Abstract
Des modèles animaux expérimentaux de course sont des outils précieux pour la compréhension de la pathologie course et élaborer des stratégies de traitement plus efficaces. Un protocole 2 de semaine pour répétitif préconditionnement hypoxique (RHP) induit une protection à long terme contre les blessures du système nerveux central (SNC) dans un modèle de souris d'accident vasculaire cérébral ischémique focal. RHP se compose de 9 stochastiques exposition à l'hypoxie qui varient à la fois dans la durée (2 ou 4 heures) et l'intensité (8% et 11% de O 2). RHP réduit les volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) la perturbation, et la réponse inflammatoire post-AVC pendant des semaines après la dernière exposition à l'hypoxie, suggérant une induction à long terme d'un phénotype SNC-protection endogène. La méthodologie pour la quantification de double volume de l'infarctus et de rupture de la BHE est efficace dans l'évaluation de la protection neurovasculaire chez des souris avec RHP ou d'autres neuroprotecteurs putatifs. Souris mâles adultes Swiss Webster ont été préconditionnés par RHP ou expositions d'une durée équivalente à 21% O
Introduction
Comme la première cause de handicap des adultes et la quatrième cause de décès, accident vasculaire cérébral est l'un des états pathologiques les plus débilitantes face à la population adulte des États-Unis. 1 Les modèles animaux d'AVC permettent pour une étude expérimentale de nouvelles méthodes de réduction de la lésion ischémique et améliorer la récupération post-AVC. Une nouvelle avenue pour une telle recherche translationnelle est préconditionnement. Préconditionnement est l'utilisation intentionnelle d'un stimulus non dommageable pour réduire les dommages causés par une suite, et plus grave, de blessure. 2 hypoxique préconditionnement a été montré pour produire des changements pléiotropiques dans le cerveau qui assurent une protection contre la course à la fois in vivo et des études in vitro . 3 Cependant, une seule exposition à l'hypoxie ne propose que la neuroprotection court terme, induisant moins de 72 heures de la tolérance contre l'ischémie chez la souris adulte. 4 Même après quatre semaines de 14 h expositions quotidiennes à l'hypoxie hypobare, Lin et al. found que neuroprotection n'a été maintenue pendant une semaine. 5 préconditionnement hypoxique répétitive (RHP) est caractérisée par des variations stochastiques fréquence, la durée et l'intensité des expositions hypoxiques. Contrairement à un défi de préconditionnement unique, RHP induit un phénotype cérébroprotecteur qui dure jusqu'à huit semaines chez la souris. 6 RHP réduit volumes d'infarctus, barrière hémato-encéphalique (BHE) perturbation, l'inflammation vasculaire, et la diapédèse des leucocytes pour semaines après l'exposition hypoxique finale . RHP spécifiquement réduit l'inflammation dans le cerveau ischémique en réduisant les lymphocytes T, les monocytes, et les populations de macrophages, tout en maintenant les populations de cellules B dans l'hémisphère ischémique. 7 En fait, RHP induit un phénotype immunosuppressive chez les souris avant toute lésion du SNC, y compris les accidents vasculaires cérébraux. Les cellules B-RHP isolées de souris traitées sain RHP traitées présentaient un phénotype anti-inflammatoire unique, avec une régulation à la baisse à la fois de la présentation d'antigène et la production d'anticorps. Leréduction globale des mécanismes immunitaires adaptatives pro-inflammatoires rend RHP une excellente méthode pour induire une immunodépression congénitale non seulement pour les maladies inflammatoires du système nerveux central spécifiques, mais également des modèles de blessures ou de maladies systémiques qui comprennent une pathologie pro-inflammatoire.
