Abstract
Modelli animali sperimentali di ictus sono strumenti preziosi per la comprensione ictus patologia e sviluppare strategie di cura più efficaci. Un protocollo 2 settimane per ripetitivo precondizionamento ipossico (RHP) induce una protezione a lungo termine contro il sistema nervoso (CNS) lesione centrale in un modello murino di ictus ischemico focale. RHP consiste 9 esposizioni stocastici all'ipossia che variano sia in durata (2 o 4 ore) e l'intensità (8% e 11% O 2). RHP riduce volumi infarto, barriera emato-encefalica (BBB) rottura, e la risposta infiammatoria post-ictus per settimane dopo l'ultima esposizione all'ipossia, suggerendo una induzione a lungo termine di un fenotipo CNS-protettivo endogeno. La metodologia per il duplice quantificazione del volume dell'infarto e BBB perturbazione è efficace nel valutare la protezione neurovascolare nei topi con RHP o altri neuroprotectants putativi. Maschio adulto topi Swiss Webster sono stati condizionati da RHP o esposizioni di durata equivalente al 21% O
Introduction
Come la principale causa di disabilità adulta e la quarta causa di morte, ictus è una delle patologie più debilitanti di fronte alla popolazione adulta degli Stati Uniti. 1 I modelli animali di ictus permettono di indagine sperimentale di nuovi metodi per ridurre il danno ischemico e migliorare il recupero post-ictus. Una strada nuova per questo tipo di ricerca traslazionale è precondizionamento. Precondizionamento è l'uso intenzionale di uno stimolo non dannosi per ridurre i danni da una successiva e più grave, lesioni. 2 Hypoxic precondizionamento ha dimostrato di produrre cambiamenti pleiotropici nel cervello che forniscono protezione contro ictus sia in vivo e in vitro . 3 Tuttavia, una singola esposizione all'ipossia offre solo neuroprotezione a breve termine, inducendo a meno di 72 ore di tolleranza nei confronti dell'ischemia in topi adulti. 4 anche dopo quattro settimane di 14 hr esposizioni quotidiane all'ipossia ipobarica, Lin et al. found che neuroprotezione è stato sostenuto solo per una settimana. 5 precondizionamento ipossico ripetitiva (RHP) è caratterizzato da variazioni stocastiche in frequenza, la durata e l'intensità delle esposizioni ipossiche. A differenza di una singola sfida precondizionamento, RHP induce un fenotipo cerebroprotective che dura fino a otto settimane nei topi. 6 RHP ridotti volumi infarto, barriera emato-encefalica (BBB) rottura, infiammazione vascolare, e dei leucociti diapedesi per settimane dopo l'esposizione ipossica finale . RHP particolare ha ridotto l'infiammazione nel cervello ischemico attraverso la riduzione delle cellule T, monociti, macrofagi e le popolazioni, pur mantenendo popolazioni di cellule B nell'emisfero ischemico. 7, infatti, RHP indotto un fenotipo immunosoppressivo nei topi prima di eventuali lesioni del sistema nervoso centrale, tra cui l'ictus. Cellule B RHP-trattati isolati da RHP trattati topi sani mostravano un fenotipo antinfiammatorio unico, con una sottoregolazione sia presentazione dell'antigene e la produzione di anticorpi. Ilriduzione complessiva pro-infiammatorie meccanismi immunitari adattivi rende RHP una metodologia eccellente per indurre immunosoppressione endogena non solo per le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale-specifici, ma anche modelli di infortunio o malattia sistemica che includono una patologia pro-infiammatoria.
RHP riduce sia il volume dell'infarto e BBB rottura dopo un transitorio mezzo occlusione dell'arteria cerebrale (tMCAo). I modelli animali di ictus, come comunemente usato tMCAo, migliorano notevolmente la comprensione della fisiopatologia di ictus, nonché la progettazione di neurotherapeutics più efficaci. Prima sviluppato da Koizumi et al., 1986, 8 la procedura tMCAo è un metodo ampiamente utilizzato per indurre ictus nei roditori e uno dei metodi preferiti per indagare infiammazione seguente riperfusione. Poiché i metodi per tMCAo evolvono, l'uso più recente di filamenti silicone rivestite ridurre ulteriormente il rischio di emorragia subaracnoidea rispetto ad altri modelli 9,10 </ Sup> e migliorare l'affidabilità, anche se purtroppo tMCAo produce spesso una grande variazione dei volumi di infarto. 11-13 La maggior parte di questi studi delineano regioni infarto in sezioni di cervello coronali con la colorazione 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (TTC), considerato un gold standard per la quantificazione infarto, perché è un modo semplice e poco costoso per produrre vivide, risultati replicabili. TTC serve come substrato delle deidrogenasi presenti nei mitocondri. Quando fettine cerebrali sono esposti alla soluzione TTC, TTC è selettivamente preso in cellule viventi in cui il suo prodotto di riduzione non solubile, formazano, precipita ad un colore rosso intenso nei mitocondri vitali. A causa della disfunzione mitocondriale nel tessuto ischemico, questo tessuto rimane bianca, consentendo la differenziazione dei tessuti danneggiati e sani. 14
RHP riduce anche perturbazione BBB nell'emisfero ischemico. 6 Pertanto, il duplice quantificazione dell'integrità BBB all'interno dello stesso bpiogge il volume dell'infarto-based TTC determinazioni 15 potrebbe fornire informazioni utili sul pieno efficacia di protezione endogena, e potenziali relazioni causali tra interruzione BBB e infarto negli animali non trattati e trattati. L'afflusso di sangue periferico attraverso un BBB perturbato, secondaria a ictus, aumenta popolazioni leucocitarie, citochine pro-infiammatorie, lo stress ossidativo, vasogenico e trasformazione emorragica nell'emisfero ischemico, in ultima analisi, aumentando i tassi di infezione e mortalità nei pazienti con ictus ischemico . 16,17 Un metodo comune per misurare BBB perturbazione nei modelli animali è attraverso la quantificazione del blu di Evans (EB) perdita di colorante nel cervello. 15,18-21 EB si lega selettivamente all'albumina sierica, una proteina globulare (PM = 65 kDa) che non attraversa la BBB negli animali illesi. 22 A seguito di ictus ischemico, EB infiltra il cervello, e fluorescenza a 620 nm, permettendo per la misurazione della densità ottica within parenchima feriti perfuso. 22 La densità ottica è direttamente proporzionale alla permeabilità della BBB quando EB è stato lavato fuori della vascolarizzazione corticale post mortem da transcardiac perfusione. Con la trasformazione immediata di cervelli TTC-macchiati negli animali con la somministrazione EB, sia il volume dell'infarto e BBB disagi possono essere efficacemente quantificati. Va notato, tuttavia, che danno neuronale e BBB perturbazione non sono processi concomitanti nel cervello post-ictus, 23,24 così la selezione del tempo di sacrificio è una considerazione importante.
