okklusjoner i menneskelige pasienter, og de to histologiske metoder for å bestemme nevrale og vaskulære slag skader endepunkter. TTC måler celledød og kumulativ skade på vev, slik at for kvantifisering av en samlet infarkt volUme, mens EB gir for hemisfæriske kvantifisering av BBB skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved UT Southwestern Medical Center som retter seg etter National Institutes for Health (NIH) policy for eksperimentell bruk dyr.
1. Repetitive hypoksisk preconditioning
- Tilpasset design fire mengdemålere på bensin regulatorer og feste til standard 15 L induksjons kamre med PVC-rør for å tillate komprimert gass fra oksygen (O 2) tanker å strømme inn kamrene via en inngangsport. Se Utstyr og materialer for mer informasjon om tilpasset design.
- Fordel mus inn i to grupper: Gjentatte hypoksisk prekondisjonering (RHP) Group, som får eksponeringer til 8% og 11% O 2, og kontrollgruppen, som mottar eksponeringer til 21% O 2 (romluft) samtidig. Se tabell 1 for de variasjoner i frekvens, intensitet (8 og 11% O 2 eller 21% O 2) og varighet (2 eller 4 timer) av RHP eksponeringer. </ Li>
- Fjern det øverste filterlokket av hvert bur og plassere buret, med mat og vann flasker intakte, i kammerne tilkoblet deres respektive O 2 tanker. Lukk og fest lokket på kammeret.
- Åpne hovedgassventilen for tankene og sette startstrøm for hver induksjonskammeret til 2 l pr min (LPM) for de første fem minutter av eksponering. Redusere strømningshastigheten til en LPM for resten av eksponeringen.
- På slutten av eksponeringen, for å redusere strømnings til 0 LPM og lukke gassventilen for tankene.
- Åpne kammer lokkene og skifte filteret lokket på hver merd. Plassere merdene i standard bolig før neste hypoksisk eksponering.
- Spray ned hver induksjon kammer med OD (Steris) eller tilsvarende desinfeksjonsmiddel / deodorizer etter hver bruk.
- Expose både 21% og RHP mus på samme tid på dagen i løpet av to uker, som beskrevet i tabell 1.
2. TransientMiddle Cerebral arterieokklusjon (tMCAo)
- Se diskusjon for mer informasjon om tidspunkt for hjerneslag følgende endelige RHP eksponering.
- Forbered en aseptisk kirurgi arbeidsplass. Rent omkringliggende arbeidsplass med 70% etanol eller tilsvarende desinfeksjonsmiddel og autoklav alle kirurgiske verktøy.
- Sett opp Laser Doppler strømningsmåling (LDF) instrument for å måle relative endringer i cerebral blodstrøm (CBF). Slå på varmeputen til 37 ° C. Slå på inkubatoren til 34 ° C.
- Bedøve mus med en kort eksponering til en blanding av 4% isofluran / 70% NO 2/30% O 2 i en liten induksjon kammer. Bekreft riktige anestesi ved lett å knipe labben. Hvis musen trekker labben, tilbake musen til induksjonskammeret og fortsette isofluran eksponering.
- Fjern musene fra anestesi induksjon kammer og raskt sette inn musens nesen i nesepartiet. Åpne gasstrømmen til nesepartiet, å stenge av strømningen til de anesthesia induksjonskammeret.
- Uten å endre 70% NO 2/30% O2 gassblanding, rette isofluran på 1,8% som en vedlikeholdsdose for resten av prosedyren. Breathing bør forbli treg og regelmessig gjennom hele prosedyren, men hvis pusten blir rask og grunne, øke isofluran dose. Opprettholdelsen dose kan variere mellom utstyr produksjon og dyr benyttet i forsøket.
- Ved hjelp av en microshaver, barbere håret på tinning mellom hjørnet av øyet og øret samt ventral midtlinjen av nakken. Fjern overflødig pels og gjelder okulær smøremiddel med en steril bomullspinne for å holde hornhinner tørker ut under prosedyren. Tørk innsnitt området med alkohol pads og pinne providone-jod med en steril bomullspinne for å opprettholde aseptiske forhold.
- Administrere smertestillende i henhold til gnager kirurgiske retningslinjer.
- Lag et snitt gjennom den time huden mellom øyet og øret.Utsett temporalis muskelen. Ved hjelp av kirurgiske mikro saks, klippe tinningmuskelen leddbånd på time ryggen innenfor området hvite muskelen striation.