RHP réduit à la fois le volume de l'infarctus et rupture de la BHE après une occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO). Les modèles animaux d'AVC, comme l'couramment utilisés tMCAO, améliorer considérablement la compréhension de la physiopathologie de la course, ainsi que la conception de neurothérapeutiques plus efficaces. Première développé par Koizumi et al., En 1986, 8 la procédure tMCAO est une méthode largement utilisée d'induire AVC chez les rongeurs et l'une des méthodes privilégiées pour enquêter sur l'inflammation qui suit la reperfusion. Comme les méthodes de tMCAO évoluent, l'utilisation plus récente de filaments revêtus de silicone réduire davantage le risque d'hémorragie sous-arachnoïdienne par rapport aux autres <9,10/ Sup> et améliorer la fiabilité, mais malheureusement tMCAO produit souvent une grande variation du volume de l'infarctus. 11 à 13 La plupart de ces études délimiter des régions d'infarctus dans les sections coronales de cerveau par coloration avec du chlorure de 2,3,5- triphényltétrazolium (TTC), considéré comme un étalon-or pour l'infarctus quantification, car il est un moyen simple et peu coûteux à produire vives, les résultats reproductibles. TTC sert de substrat des déshydrogénases présents dans les mitochondries. Lorsque des tranches de cerveau sont exposés à la solution TTC, TTC est prise de manière sélective dans des cellules vivantes où son produit de réduction non-soluble, formazan, précipite à une couleur rouge foncé dans les mitochondries viables. En raison de la dysfonction mitochondriale dans le tissu ischémique, ce tissu reste blanche, permettant la différenciation des tissus endommagés et en bonne santé. 14
RHP réduit également BBB perturbation dans l'hémisphère ischémique. 6 Par conséquent, la double quantification de BBB intégrité au sein de la même bpluies que le volume de l'infarctus base-TTC déterminations de 15 fournirait des informations utiles sur la pleine efficacité de la protection endogène, et les relations de cause à effet possibles entre rupture de la BHE et d'infarctus chez les animaux traités et non traités. L'afflux de sang périphérique à travers un BBB perturbé, secondaire à un AVC, augmente les populations de leucocytes, les cytokines pro-inflammatoires, stress oxydatif, oedème vasogénique et transformation hémorragique dans l'hémisphère ischémique, finalement, l'augmentation des taux d'infection et de mortalité chez les patients ayant subi un AVC ischémique . 16,17 Un procédé courant de rupture de la BHE de mesure dans des modèles animaux se fait par la quantification de bleu d'Evans (EB) de fuite de colorant dans le cerveau. 15,18-21 EB se lie sélectivement à l'albumine sérique, une protéine globulaire (PM = 65 kDa) qui ne traverse pas la BHE chez les animaux non lésés. 22 Après un AVC ischémique, EB infiltre le cerveau, et émet une fluorescence à 620 nm, ce qui permet pour la mesure de la densité optique within le parenchyme blessés perfusé. 22 La densité optique est directement proportionnelle à la perméabilité de la BBB lorsque EB a été lavé de la vascularisation corticale post-mortem par perfusion transcardiaque. Avec la transformation immédiate des cerveaux TTC colorées chez l'animal avec l'administration EB, à la fois le volume de l'infarctus et rupture de la BHE peuvent être efficacement quantifiés. Il convient de noter, toutefois, que les lésions neuronales et rupture de la BHE sont pas des processus concomitants dans le cerveau post-AVC, 23,24 sorte que la sélection du temps de sacrifice est une considération importante.
Le protocole qui suit détaille la méthode RHP, la méthode tMCAO pour induire une occlusion artérielle temporaire qui modèles intermédiaires occlusions de l'artère cérébrale chez des patients humains, et les méthodes à double histologiques pour déterminer neuronaux et vasculaires extrémités des blessures de course. TTC mesure la mort cellulaire et des lésions tissulaires cumulative, ce qui permet la quantification d'un infarctus volume globalume, tandis EB fournit pour la quantification hémisphérique de dommages Bureau.
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Protocol
NOTE: Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'UT Southwestern Medical Center qui demeure par les Instituts nationaux de la santé politique (NIH) pour l'utilisation des animaux d'expérimentation.