Il protocollo che segue i dettagli il metodo RHP, il metodo tMCAo per indurre una occlusione arteriosa temporaneo che modelli di mezza occlusioni dell'arteria cerebrale nei pazienti umani, ei metodi istologici doppi per la determinazione neurali e vascolari endpoint lesioni ictus. TTC misura morte cellulare e danni ai tessuti cumulativo, permettendo la quantificazione di un infarto vol generaleume, mentre EB prevede la quantificazione del danno emisferica BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso UT Southwestern Medical Center, che si attiene dal National Institutes for Health (NIH) La politica per l'utilizzo degli animali sperimentali.
1. ripetitivo ipossico precondizionamento
- Design personalizzato quattro misuratori di portata sui regolatori di gas e allegare alle camere di induzione 15 L standard con tubi in PVC per consentire gas compresso da ossigeno (O 2) serbatoi di fluire nelle camere tramite una porta di ingresso. Vedere attrezzature e materiali per ulteriori dettagli su progettazione personalizzata.
- Dividete i topi in 2 gruppi: ripetitiva ipossico precondizionamento (RHP) del Gruppo, che ricevono le esposizioni al 8% e il 11% O 2, e il gruppo di controllo, che ricevono le esposizioni al 21% O 2 (aria ambiente) contemporaneamente. Vedere la Tabella 1 per le variazioni di frequenza, intensità (8 e 11% O 2 e 21% O 2), e la durata (2 o 4 ore) delle esposizioni RHP. </ Li>
- Rimuovere il coperchio superiore del filtro di ogni gabbia e posizionare la gabbia, con bottiglie cibo e acqua intatti, nelle camere connessa alle rispettive O 2 serbatoi. Chiudere e fissare il coperchio della camera.
- Aprire la valvola principale del gas per i serbatoi e impostare il flusso iniziale per ogni camera di induzione a 2 L per min (LPM) per i primi 5 minuti di esposizione. Ridurre la portata di 1 LPM per il rimanente dell'esposizione.
- Alla fine dell'esposizione, ridurre il flusso di 0 LPM e chiudere la valvola del gas per i serbatoi.
- Aprire i coperchi da camera e sostituire il coperchio superiore del filtro in ogni gabbia. Mettere le gabbie in alloggiamento standard fino alla prossima esposizione ipossica.
- Spray giù ogni camera di induzione con NPD (Steris) o un equivalente / disinfettante deodorante dopo ogni uso.
- Esporre sia 21% e RHP topi allo stesso tempo del giorno nel corso di due settimane come descritto nella Tabella 1.
2. TransientOcclusione dell'arteria cerebrale media (tMCAo)
- Vedere discussione per ulteriori dettagli sui tempi di ictus a seguito di esposizione finale RHP.
- Preparare un intervento chirurgico di lavoro asettico. Pulire posto di lavoro circostante con il 70% di etanolo o un disinfettante equivalente e autoclave tutti gli strumenti chirurgici.
- Impostare lo strumento laser flussimetria Doppler (LDF) per misurare variazioni relative flusso ematico cerebrale (CBF). Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C. Accendere l'incubatore a 34 ° C.
- Anestetizzare topi con una breve esposizione ad una miscela di 4% isoflurano / 70% NO 2/30% O 2 in una piccola camera di induzione. Confermare anestesia corretta pizzicando leggermente la zampa. Se il mouse ritira la sua zampa, ritorno il mouse nella camera di induzione e proseguire l'esposizione isoflurano.
- Rimuovere i topi dalla camera di induzione dell'anestesia e inserire velocemente il naso del mouse nella cono. Aprire il flusso di gas per il cono, chiudendo portata ai anesThesia camera di induzione.
- Senza modificare l'NO 70 miscela al 2% / 30% O 2 gas, fissare isoflurano al 1,8% come dose di mantenimento per il resto della procedura. La respirazione deve rimanere lento e regolare durante tutta la procedura, ma se il respiro diventa rapido e superficiale, aumentare la dose isoflurano. Dose di mantenimento può variare tra produzione materiale e animale utilizzato per l'esperimento.
- Utilizzando un microshaver, radere i capelli sulla regione temporale tra l'angolo dell'occhio e dell'orecchio nonché linea mediana ventrale del collo. Rimuovere l'eccesso di pelliccia e applicare il lubrificante oculare con un tampone di cotone sterile per mantenere le cornee si secchi durante la procedura. Pulire zona incisione con tamponi imbevuti di alcool e tampone Providone iodio con un tampone di cotone sterile per mantenere condizioni asettiche.