- Skyv muskel bulk lateralt med tang for å visualisere midten cerebral arterie (MCA) gjennom skallen. Etter snittet av tinningmuskelen, kan området fylles med blod. Bruke forsiktig en bomullspinne for å trofast eventuell blødning.
- Målrette den LDF sondespissen til MCA området. Spill fartøyet valgt som dette området varierer mellom mus.
- Hold LDF på plass og i flukt med hodeskallen til en stabil røde blodceller flux blir lest og registrere denne verdien som referanse CBF. Ideell baseline CBF på en Laser Doppler strømningsmåling er> 600 flux, men dette vil variere med produsenten. Hvis baseline CBF er <400 fluks, er strømnings opptak mest sannsynlig fra en nærliggende vene, eller en ufullstendig plassering av sonden over målet fartøyet.
- Etter at basislinje CBF er etablert, repositipå mus slik at halsen er eksponert. Støtter hodet og holde muse etter jevn anestesi fra nosecone.
- Lag en ventral midtlinjesnitt fra like under kjeven til krageben.
- Bruk pinsett, sløv dissekere alle overfladiske fascia å eksponere venstre arteria carotis communis (CCA). Skill CCA fra bindevev og vagus nerve.
- Permanent ligate CCA med en 6,0 silke sutur. Plasser ligere sutur som proksimale som mulig for å gi nok plass til occluding filament plassering.
- Loop og løst knytte en annen silke 6,0 sutur rundt CCA distal til okkluderende sutur. Vær forsiktig med å tilstoppe arterien som okkluderende filament vil senere bli tredd gjennom carotis.
- Bruk en 8 x 2 mm lys micro serrafine areterial klemme til klemme CCA distalt for løst bundet silke sutur. Løft forsiktig CCA med pinsett og gjøre en liten langsgående snitt, som proksimalt for ligering sutur sommulig med 3 mm Vannas.
- Træ 12 mm silikonbelagt 6,0 måler nylon okkluderende filament gjennom snitt til å gå inn i arterien lumen, og deretter fremme det noen mm. Løst trekk den andre løse silkesutur rundt spissen av den okkluderende filamentet for å sikre at blodstrømmen ikke presse filamentet ut av CCA, og fjerne det arterielle klemmen.
- Ved første bifurkasjon av CCA inn i den indre halsarterie (ICA) og den ytre halsarterie (ECA), tråden okkluderende filamentet inn i den høyre gren av den første forgreningen til å gå inn i ICA.Advance den okkluderende filamentet 9 til 10,5 mm forbi den andre silkesutur til den venstre arteria carotis interna (ICA).
- Kort tid etter inn i ICA, fremme okkluderende filament i venstre gren på den andre delinger mellom ICA og pterogopalantine arterie (PPA). Visualisering av PPA er usannsynlig så fortsett til du føler en mild motstand med full plassering av okkluderende filament.Løfte ICA med pinsett kan bidra filament å tråden lettere inn i venstre gren av den andre birfurcation. Stram andre silke sutur.
- Snu musen slik at snittet over MCA er synlig. Med LDF utstyr, bekrefter at CBF blokkert gjennom LDF målinger. En vellykket okklusjon er en> 80% reduksjon fra baseline CBF.
- Helt stramme og dobbel-knute andre silke sutur rundt okkluderende filament når riktig posisjon er oppnådd. Hvis det er nødvendig, dytt inn eller trekke ut okkluderende filament å oppnå CBF kriterier for en vellykket okklusjon (f.eks> 80% reduksjon fra baseline CBF).
- Lukk nakke og hode åpning med 6,0 nylon sting.
- Plasser mus i 34 ° C inkubator for varigheten av okklusjon. Anbefalt lengde på okklusjon er 60 min, men dette varierer etter alder, strekkavhengige forskjeller i cerebrovaskulær anatomi, 25 og omfanget av injury ønsket (mild, moderat, alvorlig). Sørg for at dyr gjenvinne bevissthet innenfor minutter av kommer av anestesi.
- Re-bedøve dyrene med isofluran, som beskrevet i trinn 2.3, 5 min før slutten av den forhåndsdefinerte okklusjon periode, åpner skalp snitt og bekrefte at MCA perfusjon er fortsatt redusert ved hjelp transcranial LDF målinger. Dersom CBF ikke blir tilstrekkelig redusert (f.eks <20% baseline CBF), har MCA reperfusert på et tidspunkt i løpet av okklusjon og musen bør utelukkes fra ytterligere eksperimentering.