1. répétitive hypoxique préconditionnement
- Conception sur mesure quatre débitmètres sur les régulateurs de gaz et fixez à la norme 15 L induction chambres avec des tubes en PVC pour permettre au gaz comprimé à partir de l'oxygène (O 2) réservoirs de circuler dans les chambres via un port d'entrée. Voir équipements et matériaux pour plus de détails sur la conception personnalisée.
- Diviser souris en 2 groupes: répétitive hypoxique préconditionnement (RHP) Groupe, qui reçoivent les expositions à 8% et 11% d'O 2 et le groupe de contrôle, qui reçoivent des expositions à 21% O 2 (air ambiant) simultanément. Voir le tableau 1 pour les variations de la fréquence, l'intensité (8 et 11% de O 2 ou O 2 21%) et la durée (2 ou 4 h) de l'exposition RHP. </ Li>
- Retirer le couvercle de chaque cage du filtre haut et placer la cage, avec des bouteilles d'eau et de nourriture intacte, dans les chambres reliées à leurs réservoirs respectifs O 2. Fermer et verrouiller le couvercle de la chambre.
- Ouvrez le robinet de gaz principal pour les chars et régler le débit initial pour chaque chambre d'induction à 2 L par minute (LPM) pour les 5 premières minutes d'exposition. Réduire le débit à 1 LPM pour le reste de l'exposition.
- À la fin de l'exposition, de réduire le débit à 0 LPM et fermer le robinet de gaz pour les réservoirs.
- Ouvrez les couvercles des chambres et remplacer le couvercle supérieur du filtre sur chaque cage. Placez les cages dans le logement standard jusqu'à ce que l'exposition hypoxique prochaine.
- Vaporiser vers le bas chaque chambre d'induction avec NPD (Steris) ou un désinfectant équivalent / désodorisant après chaque utilisation.
- Expose à la fois 21% et souris RHP au même moment de la journée au cours de deux semaines, comme décrit dans le tableau 1.
2. transitoireCerebral Artery Occlusion Moyen (tMCAO)
- Voir discussion pour plus de détails sur le calendrier de la course suite à une exposition de RHP finale.
- Préparer un milieu de travail aseptique de la chirurgie. Lieu de travail environnant propre avec 70% d'éthanol ou un désinfectant équivalent et autoclave tous les outils chirurgicaux.
- Mettre en place l'instrument laser Doppler (LDF) pour mesurer les changements relatifs dans le flux sanguin cérébral (CBF). Allumez le coussin chauffant à 37 ° C. Allumez l'incubateur à 34 ° C.
- Anesthésier les souris par une brève exposition à un mélange de 4% d'isoflurane / 70% NO 2/30% de O 2 dans une petite chambre d'induction. Confirmez anesthésie appropriées en pinçant légèrement la patte. Si la souris retire sa patte, retourner la souris vers la chambre d'induction et de continuer l'exposition isoflurane.
- Retirer les souris de la chambre d'anesthésie d'induction et insérer rapidement le nez de la souris dans le cône de nez. Ouvrez le flux de gaz vers le cône de nez, fermant flux aux anessie chambre d'induction.
- Sans changer les 70% NO 2 O mélange de gaz 2/30 de%, isoflurane fixer à 1,8% que la dose d'entretien pour le reste de la procédure. La respiration doit rester lente et régulière tout au long de la procédure, mais si la respiration devient rapide et superficielle, augmenter la dose de l'isoflurane. La dose d'entretien peut varier entre la fabrication de l'équipement et des animaux utilisés dans l'expérience.
- Utilisation d'un microshaver, raser les cheveux sur la région temporale entre le coin de l'œil et l'oreille ainsi que la ligne médiane ventrale du cou. Enlever l'excès de fourrure et appliquer du lubrifiant oculaire avec un coton-tige stérile pour garder les cornées de se dessécher durant la procédure. Essuyer la zone d'incision avec des tampons d'alcool et écouvillon providone-iode avec un coton-tige stérile pour maintenir des conditions aseptiques.