- Somministrare analgesici secondo le linee guida chirurgiche roditori.
- Effettuare una incisione attraverso la pelle temporale tra l'occhio e l'orecchio.Esporre il muscolo temporale. Utilizzando chirurgiche micro-forbici, tagliare il legamento muscolo temporale alla cresta temporale all'interno dell'area di bianco striatura muscolare.
- Premere delicatamente la massa muscolare lateralmente con una pinza di visualizzare l'arteria cerebrale media (MCA) attraverso il cranio. Dopo incisione del muscolo temporale, l'area può riempirsi di sangue. Usare delicatamente un batuffolo di cotone per tamponare le emorragie potenziale.
- Obiettivo la punta della sonda LDF all'area MCA. Registrare la nave scelta come questa zona varia tra i topi.
- Tenere il LDF in luogo e filo con il cranio, fino a un flusso stabile di globuli rossi viene letta e registrare questo valore come la CBF basale. Ideale CBF basale su un laser flussimetria Doppler sono> 600 flusso, ma questo varia a seconda del produttore. Se basale CBF è <400 flusso, è più probabile da una vena, o un posizionamento incompleta della sonda sul vaso target registrazione flusso.
- Dopo basale CBF è stabilito, repositisul mouse in modo che il collo è esposto. Sostenere la testa e tenere il mouse in anestesia costante dal musetto.
- Effettuare una incisione mediana ventrale da appena sotto la mandibola alla clavicola.
- Utilizzando pinze, Blunt sezionare tutto fascia superficiale per esporre l'arteria carotide comune sinistra (CCA). Separare il CCA da tessuto connettivo e il nervo vago.
- Definitivamente legare il CCA con una sutura 6.0 seta. Posizionare la sutura legatura come prossimale possibile per consentire uno spazio sufficiente per occludere il posizionamento del filamento.
- Loop e vagamente legare un secondo di seta 6.0 sutura intorno distale CCA alla sutura occlusione. Fare attenzione a non ostruire l'arteria come il filamento occlusione sarà poi threaded attraverso la carotide.
- Utilizzare un micro serrafine morsetto areterial luce 8 x 2 mm per serrare il distale CCA per la sutura di seta loosely-legato. Sollevare delicatamente la CCA con una pinza e fare una piccola incisione longitudinale, come prossimale alla sutura legatura comepossibile con 3 Vannas mm.
- Infilare un siliconato 6.0 calibro nylon occlusione filamento 12 millimetri attraverso l'incisione per inserire il lume delle arterie, e poi avanzare di qualche mm. Avvitare senza bloccare la seconda sutura di seta allentato attorno alla punta del filamento occlusione per assicurare il flusso sanguigno non spingere il filamento dal CCA e rimuovere il morsetto arteriosa.
- Alla prima biforcazione del CCA nell'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide esterna (ECA), infilare il filamento occlusore nel ramo destro della prima biforcazione ad entrare nel ICA.Advance filamento occlusione 9-10,5 mm oltre la seconda sutura di seta in arteria carotide interna sinistra (ICA).
- Poco dopo essere entrati in ICA, far avanzare il filamento occlusione nel ramo di sinistra alla seconda biforcazione tra l'ACI e l'arteria pterogopalantine (PPA). Visualizzazione della PPA è improbabile quindi procedere fino a quando fa resistenza mite con il pieno inserimento del filamento occlusione.Sollevamento della ICA con una pinza può aiutare il filamento infilare più facilmente nel ramo sinistro del secondo birfurcation. Stringere la seconda sutura di seta.
- Girare il mouse in modo l'incisione sopra il MCA è visibile. Con l'attrezzatura LDF, verificare che il CBF è bloccato attraverso letture LDF. Una occlusione successo una riduzione> 80% da CBF basale.
- Completamente stringere e doppio nodo della seconda sutura di seta attorno al filamento occlusione al raggiungimento della posizione corretta. Se necessario, premere leggermente in o tirare il filamento occlusione di raggiungere i criteri CBF per occlusione di successo (ad esempio riduzione> 80% rispetto al basale CBF).
- Chiudere l'apertura del collo e la testa con punti di sutura 6.0 nylon.
- Topi posto nel 34 ° C incubatore per la durata dell'occlusione. Lunghezza consigliata di occlusione è di 60 minuti, ma questo varia per età, le differenze ceppo-dipendente di anatomia cerebrovascolare, 25 e l'estensione della injury desiderato (lieve, moderata, grave). Assicurarsi che gli animali riprendano conoscenza all'interno minuti di venuta fuori anestesia.
- Re-anestetizzare gli animali con isoflurano, come descritto al punto 2.3, 5 minuti prima della fine del periodo di occlusione predefinito, aprire l'incisione del cuoio capelluto e confermare che la perfusione MCA è ancora ridotto utilizzando letture LDF transcranica. Se CBF non è sufficientemente ridotta (ad esempio <20% al basale CBF), la MCA ha riperfuso ad un certo punto durante l'occlusione e il mouse deve essere escluso da ulteriori sperimentazioni.
- Aprire l'incisione del collo linea mediana e legarlo senza una terza sutura di seta intorno al CCA, distale alla seconda sutura di seta ma prossimale alla biforcazione CCA per garantire che l'arteria carotide esterna (ECA) rimarrà vitali dopo il filamento viene rimosso.
- Tagliare o sciogliere il nodo che contiene il filamento occlusione (cioè, secondo sutura di seta) e ritirare il filamento occlusione lentamente. Una volta rimosso, rapidamente chiudere ilterzo sutura di seta attorno al CCA per ridurre al minimo il riflusso di sangue dal ICA. Doppio nodo questa sutura e chiudere l'incisione con punti di sutura 6.0 nylon.