- Åpne midtlinjen halsen snitt og løst knytte en tredje silkesutur rundt CCA, distalt til den andre silkesutur, men proksimalt til forgreningen CCA å sikre at den ytre halsarterie (ECA) vil forbli levedyktige etter at filamentet er fjernet.
- Klipp eller løse knuten som holder okkluderende filament (dvs. andre silke sutur) og trekke okkluderende filament sakte. Når fjernet, raskt lukketredje silke sutur rundt CCA å redusere tilbakestrømning av blod fra ICA. Dobbelt knute dette sutur og lukk snittet med 6,0 nylon sting.
- Omplassere musen for å kvantifisere nivået av CBF etter 5 minutter av reperfusjon. Vellykket reperfusjon er generelt definert som et CBF på> 50% av basislinje CBF, men som med okklusjon strømning, kan forskere etablere sin egen kriterium. Hvis dyrene oppviser en CBF under 50% av utgangsverdien, er det sannsynlig at MCA er "permanent" okkludert, og representerer således en annen studie utelukkelse kriterium.
- Lukk begge snittene med 6,0 nylon sting. Gi saltvann, bedøvelse (lidokain) og antibiotika i henhold til retningslinjer gnager. Men noen små doser av antibiotika (3 mg / kg av minocyklin) er blitt funnet å være nevrobeskyttende følgende slag. 26
- Etter gjenvinne bevissthet i det oppvarmede kuvøse etter operasjonen, sted mus i en ren, steril buret. Gi fuktet food eller ernærings hydration kosttilskudd gel kosttilskudd og en petriskål med vann som dyrene vil ha begrenset bevegelighet etter hjerneslag. Overvåke dyrene nøye under gjenoppretting for overdreven post-operativ smerte og død.
3. Evans Blå (EB) Injection
- Injisere EB 22 timer etter reperfusjon og skal sirkulere i blodet for 2 timer før ofre og TTC farging.
- Gjør en EB injeksjonsvæske, oppløsning (2% EB i saltvann) og forsiktig bland ved romtemperatur. Filtrer løsningen gjennom filterpapir eller presse gjennom et 0,2 mikrometer filter festet til en liten sprøyte for å fjerne uoppløst EB og oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered mengden av EB som trengs for injeksjon (4 ml / kg kroppsvekt) Tegn den ønskede mengden av fargestoff i en 0,3 cc insulinsprøyte med en 29 gauge nål og sikre at oppløsningen er ved romtemperatur
- Beherske mus med flat bunn rainer. Hold i halen, slik at den laterale venen er uppermost. Laterale årer er plassert på hver side av senterlinjen av halen. Hold tuppen av halen for å holde musen stødig for injeksjon.
- Sett nålen inn i venen ca 3,5 mm, være forsiktig med å perforere venen. Bekreft at nålen er i venen ved å trekke tilbake på sprøyten og leter etter spor av blod.
- Injisere alt fargestoffet i løpet av 1 min. Hvis oppløsningen går inn i venen bør det være minimal motstand når trykk utøves på sprøyten. Bekreft vellykket systemisk venøse administrasjon av EB av en umiddelbar fargeendring i halen, lemmer og øyne av musen.
- Fjern nålen fra halen og press forsiktig med rent gasbind for å stoppe blødningen.
- Begynn timing når muse hud blir blå. La EB å sirkulere i 2 timer for å trenge inn i den svekkede BBB.
4. 2,3,5- trifenyltetrazoliumklorid (TTC) Farging
- Når pulveret er helt oppløst, umiddelbart overføre til en flaske, cover i folie og oppbevares ved 4 ° C. TTC og vev beiset med TTC er lysfølsom.
- Start perfusjon pumpen ved 5 ml / min strømningshastighet med en 60 cc sprøyte fylt med iskald 0,01 M PBS og forbundet med en 27 gauge nål med vinger infusjon. Plasser tuppen av nålen omtrent 0,5 cm inn i den venstre ventrikkel i hjertet og kuttet i høyre atrium. Gradvis utvannet venøs blod skal flyte ut av atrium under perfusjon til veneblod vises fargeløs. Tran perfuse 30 ml 0,01 M fosfatbufret saltløsning (PBS) gjennom hjertet.