- Administrer des analgésiques selon les directives chirurgicales rongeurs.
- Faire une incision à travers la peau temporel entre l'oeil et l'oreille.Exposer le muscle temporal. Utilisation de micro-ciseaux chirurgicaux, couper le ligament muscle temporal à la crête temporale dans la zone de blanc strié muscle.
- Poussez délicatement la masse musculaire latéralement avec une pince pour visualiser l'artère cérébrale moyenne (MCA) à travers le crâne. Après incision du muscle temporal, la zone peut se remplir de sang. Utiliser doucement un coton-tige pour endiguer toute hémorragie potentielle.
- Cibler la pointe de la sonde de LDF à la zone MCA. Enregistrez le navire choisi comme cette zone varie entre souris.
- Maintenez la LDF en place et rincer avec le crâne jusqu'à ce qu'un rouge flux de globules stable est lu et enregistrer cette valeur comme CBF de base. Idéal CBF base sur un laser Doppler sont> 600 flux, mais cela peut varier avec le fabricant. Si la ligne de base CBF est <400 flux, l'enregistrement de flux est le plus susceptible d'une veine à proximité, ou un placement incomplète de la sonde sur le vaisseau cible.
- Après base CBF est établie, repositisur la souris de sorte que le col est exposée. Soutenir sa tête et de garder la souris sous anesthésie constante de la coiffe.
- Faire une incision médiane ventrale juste en dessous de la mandibule à la clavicule.
- En utilisant des pinces, Blunt disséquer tous aponévrose superficielle pour exposer l'artère carotide commune gauche (CCA). Séparer CCA du tissu conjonctif et le nerf vague.
- Permanence ligaturer le CCA avec une suture de soie 6.0. Placer la suture proximale ligature comme possible de laisser suffisamment de place pour occlure placement du filament.
- Boucle et vaguement attachent une seconde soie 6.0 suture autour de la CCA distale à la suture d'occlusion. Veillez à ne pas obstruer l'artère comme le filament d'occlusion sera ensuite enfilé à travers la carotide.
- Utilisez une pince micro serrafine areterial 8 x 2 mm pour serrer la lumière distale CCA à la suture de soie vaguement lié. Soulevez doucement la CCA avec une pince et faire une petite incision longitudinale, comme à proximité de la suture de ligaturepossible avec 3 mm Vannas.
- Enfiler une jauge de 6,0 mm 12 d'occlusion filament de nylon revêtu de silicium à travers l'incision pour entrer dans la lumière de l'artère, puis avancer de quelques mm. Serrer légèrement la deuxième suture de soie lâche autour de la pointe du filament d'occlusion pour assurer l'écoulement de sang ne poussez pas le filament de la CCA et retirer la pince artérielle.
- A la première bifurcation de la CCA dans l'artère carotide interne (ACI) et l'artère carotide externe (CEA), enfiler le filament d'occlusion dans la branche droite de la première bifurcation à entrer dans le ICA.Advance le filament d'occlusion 9 à 10,5 mm passé le deuxième fil de suture de soie dans l'artère carotide interne gauche (ICA).
- Peu de temps après être entré dans l'ICA, avancer le filament d'occlusion dans la branche de gauche à la deuxième bifurcation entre l'ICA et l'artère pterogopalantine (PPA). Visualisation de la PPA est peu probable alors procéder jusqu'à ce que vous sentez une légère résistance en pleine placement du filament d'occlusion.La levée de l'ICA avec une pince peut aider le filament d'enfiler plus facilement dans la branche gauche de la deuxième birfurcation. Serrer la deuxième suture de soie.
- Tournez la souris pour l'incision sur le MCA est visible. Avec l'équipement de LDF, confirmer que la CBF est bloqué par des lectures de FDL. Une occlusion réussie est une réduction de CBF référence> 80%.