- Riposizionare il mouse per quantificare il livello di CBF dopo 5 min di riperfusione. Riperfusione successo è generalmente definito come CBF> 50% del valore basale CBF, ma, come con il flusso di occlusione, gli investigatori possono stabilire la propria criterio. Se gli animali mostrano una CBF inferiore al 50% della loro linea di base, è probabile che il MCA è 'permanente' occlusa, e quindi rappresenta un altro criterio di esclusione studio.
- Chiudere le due incisioni con punti di sutura 6.0 nylon. Fornire salina, anestetico (lidocaina), e gli antibiotici secondo le linee guida di roditori. Tuttavia, alcune piccole dosi di antibiotici (3 mg / kg di minociclina) sono stati trovati ad essere tratto neuroprotettivo seguenti. 26
- Dopo aver ripreso conoscenza in incubatrice riscaldato dopo l'intervento, posto topi in un ambiente pulito, gabbia sterile. Fornire foo inumiditoidratazione Integratori Alimentari gel d o nutrizionali e una capsula di Petri di acqua come gli animali saranno hanno limitato la mobilità dopo l'ictus. Monitorare gli animali da vicino durante il recupero per eccessivo dolore postoperatorio e la morte.
3. Blu di Evans (EB) Iniezione
- Iniettare EB 22 ore dopo riperfusione e deve circolare nel sangue per 2 ore prima del sacrificio e la colorazione TTC.
- Preparare una soluzione iniettabile EB (2% in soluzione salina EB) e mescolare delicatamente a temperatura ambiente. Filtro soluzione attraverso carta da filtro o spingere attraverso un filtro 0,2 micron attaccato ad una piccola siringa per rimuovere non disciolto EB e conservare a temperatura ambiente.
- Preparare la quantità necessaria di EB iniettabile (4 ml / kg di peso corporeo) Disegnare la quantità desiderata di colorante in una siringa da insulina 0,3 cc con un ago calibro 29 e assicurarsi che la soluzione sia a temperatura ambiente
- Trattenere mouse usando piatta restrainer fondo. Tenere la coda in modo che la vena laterale è uppermost. Vene laterali si trovano su entrambi i lati della mezzeria della coda. Tenere la punta della coda per mantenere costante il mouse per l'iniezione.
- Inserire l'ago nella vena di circa 3,5 millimetri, facendo attenzione a non forare la vena. Verificare che l'ago sia in vena disegnando indietro sulla siringa e alla ricerca di tracce di sangue.
- Iniettare tutta colorante nel corso di 1 min. Se la soluzione sta nella vena ci dovrebbe essere sempre minor resistenza, la pressione viene applicata alla siringa. Conferma di successo la somministrazione venosa sistemica di EB da un cambiamento di colore immediato coda, arti, e gli occhi del mouse.
- Rimuovere l'ago dalla coda e delicatamente applicare pressione con garza pulita al fine di fermare l'emorragia.
- Inizia tempi quando la pelle del topo diventa blu. Lasciare che la EB di circolare per 2 ore di penetrare il BBB indebolita.
4. 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione
- Una volta che la polvere si è completamente sciolta, trasferire immediatamente ad una bottiglia, copertina in carta stagnola, e conservare a 4 ° C. TTC e tessuti colorati con TTC sono sensibili alla luce.
- Avviare la pompa di perfusione a 5 ml / min di portata con una siringa da 60 cc riempito con ghiaccio freddo 0,01 M PBS e collegato ad un calibro 27 alata infusione ago. Posizionare la punta dell'ago circa 0,5 cm nel ventricolo sinistro del cuore e tagliare l'atrio destro. Progressivamente sangue venoso diluito deve fuoriuscire dell'atrio durante la perfusione finché appare sangue venoso incolore. Transcardially profumato 30 ml 0,01 M tampone fosfato salino (PBS) attraverso il cuore.
- Rimuovere bulbi olfattivi inserendo un acciaio 0,21 millimetri lama spessa nel secondo alloggiamento dalla rostrale della matrice.
- Rimuovere il cervelletto inserendo una lama nel quarto alloggiamento dalla caudale della matrice.
- Inserire una lama nella fessura mezzo rimanenti slot nella matrice. Inserire le rimanenti lame, uniformemente biseca la restante tessuto per garantire la più uniforme distribuzione del tessuto durante il taglio.
- Una volta che tutte le lame sono state inserite, aggiungere 1-2 gocce di PBS al cervello per inumidire.
- Rimuovere la lamas uno alla volta dalla matrice che inizia con la regione rostrale. Mantenere i primi 7 fette di analisi TTC dopo tMCAo. Utilizzare una piccola spatola per trasferire accuratamente le fette dalla lama alla fiala TTC-riempita.
- Quando le sezioni sono disposte sul vetrino, la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner standard. Impostare la risoluzione a un minimo di 600 dpi per l'analisi delle immagini. Assicurati di includere il nome dell'animale e un righello metrico nell'immagine acquisita.
- Capovolgere il vetrinoe la scansione del lato posteriore per garantire che tutti i dati sono raccolti.
5. Infarto Volume Quantificazione
- Quantificare il volume dell'infarto utilizzando un software di analisi di immagine standard (ad esempio, ImageJ).
- Scansione di immagini ad alta risoluzione (ad esempio, 600 dpi) per l'analisi adeguata. Ritagliare le immagini. Standardizzare la scala per tutte le immagini utilizzando il righello metrico incluso nel l'immagine acquisita.
- Calcolare il volume totale dell'emisfero controlaterale utilizzando la seguente formula. Ripetere questa formula per calcolare il volume totale dell'emisfero ipsilaterale.