- Fjern de olfaktoriske pærene ved å sette inn et rustfritt stål 0,21 mm tykt blad inn i det andre sporet fra den rostrale side av matrisen.
- Fjern cerebellum ved å sette inn et blad i den fjerde spalte fra halesiden av matrisen.
- Sette inn et blad inn i det midtre sporet av de gjenværende spalter i matrisen. Sett de gjenværende blader, jevnt halverer den gjenværende vev for å sikre en mest mulig jevn fordeling av vev under kutting.
- Når alle bladene har blitt satt inn, legge til 1 til 2 dråper av PBS til hjernen for å fukte den.
- Fjern bladets en av gangen fra matrisen begynner med den rostrale regionen. Beholdes de første syv skiver for TTC analyse etter tMCAo. Bruk en liten slikkepott til å nøye overføre skivene fra bladet til TTC-fylt hetteglass.
- Når seksjonene er ordnet på lysbildet, skanne raset ved hjelp av en standard skanner. Sett oppløsningen på minimum 600 dpi for bildeanalyse. Sørg for å inkludere navnet på dyret og en beregning hersker i det skannede bildet.
- Flip over rasetog skanne baksiden for å sikre at alle data er samlet inn.
5. infarktvolum Kvantifisering
- Kvantifisere infarktvolum ved hjelp av en standard bildeanalyse programvare (f.eks ImageJ).
- Skanne bilder med høy oppløsning (f.eks 600 dpi) for tilstrekkelig analyse. Beskjære bilder. Standardisere målestokk for alle bilder som bruker det metriske hersker inkludert i det skannede bildet.
- Beregn det totale volum av den kontralaterale hemisfære ved hjelp av følgende formel. Gjenta denne formel for å beregne det totale volum av den ipsilaterale hemisfæren.
Summen av totalt motsatt halvkule av hver skive x skivetykkelse - Beregne indirekte infarktvolum. . Kontroll for ipsilaterale ødem fra hjerneslag ved å bruke sunn, motsatt halvkule som en kontroll 27. Bruk følgende formel for å beregne indirekte infarktvolum:
Totalt volum av motsatt halvkule -
(Total volume av ipsilaterale halvkule -gjennomsnittlig volum av tre målinger av infarktet)
6. blod-hjerne barrieren (BBB) Integrity Kvantifisering
- For å forberede EB kvantifisering, først veie 2,5 tommers veie båter. Spill vekten og merke to veie båter til hvert dyr: en for ipsilaterale halvkule og en for den kontralaterale halvkule.
- Etter skanning av TTC-farget seksjoner, halvere hver seksjon med et engangs barberblad i ipsilaterale og kontralaterale halvkule. Plasser ipsilaterale halvkuler fra alle 7 seksjoner i en veie båt og ta opp vekten. Gjenta for motsatt halvkule.
- Umiddelbart overføre vekten båtene til en ovn innstilt til 56 ° C i 48 timer.
- Veie de tørkede seksjoner. Overfør begge halvkuler i separate 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Beregne mengden av formamidet nødvendig for hver halvkule (8 ml / g tørr vev), og legge til deres respektive microcentrifuge rør. Formamidet er lyssensitiv og dekker alle formamid behandlede prøver i folie fra dette punktet videre.
- Overfør mikrosentrifugerør i en inkubator innstilt på 56 ° C i ytterligere 48 timer.
- Etter 48 timer, pipette ut det blå supernatanten til et annet sett med merkede mikrosentrifugerør. Skyv vev til bunnen av røret for å maksimalisere volumet av utvunnet supernatant. Hold rørene av supernatant og kast alt vev.
- Forbered eksponensielle serielle fortynninger av EB i formamid for standardkurven. Inkluder en tomme (formamid bare) og deretter 10 eksponentiell løsninger fra 0.125 ug / ml gjennom 64 ug / ml EB i formamide.
- Pipetter 300 ul av fortynninger foretatt for standardkurven inn i en 96-brønns plate. Pipetter 300 ul av supernatanten inn i tilsvarende brønner.
- Mål absorbansen på et spektrofotometer ved 620 nm.
- Sammenlign standardkurve av de EB fortynninger med absorbansen of supernatantprøvene. Den optiske tetthet er direkte proporsjonal med integriteten av BBB.