- Serrer complètement et double-noeud de la deuxième suture de soie autour du filament d'occlusion lorsque la position correcte est obtenue. Si nécessaire, pousser légèrement ou tirez sur le filament d'occlusion pour atteindre critères CBF pour une occlusion succès (par exemple une diminution du niveau de référence CBF> 80%).
- Fermez l'ouverture du cou et de la tête avec des sutures de nylon 6.0.
- La place les souris dans les 34 ° C incubateur pendant toute la durée de l'occlusion. La longueur recommandée de l'occlusion est de 60 min, mais cela varie de l'âge, les différences de souches dépendant de l'anatomie vasculaire cérébral, 25 et l'étendue de injury souhaité (léger, modéré, sévère). Assurez-vous que les animaux reprennent conscience dans les minutes à venir hors de l'anesthésie.
- Re-anesthésier les animaux avec de l'isoflurane, comme décrit dans l'étape 2.3, 5 min avant la fin de la période d'occlusion pré-défini, ouvrir l'incision du cuir chevelu et de confirmer que la perfusion MCA est toujours réduite en utilisant des lectures de FDL transcrânienne. Si CBF est pas suffisamment réduit (par exemple <20% de base CBF), le MCA a reperfusés à un certain moment au cours de l'occlusion et la souris devrait être exclu de toute expérimentation.
- Ouvrir l'incision du col de la ligne médiane et de façon lâche attacher un troisième fil de suture en soie autour de l'ACC, distale par rapport au deuxième fil de suture en soie mais en amont de la bifurcation CCA pour faire en sorte que l'artère carotide externe (CEA) reste viable après que le filament est retiré.
- Couper ou défaire le nœud qui détient le filament d'occlusion (ie, deuxième suture de soie) et retirer le filament d'occlusion lentement. Une fois retiré, fermer rapidement letroisième suture de soie autour de la CCA pour minimiser le reflux de sang de l'ICA. Double-noeud cette suture et fermer l'incision avec des sutures de nylon 6.0.
- Repositionner la souris pour quantifier le niveau de CBF après 5 min de reperfusion. Reperfusion réussie est généralement défini comme un CBF de> 50% du niveau de référence CBF, mais, comme avec les flux de l'occlusion, les enquêteurs peuvent établir leur propre critère. Si les animaux présentent une CBF en dessous de 50% de leur niveau de référence, il est probable que le MCA est 'définitivement' occlus, et représente donc un autre critère d'exclusion de l'étude.
- Fermez les deux incisions avec des sutures de nylon 6.0. Fournir une solution saline, un anesthésique (lidocaïne), et des antibiotiques selon les directives de rongeurs. Toutefois, certaines petites doses d'antibiotiques (3 mg / kg de minocycline) ont été trouvés à être neuroprotecteur course suivante. 26
- Après avoir repris conscience dans l'incubateur chauffé suivant la chirurgie, placez la souris dans une cage propre et stérile. Fournir foo humidifiéd ou nutritionnels hydratation des suppléments alimentaires de gel et une boîte de Pétri d'eau que les animaux auront une mobilité restreinte suite à un AVC. Surveiller de près les animaux lors de la récupération de la douleur et de la mort post-chirurgicale excessive.
3. Bleu Evans (EB) Injection
- Injecter EB 22 heures après la reperfusion et devrait circuler dans la circulation sanguine pendant 2 heures avant le sacrifice et la coloration TTC.
- Faire une solution pour injection EB (EB 2% dans une solution saline) et mélanger délicatement à la température ambiante. solution de filtre à travers un papier filtre ou pousser à travers un filtre de 0,2 um attaché à une petite seringue pour enlever non dissous EB et stocker à température ambiante.
- Préparer la quantité d'EB nécessaire pour injection (4 ml / kg de poids corporel) Dessinez la quantité désirée de colorant dans une seringue à insuline 0,3 cc avec une aiguille de calibre 29 et veiller à ce que la solution est à la température ambiante
- Retenez souris à l'aide de contention fond plat. Tenez la queue de sorte que la nervure latérale est uppla plus éloignée. Nervures latérales sont situées de chaque côté de l'axe de la queue. Maintenez la pointe de la queue de garder la souris stable pour injection.