Somma di emisfero controlaterale totale di ogni fetta di spessore x fetta - Calcolare il volume dell'infarto indiretta. . Controllo per l'edema ipsilaterale dal tratto utilizzando il sano, emisfero controlaterale come controllo 27 Utilizzare la seguente formula per calcolare il volume dell'infarto indiretta:
Il volume totale di emisfero controlaterale -
(Volum totalee di emisfero ipsilaterale medi di equipaggio volume di 3 misure di infarto)
6. barriera emato-encefalica (BBB) Integrità Quantificazione
- Per preparare EB quantificazione, prima pesare 2,5 pollici pesa barche. Registrare il peso ed etichettare due pesare barche per ciascun animale: uno per l'emisfero ipsilaterale e uno per l'emisfero controlaterale.
- Dopo la scansione delle sezioni TTC-colorate, bisecare ogni sezione con una lama di rasoio usa e getta in emisferi ipsilaterale e controlaterale. Posizionare gli emisferi omolaterale di tutte le 7 sezioni in una barca pesare e registrare il peso. Ripetere l'operazione per l'emisfero controlaterale.
- Trasferire immediatamente le barche peso a un set forno per 56 ° C per 48 ore.
- Pesare sezioni secchi. Trasferire entrambi gli emisferi in provette da 1,5 ml microcentrifuga separati.
- Calcolare la quantità di formammide necessaria per ciascun emisfero (8 ml / g di tessuto secco), e aggiungere al rispettivo microcentrifugtubi e. Formammide è sensibile alla luce e coprire tutti i campioni formammide trattati in fogli da questo punto in poi.
- Trasferire i microprovette di un incubatore a 56 ° C per un altro 48 ore.
- Dopo la 48 ore, pipetta il surnatante blu in un altro set di microprovette etichettati. Spingere il tessuto alla parte inferiore del tubo per massimizzare il volume di supernatante estratto. Mantenere i tubi di surnatante e smaltire tutti i tessuti.
- Preparare diluizioni seriali esponenziali di EB in formammide per la curva standard. Include uno vuoto (formammide solo) e poi 10 soluzioni esponenziali da 0.125 ug / ml a 64 ug / ml di EB in formammide.
- Pipettare 300 ml di diluizioni effettuate per la curva standard in una piastra a 96 pozzetti. Dispensare 300 ml di surnatante in pozzetti.
- Misurare l'assorbanza su uno spettrofotometro a 620 nm.
- Confrontare la curva standard delle diluizioni EB con l'assorbanza of i campioni surnatante. La densità ottica è direttamente proporzionale alla integrità della BBB.
- Si supponga che la densità ottica dell'emisfero controlaterale come sfondo e utilizzare la formula (ipsilaterale-controlaterale) / controlaterale per determinare cambiamenti piega. Per ulteriori informazioni su analisi statistiche vedere Martin et al., 2010. 18
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo studio ha incluso 25 topi maschi Swiss Webster che erano 10 settimane di età all'inizio di randomizzazione in RHP (n = 10) o il 21% O 2 (n = 15) gruppi. Due settimane dopo l'esposizione finale RHP, sono stati eseguiti interventi chirurgici, con i gruppi in cieco e controbilanciato tra i giorni. Dopo tMCAo, 1 topo morto durante il recupero post-operatorio e 1 mouse è stato escluso dallo studio perché non soddisfa il criterio di riperfusione CBF. Entrambi i mouse sono stati esclusi dal gruppo il 21% O 2. In accordo con le linee guida ARRIVA, 28 tabella 2 mostra i parametri chirurgici. Volumi indiretti infarto, gonfiore emisferica (cioè, edema) e il blu di Evans (EB) stravaso sono illustrati nella Figura 2. Tutti i dati sono stati analizzati con t-test non appaiati (media, deviazione standard in figura), e valori anomali rilevati con un Discovery Rate False meno dell'1% (GraphPad Prism), che ha rimosso 4 outlier (2 dal 21%, 2 da RHP) dal set di dati EB.
3) rispetto al 21% O 2 topi -treated (62,6 ± 42,6 millimetri 3), ma questa differenza era non significativa (p = 0.10). Tuttavia, un a priori un'analisi Potenza previsto a n = 10 per gruppo richiesto, che non abbiamo raggiunto con i topi RHP trattati dopo i valori anomali sono stati rimossi. Questo dovrebbe essere considerato nella progettazione di esperimenti futuri con RHP. Non c'era alcun effetto di RHP sul rigonfiamento emisferica, una metrica derivata dall'analisi di volume TTC che potrebbe essere identificato con edema. 6 topi trattati RHP mostrato una tendenza (p = 0,05) nella riduzione della BBB perturbazione all'interno dell'emisfero ischemico normalizzato per nell'emisfero controlaterale. figura 2D mostra un intervallo di valori per perdite EB per entrambi i gruppi di trattamento.
Figura 1:. Camere RHP su misura progettato Pannello superiore raffigura i misuratori di portata fuoriserie per il monitoraggio individuale dei flussi d'aria in un massimo di quattro camere. Aria tubo impermeabile è mostrato lascia il flussometro e fissaggio alla porta di ingresso della camera di induzione 15 L nel pannello inferiore. Porta di uscita rimane aperto durante RHP per consentire la circolazione dell'aria.