- Anta at den optiske tetthet av den kontralaterale hemisfære som bakgrunn og bruke formelen (ipsilaterale-kontralaterale) / kontralateralt for å bestemme gangers endring. For nærmere informasjon om statistisk analyse se Martin et al., 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien inkluderte 25 mannlige sveitsiske Webster mus som var 10 uker gamle ved starten av randomisering til RHP (n = 10) eller 21% O 2 (n = 15) grupper. To uker etter den siste RHP eksponering ble kirurgiske prosedyrer utført, med grupper blindet og motvekts mellom dager. Etter tMCAo, døde en mus ved postoperativ utvinning og en mus ble ekskludert fra studien fordi den ikke oppfyller reperfusjon CBF kriteriet. Mus begge utelukket var fra 21% O 2-gruppen. I samsvar med ANKOMME retningslinjer, 28 Tabell 2 viser kirurgiske parametere. Indirekte infarktvolum, hemisfærisk hevelse (dvs. ødem), og Evans blue (EB) extravasations er vist i figur 2. Alle data ble analysert med uparede t-tester (gjennomsnitt, standardavvik vist), og uteliggere oppdaget med en falsk Discovery Rate mindre enn 1% (Graphpad Prism), som fjernes 4 utliggere (2 av 21%, fra 2 RHP) fra EB datasettet.
3) sammenlignet med 21% O 2-behandlede mus (62,6 ± 42,6 mm 3), men denne forskjellen var ikke-signifikante (p = 0,10). Men spådd en a priori Strøm analyse en nødvendig n = 10 per gruppe, som vi ikke oppnå med RHP-behandlede mus etter uteliggere ble fjernet. Dette bør vurderes i utformingen fremtidige eksperimenter med RHP. Det var ingen effekt av RHP den hemisfæriske hevelse, en metrikk som er utledet fra det TTC volumanalyse som kan likestilles med ødem. 6 RHP-behandlede mus oppviste en tendens (p = 0,05) i reduksjon av BBB avbrudd i den ischemiske halvkule normalisert til kontralaterale halvkule. Figur 2D viser en rekke verdier for EB lekkasje for begge behandlingsgruppene.
Figur 1:. Spesialdesignede RHP kamre Øvre panel viser de spesialbygde mengdemålere for individuell overvåkning av luftstrømmen i opptil fire kamre. Luft ugjennomtrengelig rør er vist forlater strømningsmåleren og feste til innløpsporten av den 15 L induksjonskammeret i det nedre panel. Outlet port forblir åpent under RHP å tillate for luftsirkulasjon.
Fig. 2:. RHP reduserer infarktvolum og BBB avbrudd RHP (A) reduserer infarktvolumet med 46% sammenlignet med kontroll mus, men har (B) ingen innvirkning på hemisfærisk svelling utledet fra TTC data (C) i samme dyr, RHP reduserer BBB avbrudd (p = 0,05), som definert av Evans blå lekke normalisert til den kontralaterale hemisfære. (D) Representative TTC flekker fra både RHP-behandlede og 21% O 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkelt eksponering for systemisk hypoksi (dvs. 2 timer på 11% O 2) i mus "forbigående" beskytter hjernen mot tMCAo, 29 betyr at epigenetisk respons på hypoksisk prekondisjonering utfordringen er kortvarige, og baseline fenotype er gjenopprettet innen dager. Gjentatte presentasjoner av hypoksisk prekondisjonering stimulus dramatisk forlenge varigheten av neurobeskyttende fenotype. 6 Mange studier har vist at hyppigheten, størrelsen og varigheten av den repeterende stimulus toget er viktige determinanter av denne respons. For eksempel, er det bare å gjenta den samme intensiteten og varigheten av hypoksi (2 timer på 11% oksygen) 3 ganger per uke (MWF) over 2 uker ikke strekker det terapeutiske vinduet for neurovascular beskyttelse mot tMCAo, 6, men ble tilstrekkelig til å indusere lang- Begrepet iskemisk toleranse i netthinnen. 30 Interessant, selv om 5 eksponeringer til systemisk hypoksi (5 t på 8% O 2 </ Sub>) i avstand fra hverandre seks dager beskyttet mot tMCAo indusert tre dager etter den siste eksponering hypoksiske, neurobeskyttelse gikk tapt dersom 5 hypoksiske eksponeringer ble plassert 3 dager fra hverandre. 31 Årsaken til denne forskjellen er uklar, men kan ha vært grunnet Varigheten av alvorlig hypoksi i forhold til denne protokollen og / eller utilstrekkelig utvinning tid mellom hypoksiske utfordringene i denne alvorlighetsgrad.