- Insérez l'aiguille dans la veine d'environ 3,5 mm, en faisant attention de ne pas perforer la veine. Assurez-vous que l'aiguille est dans la veine en tirant sur la seringue et la recherche de traces de sang.
- Injecter la totalité de la teinture au cours de 1 min. Si la solution va dans la veine il devrait y avoir une résistance minimale que la pression est appliquée à la seringue. Confirmez succès administration veineuse systémique de EB par un changement de couleur immédiate dans la queue, des membres et des yeux de la souris.
- Retirez l'aiguille de la queue et appliquer doucement pression en utilisant de la gaze propre afin d'arrêter le saignement.
- Commencer à chronométrer quand la peau de la souris devient bleu. Permettre à l'EB de circuler pendant 2 heures pour pénétrer la BHE affaibli.
4. 2,3,5 triphényltétrazolium Chloride (TTC) Coloration
- Une fois que la poudre est complètement dissoute, transférer immédiatement à une bouteille, couvercle en feuille, et conserver à 4 ° C. TTC et le tissu taché de TTC sont sensibles à la lumière.
- Démarrer la pompe de perfusion à 5 ml / débit min avec une seringue de 60 cc remplis avec de la glace à 0,01 M de PBS froid et raccordé à une aiguille d'injection à ailettes 27 de la jauge. Placez la pointe de l'aiguille d'environ 0,5 cm dans le ventricule gauche du coeur et couper l'oreillette droite. Progressivement sang veineux diluée doit couler de l'oreillette pendant la perfusion jusqu'à ce que le sang veineux apparaît incolore. Transcardiaque perfuser 30 ml 0,01 M tampon phosphate salin (PBS) à travers le cœur.
- Retirer les bulbes olfactifs par insertion d'une lame d'épaisseur 0,21 mm en acier inoxydable dans la deuxième fente depuis le côté rostral de la matrice.
- Retirer le cervelet par insertion d'une lame dans la quatrième fente du côté caudal de la matrice.
- Insérez une lame dans la fente du milieu des créneaux restants dans la matrice. Insérez les lames restantes, uniformément coupant le tissu restant pour assurer le plus, même la distribution des tissus pendant le tranchage.
- Une fois que toutes les lames ont été insérés, ajouter 1 à 2 gouttes de PBS dans le cerveau pour l'humidifier.
- Retirez la lames une à la fois de la matrice en commençant par la région rostrale. Gardez les 7 premières tranches pour l'analyse TTC après tMCAO. Utiliser une spatule pour transférer soigneusement les tranches de la lame dans le flacon TTC-rempli.
- Lorsque les sections sont disposées sur la diapositive, numériser la diapositive en utilisant un scanner standard. Définissez la résolution dans un minimum de 600 dpi pour l'analyse d'image. Veillez à inclure le nom de l'animal et une règle métrique dans l'image numérisée.
- Retournez sur la lameet de numériser l'arrière pour assurer que toutes les données sont collectées.
5. volume de l'infarctus Quantification
- Quantifier le volume de l'infarctus en utilisant un logiciel d'analyse d'image standard (par exemple, ImageJ).
- Numérisation des images à haute résolution (par exemple 600 dpi) pour une analyse adéquate. Recadrage d'images. Uniformiser l'échelle pour toutes les images à l'aide de la règle métrique inclus dans l'image numérisée.
- Calculez le volume total de l'hémisphère controlatéral utilisant la formule suivante. Répétez cette formule pour calculer le volume total de l'hémisphère ipsilatéral.