Figura 2:.. RHP riduce i volumi infarto e BBB perturbazione RHP (A) riduce i volumi di infarto del 46% rispetto ai topi di controllo, ma ha (B) senza influire sul rigonfiamento emisferica derivata dai dati TTC (C) Negli stessi animali, RHP riduce BBB perturbazione (p = 0,05) come definito da Evans blu fuoriuscire normalizzata per l'emisfero controlaterale. (D) macchie Rappresentante TTC sia RHP trattati e 21% O 2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Una singola esposizione ad ipossia sistemica (ad esempio, 2 ore del 11% O 2) in topi "transitoriamente" protegge il cervello da tMCAo, 29 cioè la risposta epigenetico alla sfida precondizionamento ipossico è di breve durata, e il fenotipo di base viene ripristinata entro giorni. Presentazioni ripetitive dello stimolo precondizionamento ipossico estendono notevolmente la durata del fenotipo neuroprotettivo. 6 Molti studi hanno dimostrato che la frequenza, ampiezza e durata del treno stimolo ripetitivo sono fattori determinanti di questa risposta. Ad esempio, è sufficiente ripetere la stessa intensità e la durata di ipossia (2 ore 11% di ossigeno) per 3 volte a settimana (MWF) oltre 2 settimane non abbia esteso la finestra terapeutica per la protezione neurovascolare da tMCAo, 6, ma è stato sufficiente ad indurre a lungo termine tolleranza ischemica nella retina. 30 Curiosamente, sebbene 5 esposizioni a ipossia sistemica (5 hr dell'8% O 2 </ Sub>) distanziate 6 giorni a parte protetti contro tMCAo indotta 3 giorni dopo l'ultima esposizione ipossica, neuroprotezione era perduto se le 5 esposizioni ipossiche sono stati collocati tre giorni di distanza. 31 Il motivo di questa differenza non è chiara, ma potrebbe essere stato dovuto alla durata del grave ipossia relativa a questo protocollo e / o tempo di recupero insufficiente tra sfide ipossiche di questa severità.
In breve, la titolazione della sfida ipossico ripetitivo attraverso i domini di frequenza, ampiezza e durata, sembra fondamentale per lo sviluppo di tolleranza, mentre non indurre lesioni, per non parlare degli effetti tessuto-specifici e, forse, specie-specifici. Ad esempio, 3 di 9 delle esposizioni RHP implicano l'esposizione a 8% O 2 per 4 ore, anche se 6 hr dell'8% O 2 induce la morte neuronale hippocampal. 32 Pertanto, ci deve essere una stretta aderenza al protocollo RHP quanto riguarda durata e la gravità delle esposizioni ipossiche per indurre endogenaprotezione. Anche se l'effetto potenziale del ritmo circadiano sulla protezione precondizionamento indotto necessita di ulteriori esplorazioni, 33 in bonis RHP alla stessa ora del giorno per un particolare coorte riduce il rischio di un potenziale effetto di confondimento. In termini di dose-risposta e l'efficacia, la più robusta protezione RHP mediata da ictus focale verificato quando il tMCAo stata indotta 2 settimane dopo l'esposizione ipossica finale, 3 nel momento in cui RHP-trattato topi sani mostrano un fenotipo immunosoppressiva (nel assenza di danno ischemico). 7 Questo punto di tempo due settimane potrebbe non coincidere con il periodo di massima protezione contro altre lesioni acute del sistema nervoso centrale, o in altri organi. Sia il protocollo RHP, e le caratteristiche temporali della risposta epigenetica, senza dubbio bisogno di ottimizzazione per ogni nuovo impiego traslazionale.
Uno dei maggiori limiti della procedura tMCAo è la distribuzione eterogenea di infarto voLumes, come mostrato da questo insieme di dati rappresentativi. La circolazione garanzia fornita dal Circolo di Willis, anastomosi leptomeningee, e dorsale giunzioni collaterali può portare a volumi di infarto inconsistenti. 34 Variazioni tra il circolo di Willis in diversi ceppi di topi, così come la presenza e la pervietà delle arterie posteriori comunicare, 25 , 35 in grado di ridurre ulteriormente la consistenza dei volumi di infarto all'interno dei gruppi. Dimensioni del campione robusti e replica sono spesso necessarie per produrre risultati definitivi e dovrebbero essere inclusi nel disegno sperimentale dopo l'accensione di conseguenza. Altri metodi di induzione ictus, metodi ischemici focali particolarmente distali, come l'occlusione del ramo MCA primaria attraverso un foro nel cranio bava laterale o photothrombosis di rami distali del MCA, spesso producono meno la variazione della gittata sistolica. Colpi Photothrombotic sono limitati, tuttavia, in quanto producono simultanea edema extracellulare e intracellulare, un phenomenon non visto in ictus ischemici negli esseri umani. 36 Al contrario, tMCAos sono più direttamente applicabili alla clinica come oltre il 60% di tutti gli ictus negli esseri umani si verificano a causa di ostruzione dell'arteria cerebrale media. 37 Infine, l'anestesia utilizzato durante tMCAo, isoflurano , ha dimostrato di indurre neuroprotezione. 38 Al fine di tenere conto di questa neuroprotezione, livelli isoflurano devono essere coerenti tra ambulatori e tra i gruppi sperimentali trattati e non trattati, e mantenuta a <3% per ridurre i potenziali effetti neuroprotettivi. 39
Il tempo è anche critico nel processo di colorazione TTC. Anche se vi è una grande variazione nella letteratura ictus circa il tempo in cui TTC colorazione può essere eseguita dopo ischemia, variabile da 4 ore a 7 giorni post-stroke, 18,40 TTC colorante deve verificarsi in 24 a 48 ore dopo l'ictus per la maggior volumi infarto coerenti e chiaramente delineati. Volumi infarto TTC hanno apen trovato per stabilizzare 24 ore dopo l'ictus, ma dopo 48 ore, un afflusso di macrofagi nel cervello ischemico rende definire il volume dell'infarto difficile. 14,40, inoltre, la colorazione del tessuto cerebrale con TTC dovrebbe immediatamente seguire sacrificio. Ritardare colorazione diminuisce la qualità della macchia a causa di un aumento di morte mitocondriale derivante dalla morte degli animali, non infarto cerebrale. Un simile aumento nella morte mitocondriale si verificherà se il cervello non è tenuto umido durante l'inserimento delle lame. Mentre questo protocollo illustra chiaramente il vantaggio di analisi infarto con TTC colorazione, altre macchie immunoistochimiche possono essere utilizzati per quantificare il volume dell'infarto seguente tMCAo. Cresyl viola o colorazione fluoro-giada hanno requisiti di tempo meno rigidi per la colorazione dopo il sacrificio, ma queste macchie classici richiedono sezioni molto sottili ottenuti per criostato o microtomo, e quindi richiedono più tempo per la somma e l'analisi integrativa. 14 Inoltre, queste stains non possono essere utilizzati in combinazione con EB quantificazione di BBB perturbazione, sviluppato da altri, 15 eliminando la possibilità di confronto diretto tra volume dell'infarto e integrità BBB in un determinato cervello. Va notato che gli animali tipicamente esposti rosa RHP-trattati rispetto ai volumi bianchi puri. 6 Per evitare washout di infarto in topi RHP-trattati, usiamo un periodo più breve per colorazione TTC che si traduce in più rosa tessuto sano in contrapposizione al rosso scuro. Blu di Evans trattamento può anche oscurare l'area infartuale infarti bianchi così pure sono improbabili con la colorazione duplice quantificazione presentata in questo protocollo.