Kort sagt, titrering av repeterende hypoksisk utfordringen tvers domener av frekvens, størrelse og varighet, synes kritisk for utvikling av toleranse, mens ikke induserer skade, for ikke å nevne vevsspesifikke og kanskje artsspesifikke effekter. For eksempel 3 av 9 av RHP eksponeringer medføre eksponering for 8% O 2 i 4 timer, men 6 timer på 8% O 2 induserer hippocampus neuronal død. 32 Derfor må det være en streng overholdelse av RHP protokoll med hensyn til varighet og alvorlighetsgrad av hypoksiske eksponeringer å indusere endogenbeskyttelse. Selv om den potensielle effekten av døgnrytmen på preconditioning-indusert beskyttelse trenger videre utforskning, 33 prestert RHP eksponeringer på samme tid på dagen for en bestemt kohort reduserer risikoen for eventuelle konfunderende effekt. I forhold til dose-respons og effekt, skjedde den mest robuste RHP-mediert beskyttelse mot brenn hjerneslag da tMCAo ble indusert to uker etter den siste hypoksisk eksponering, tre i en tid da RHP-behandlet friske mus viser en immundempende fenotype (i Fraværet av iskemisk skade). 7. Denne to ukers tidspunkt kan ikke falle sammen med perioden for maksimal beskyttelse mot andre akutte CNS-skader eller at andre organsystemer. Både RHP-protokollen, og tidsmessige funksjonene i epigenetisk respons, vil utvilsomt trenger optimalisering for hver nye translasjonsforskning bruk.
En av de største begrensninger i tMCAo prosedyren er den heterogene fordeling av infarkt voLumes, som vist ved denne representative datasettet. Pantet sirkulasjon levert av Circle of Willis, leptomeningeal anastomoser og rygg sikkerhet veikryss kan føre til inkonsistente infarktvolum. 34 Variasjoner mellom Circle of Willis i ulike stammer av mus, samt tilstedeværelse og åpenhet av bakre kommunisere arterier, 25 35 kan ytterligere redusere konsistensen av infarktvolum innenfor grupper. Robuste prøvestørrelsene og replikasjon er ofte nødvendig for å produsere konkluderende resultater og bør inngå i utformingen av eksperimentet etter å ha slått tilsvarende. Andre fremgangsmåter for induksjon slag, særlig distale focal ischemisk metoder som okklusjon av MCA primære gren via en Burr hull i side skallen, eller photothrombosis av distale grener av MCA, ofte produsere mindre variasjon i slagvolum. Photothrombotic slag er begrenset, men som de produserer samtidig ekstracellulær og intracellulær ødem, en phenomenon ikke sett i iskemisk slag hos mennesker. 36 Omvendt tMCAos er mer direkte gjeldende for klinisk setting som over 60% av alle hjerneslag hos mennesker oppstår på grunn av obstruksjon av midten cerebral arterie. 37 Endelig anestesi brukes under tMCAo, isofluran , har vist seg å fremkalle nevrobeskyttelse. 38 For å ta hensyn til dette neurobeskyttelse, bør isofluran nivåer være konsistent mellom operasjoner og mellom behandlede og ubehandlede forsøksgrupper, og opprettholdt ved <3% for å redusere potensielle nevrobeskyttende virkning. 39
Tiden er også kritisk for TTC fargeprosessen. Selv om det er stor variasjon i slag litteratur om den tiden der TTC flekker kan utføres etter iskemi, varierende fra fire timer til 7 dager etter hjerneslag, bør 18,40 TTC flekker oppstår på 24 til 48 timer etter hjerneslag for det meste konsekvent og tydelig avgrenset infarktvolum. TTC infarktvolum har beeN funnet å stabilisere 24 timer etter hjerneslag, men etter 48 timer, en strøm av makrofager i den ischemiske hjerne gjør definerer infarktvolum vanskelig. 14,40 Videre farging av hjernevev med TTC må øyeblikkelig følge offer. Forsinke farging vil redusere kvaliteten av flekken på grunn av økt mitokondrie død som følge av dyr døde, ikke hjerneinfarkt. En tilsvarende økning i mitokondriell død vil oppstå hvis hjernen ikke holdes fuktig under innføringen av bladene. Selv om denne protokollen illustrerer tydelig fordelen av infarkt analyse med TTC flekker, kan andre immunohistologiske flekker brukes til å kvantifisere infarktvolum følgende tMCAo. Cresylfiolett eller fluor-jade farging har mindre rigide tidskrav for flekker etter offer, men disse klassiske flekker krever svært tynne snitt oppnådd ved kryostat eller mikrotom, og dermed krever mer tid for integrerende oppsummering og analyse. 14 Videre disse stains kan ikke brukes i forbindelse med EB kvantifisering av BBB avbrudd, slik den er utviklet av andre, 15 eliminerer muligheten for direkte sammenligning mellom infarktvolum og BBB integritet i en gitt hjernen. Det skal bemerkes at RHP-behandlede dyr oppviste typisk rosa, i motsetning til rene hvite volum. 6. For å unngå utvasking av infarkt i RHP-behandlede mus, bruker vi en kortere periode for farging TTC som resulterer i mer rosa friske vevet i motsetning til mørk rød. Evans blå behandlingen kan også bli mørkere infarktområdet så rene hvite infarkter er usannsynlig med dual kvantifisering flekker presenteres i denne protokollen.