Somme de l'hémisphère controlatéral total de chaque épaisseur x tranche de tranche - Calculer le volume de l'infarctus indirecte. . Contrôle d'œdème ipsilatéral de course en utilisant le, hémisphère controlatéral comme contrôle 27 Utilisez la formule suivante pour calculer le volume de l'infarctus indirecte:
Le volume total de l'hémisphère controlatéral -
(Volum totale de l'hémisphère ipsilatéral -Moyenne volume de 3 mesures de l'infarctus)
6. barrière hémato-encéphalique (BHE) Intégrité Quantification
- Pour se préparer à EB quantification, d'abord peser 2,5 pouces pèse bateaux. Noter le poids et étiqueter deux bateaux peser pour chaque animal: l'un pour l'hémisphère ipsilatéral et un pour l'hémisphère controlatéral.
- Après avoir numérisé les sections TTC colorées, bissecter chaque section avec une lame de rasoir jetable en hémisphères ipsilatéraux et controlatéraux. Placez les hémisphères ipsilatérales de tous les 7 sections dans un bateau peser et enregistrer le poids. Répétez l'opération pour l'hémisphère controlatéral.
- Transférer immédiatement les bateaux de poids à un ensemble four à 56 ° C pendant 48 heures.
- Peser les sections sèches. Transférer les deux hémisphères dans 1,5 ml microtubes séparés.
- Calculer la quantité de formamide nécessaire pour chaque hémisphère (8 ml / g de tissu sec), et ajouter à leur microcentrifug respectivetubes électroniques. Le formamide est sensible à la lumière et couvrent tous les échantillons de formamide traité en feuilles partir de ce point.
- Transférer les microtubes à un incubateur réglé à 56 ° C pour un autre 48 heures.
- Après 48 h, la pipette le surnageant bleu dans un autre ensemble de microtubes étiquetés. Pousser tissu au fond du tube pour maximiser le volume de surnageant extrait. Gardez les tubes de surnageant et de disposer de tous les tissus.
- Préparer les dilutions exponentielles de EB dans le formamide pour la courbe standard. Inclure une vierges (formamide uniquement) puis 10 solutions exponentielles de 0,125 ug / ml par 64 ug / ml de EB dans le formamide.
- Pipeter 300 ul de dilutions effectuées pour la courbe d'étalonnage dans une plaque à 96 puits. Pipeter 300 ul du surnageant dans les puits correspondants.
- Mesurer l'absorbance au spectrophotomètre à 620 nm.
- Comparer la courbe standard des dilutions EB avec l'absorbance of les échantillons de surnageant. La densité optique est directement proportionnelle à l'intégrité de la BHE.
- Supposons que la densité optique de l'hémisphère controlatéral comme arrière-plan et utiliser la formule (ipsilatéral-controlatéral) / controlatéral pour déterminer facteur de changement. Pour plus de détails sur l'analyse statistique voir Martin et al., 2010. 18
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Representative Results
Cette étude a inclus 25 souris mâles Swiss-Webster qui étaient 10 semaines d'âge au début de la randomisation dans RHP (n = 10) ou 21% 2 (n = 15) des groupes O. Deux semaines après l'exposition finale RHP, les procédures chirurgicales ont été réalisées, avec des groupes et aveuglés contrebalancés entre les jours. Après tMCAO, 1 souris est morte lors de la récupération post-opératoire et une souris a été exclu de l'étude parce qu'il ne respectait pas le critère de reperfusion CBF. Les deux souris étaient exclus du groupe de 21% O 2. Conformément aux lignes directrices ARRIVE, 28 Le tableau 2 montre les paramètres chirurgicaux. Volumes indirects d'infarctus, gonflement hémisphérique (c.-à-oedème), et bleu Evans (EB) extravasations sont présentés dans la figure 2. Toutes les données ont été analysées avec des tests t non appariés (moyenne, écart-type représenté), et les valeurs aberrantes détectées avec une découverte taux de faux moins de 1% (Graphpad Prism), qui a supprimé 4 valeurs aberrantes (2 de 21%, à partir de 2 RHP) de l'ensemble de données EB.