Per confrontare EB quantificazione all'interno e tra i gruppi, tutti gli animali devono essere sottoposti a orari di circolazione equivalenti per EB. Altri hanno iniettato EB subito dopo riperfusione e ha permesso EB di circolare per un massimo di 72 ore, 41 o alle 4 ore post-tMCAo di circolare per 4 ore, 15 come alternative approcci. La quantità di EB che attraversa la BBB interrotto ed entra tessuto cerebrale rappresenta l'accumulo integrale di colorante legata all'albumina dal momento dell'iniezione al momento del sacrificio. Così, il metodo descritto in questo documento rivela lo stato della BBB precisamente il tempo tra 22 e 24 ore di riperfusione, e può perdere precedenti o successive aperture o chiusure di barriera. Al contrario, il metodo impiegato da Wang et al. rivela lo stato della BBB per 72 ore dopo l'ictus, compresi tutti i cambiamenti di stato BBB in quel periodo tre giorni post-ictus 42 Né protocollo è migliore o peggiore.; anche se permane un rischio di "mancante" un'apertura transitorio della BBB utilizzando tempi di circolazione più breve, consente agli investigatori di identificare specifiche caratteristiche temporali di BBB fisiopatologia e da abbinare con altri metodi, come mostrato qui. Altri hanno combinato TTC e EB iniettando EB intracardiaca 1 min dopo perfusione transcardial. 18 Tuttavia, questo ha incontratohod prodotto risultati inconsistenti ed è una procedura molto più complicato rispetto al protocollo descritto sopra.
Una delle direzioni future più promettenti per RHP è l'applicazione di traslazione di questo protocollo precondizionamento in altri stati di malattia. Esposizioni ipossiche intermittenti sono stati trovati per essere protettivo in condizioni pro-infiammatorie del SNC diversi ischemia. In un modello murino della malattia di Alzheimer, 2 settimane di 4 hr esposizioni quotidiane all'ipossia ipobarica ridotto la perdita di valore di conservazione della memoria e perdita di neuroni corticali dopo iniezioni intracerebrali di beta-amiloide. 43 ipossia intermittente (2 settimane di 15 ore esposizioni giornaliere a ipossia ipobarica ) è risultato anche essere protettivo nei ratti dopo L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) per infusione, un modello di Parkinson, che compromette la trasmissione dopaminergica striatale. 44 Tuttavia, questi modelli di Alzheimer e di Parkinson indagato solo il effetti a breve termine diprecondizionamento ipossico. 43,44 Indagare la neuroprotezione a lungo termine indotta da RHP può essere una direzione futura proficua per la ricerca. Inoltre, la neuroprotezione indotta da RHP può estendersi ad una migliore integrità BBB in modelli murini del morbo di Alzheimer, che potrebbe essere analizzato con la EB. 45 La doppia analisi TTC e EB sarebbe ancora più utile nel modello di Parkinson in quanto induce lesioni striatali 46 e BBB interruzione, 47 che può essere quantificato rispettivamente con TTC 48 e EB, 49. Nel complesso RHP è un semplice, potente forma di precondizionamento con grande potenziale traslazionale quanto induce unicamente a lungo termine, anti-infiammatori, e gli effetti neuroprotettivi. La doppia quantificazione di TTC e EB potrebbe anche essere facilmente applicato ad altri stati patologici che coinvolgono interruzione mitocondriale, la morte cellulare, e perdite BBB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
- Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
- Gidday, J. M. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 437-448 (2006).
- Stetler, R. A., et al. Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease: paradigms and clinical significance. Prog Neurobiol. 114, 58-83 (2014).
- Bernaudin, M., et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expression of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, erythropoietin and VEGF, in the adult mouse brain. J Cereb Blood Flow Metab. 22 (4), 393-403 (2002).
- Lin, A. M., Dung, S. W., Chen, C. F., Chen, W. H., Ho, L. T. Hypoxic preconditioning prevents cortical infarction by transient focal ischemia-reperfusion. Ann N Y Acad Sci. 993, 168-178 (2003).