For å sammenligne EB kvantifisering innenfor og mellom gruppene, må alle dyr gjennomgå tilsvarende sirkulasjonstider for EB. Andre har injisert EB umiddelbart etter reperfusjon og lov EB å sirkulere i opp til 72 timer, 41 eller ved 4 timer etter tMCAo å sirkulere i 4 timer, 15 som alternative tilnærminger. Mengden av EB som krysser forstyrret BBB og går inn i hjernevevet representerer integralet akkumulering av albumin-bundet fargestoff fra injeksjonstidspunktet til tidspunktet for avlivelse. Fremgangsmåten som beskrives i dette dokumentet viser status for BBB nøyaktig på det tidspunkt mellom 22 og 24 timer av reperfusjon, og kan gå glipp av tidligere eller senere åpninger eller lukkinger av barrieren. Derimot er ansatt ved Wang et al metode. viser status for BBB i 72 timer etterfulgt av slag, inkludert alle endringer i BBB status i løpet av den 3 dagers post-slagtiden 42 Hverken protokollen er bedre eller verre.; Selv om det gjenstår en risiko for "manglende" en forbigående åpning av BBB ved hjelp av kortere sirkulasjonstider, kan det undersøkere for å identifisere spesifikke tidsmessige trekk ved BBB patofysiologi og å koble den med andre metoder, slik som vist her. Andre har kombinert TTC og EB ved å injisere EB intracardially 1 min etter transcardial perfusjon. 18 Men dette møttehod produsert inkonsekvente resultater og er en langt mer komplisert prosedyre enn den protokoll som er beskrevet ovenfor.
En av de mest lovende fremtidige retninger for RHP er translasjonsforskning anvendelsen av denne preconditioning protokollen til andre sykdomstilstander. Vend hypoksiske eksponeringer har vist seg å være beskyttende i proinflammatoriske CNS andre enn iskemi forhold. I en rottemodell av Alzheimers, to uker med 4 timers daglig eksponering til hypobar hypoksi reduserte nedskrivninger av minne oppbevaring og tap av kortikale nevroner etter intracerebrale injeksjoner av beta-amyloid. 43 Intermittent hypoksi (2 uker med 15 timers daglig eksponering til hypobar hypoksi ) ble også funnet å være beskyttende i rotter etter L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) infusjon, en modell for Parkinsons som svekker striatale dopaminergiske transmisjon. 44 Imidlertid er disse modellene av Alzheimers og Parkinsons bare undersøkt kortsiktige effekter avhypoksisk prekondisjonering. 43,44 Gransker den langsiktige neuroprotection indusert av RHP kan være en fruktbar fremtidige retningen for forskning. Videre kan neurobeskyttelse indusert av RHP strekker seg til forbedret BBB integritet i musemodeller av Alzheimers, som kan analyseres med EB. 45 Den doble TTC og EB analyse ville være enda mer nyttig i Parkinsons modellen som det fremkaller striatale lesjoner 46 og BBB avbrudd, 47 som kan kvantifiseres med TTC 48 og EB, 49 henholdsvis. Samlet RHP er en enkel, kraftig form for prekondisjonering med stor translasjonsforskning potensial som det unikt induserer langsiktig, anti-inflammatorisk, og nervecellene effekter. Den doble kvantifisering av TTC og EB kan også lett brukes til andre sykdomstilstander som involverer mitokondrie avbrudd, celledød, og BBB lekkasje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