- Stowe, A. M., Altay, T., Freie, A. B., Gidday, J. M. Repetitive hypoxia extends endogenous neurovascular protection for stroke. Ann Neurol. 69 (6), 975-985 (2011).
- Monson, N. L., et al. Repetitive hypoxic preconditioning induces an immunosuppressed B cell phenotype during endogenous protection from stroke. J Neuroinflammation. 11, 22 (2014).
- Koizumi, J. Y. Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Liu, F., McCullough, L. D. The middle cerebral artery occlusion model of transient focal cerebral ischemia. Methods Mol Biol. 1135, 81-93 (2014).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. J Vis Exp. (69), (2012).
- Lin, X., et al. Surgery-related thrombosis critically affects the brain infarct volume in mice following transient middle cerebral artery occlusion. PLoS One. 8 (9), e75561 (2013).
- Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
- Kuraoka, M., et al. Direct experimental occlusion of the distal middle cerebral artery induces high reproducibility of brain ischemia in mice. Exp Anim. 58 (1), 19-29 (2009).
- Feng Zhang, J. C. Animal Models of Acute Neurolgoical Injuries II. Springer Protocol Handbooks. Chen, X. X. J., Xu, Z. C., JZ, W. ang , Humana Press. 93-98 (2012).
- Ludewig, P., et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 inhibits MMP-9-mediated blood-brain-barrier breakdown in a mouse model for ischemic stroke. Circ Res. 113 (8), 1013-1022 (2013).
- Sandoval, K. E., Witt, K. A. Blood-brain barrier tight junction permeability and ischemic stroke. Neurobiol Dis. 32 (2), 200-219 (2008).
- Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiol Dis. 16 (1), 1-13 (2004).
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Yasmina Martin, C. A., Maria Jose Piedras, A. K. Evaluation of Evans Blue extravasation as a measure of peripheral inflammation. Protocol Exchange. , (2010).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 739 (1-2), 88-96 (1996).
- Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. J Vis Exp. (69), e50019 (2012).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods Mol Biol. 763, 369-382 (2011).
- Chen, Z. L., et al. Neuronal death and blood-brain barrier breakdown after excitotoxic injury are independent processes. J Neurosci. 19 (22), 9813-9820 (1999).
- Abulrob, A., Brunette, E., Slinn, J., Baumann, E., Stanimirovic, D. In vivo optical imaging of ischemic blood-brain barrier disruption. Methods Mol Biol. 763, 423-439 (2011).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).
- Xu, L., et al. Low dose intravenous minocycline is neuroprotective after middle cerebral artery occlusion-reperfusion in rats. BMC Neurol. 4, 7 (2004).
- Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
- Drummond, G. B., Paterson, D. J., McGrath, J. C. ARRIVE: new guidelines for reporting animal research. J Physiol. 588 (Pt 14), 2517 (2010).
- Miller, B. A., et al. Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion). Neuroreport. 12 (8), 1663-1669 (2001).
- Zhu, Y., Zhang, Y., Ojwang, B. A., Brantley, M. A., Gidday, J. M. Long-term tolerance to retinal ischemia by repetitive hypoxic preconditioning role of HIF-1alpha and heme oxygenase-1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (4), 1735-1743 (2007).
- Cui, M., et al. Decreased extracellular adenosine levels lead to loss of hypoxia-induced neuroprotection after repeated episodes of exposure to hypoxia. PLoS One. 8 (2), e57065 (2013).
- Prass, K., et al. Hypoxia-induced stroke tolerance in the mouse is mediated by erythropoietin. Stroke. 34 (8), 1981-1986 (2003).
- Svorc, P., Benacka, R. The effect of hypoxic myocardial preconditioning is highly dependent on the light-dark cycle in Wistar rats. Exp Clin Cardiol. 13 (4), 204-208 (2008).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17 (4), 738-743 (1986).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Lesak, M. D., Howieson, D. B., Loring, D. W. Neuropsychological Assessement. , Oxford University Press. 195-197 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. T. T. C. fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion. J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).
- Wang, Z., Leng, Y., Tsai, L. K., Leeds, P., Chuang, D. M. Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia: the roles of HDAC and MMP-9 inhibition. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 52-57 (2011).
- Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
- Goryacheva, A. V., et al. Adaptation to intermittent hypoxia restricts nitric oxide overproduction and prevents beta-amyloid toxicity in rat brain. Nitric Oxide. 23 (4), 289-299 (2010).
- Lin, A. M., Chen, C. F., Ho, L. T. Neuroprotective effect of intermittent hypoxia on iron-induced oxidative injury in rat brain. Exp Neurol. 176 (2), 328-335 (2002).
- Paul, J., Strickland, S., Melchor, J. P. Fibrin deposition accelerates neurovascular damage and neuroinflammation in mouse models of Alzheimer's disease. J Exp Med. 204 (8), 1999-2008 (2007).
- Deumens, R., Blokland, A., Prickaerts, J. Modeling Parkinson's disease in rats: an evaluation of 6-OHDA lesions of the nigrostriatal pathway. Exp Neurol. 175 (2), 303-317 (2002).
- Lee, H., Pienaar, I. S. Disruption of the blood-brain barrier in Parkinson's disease: curse or route to a cure. Front Biosci (Landmark Ed. 19, 272-280 (2014).
- Jenkins, B. G., et al. Non-invasive neurochemical analysis of focal excitotoxic lesions in models of neurodegenerative illness using spectroscopic imaging). J Cereb Blood Flow Metab. 16 (3), 450-461 (1996).
- Chen, X., Lan, X., Roche, I., Liu, R., Geiger, J. D. Caffeine protects against MPTP-induced blood-brain barrier dysfunction in mouse striatum. J Neurochem. 107 (4), 1147-1157 (2008).