3), comparativement à 21% O 2 de souris -Traité (62,6 ± 42,6 mm 3), mais cette différence était non significative (p = 0,10). Cependant, une analyse a priori de puissance prédit un n = 10 par groupe requis, que nous ne sommes pas parvenus avec les souris RHP-traités après les valeurs aberrantes ont été retirées. Cela devrait être considéré dans la conception de futures expériences utilisant RHP. Il n'y avait aucun effet de RHP sur le gonflement de l'hémisphère, une métrique dérivée de l'analyse du volume TTC qui pourrait être assimilé à un œdème. 6 souris RHP-traités a montré une tendance (p = 0,05) dans la réduction de la rupture de la BHE au sein de l'hémisphère ischémique normalisée à l'hémisphère controlatéral. Figure 2D montre une plage de valeurs pour EB fuite pour les deux groupes de traitement.
Figure 1:. Chambres de RHP conçus sur mesure panneau supérieur représente les débitmètres sur mesure pour le suivi individuel des flux d'air dans un maximum de quatre chambres. Air tube imperméable est représenté quitte le débitmètre et la fixation à l'orifice d'entrée de la chambre d'induction de 15 L dans le panneau inférieur. L'orifice de sortie reste ouvert pendant RHP pour permettre la circulation d'air.
Figure 2:.. RHP réduit volumes d'infarctus et rupture de la BHE RHP (A) réduit les volumes d'infarctus de 46% par rapport aux souris témoins, mais a (B) aucun effet sur le gonflement de l'hémisphère dérivée des données TTC (C) Dans les mêmes animaux, RHP réduit rupture de la BHE (p = 0,05) telle que définie par bleu Evans fuite normalisée à l'hémisphère contralateral. (D) représentant les taches TTC RHP à la fois traitées et 21% de O 2
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Discussion
Une seule exposition à l'hypoxie systémique (soit 2 h de 11% O 2) chez la souris protège "transitoire" le cerveau de tMCAO, 29 signifie la réponse épigénétique à la hypoxique défi préconditionnement est de courte durée, et le phénotype de base est rétablie dans jours. Présentations répétitives de la relance préconditionnement hypoxique étendent considérablement la durée du phénotype neuroprotecteur. 6 De nombreuses études ont montré que la fréquence, l'ampleur et la durée du train de relance répétitive sont des facteurs déterminants de cette réponse. Par exemple, il suffit de répéter la même intensité et la durée de l'hypoxie (2 h de 11% d'oxygène) 3 fois par semaine (MWF) plus de deux semaines n'a pas étendre la fenêtre thérapeutique pour la protection neurovasculaire de tMCAO, 6, mais a été suffisante pour induire terme la tolérance ischémique terme dans la rétine. 30 intéressant, bien que 5 expositions à l'hypoxie systémique (5 h de 8% O 2 </ Sub>) espacé six jours en dehors protégés contre tMCAO induite 3 jours après la dernière exposition hypoxique, la neuroprotection a été perdu si les 5 expositions hypoxiques ont été placés trois jours d'intervalle. 31 La raison de cette différence reste incertaine, mais peut-être en raison de la durée de l'hypoxie sévère par rapport à ce protocole et / ou le temps de récupération insuffisant entre hypoxiques défis de cette gravité.
En bref, le titrage de la provocation hypoxique répétitif dans les domaines de la fréquence, l'ampleur et la durée, semble cruciale pour le développement de la tolérance tout en ne pas induire des blessures, sans parler des effets spécifiques des tissus et peut-être des espèces spécifiques. Par exemple, 3 de 9 des expositions RHP impliquent une exposition à 8% d'O 2 pendant 4 heures, si 6 h de 8% O 2 induit la mort neuronale hippocampique. 32 Par conséquent, il doit y avoir un strict respect du protocole RHP à l'égard de la durée et la gravité des expositions hypoxiques d'induire endogèneprotection. Bien que l'effet potentiel du rythme circadien sur la protection induite préconditionnement convient d'explorer davantage, 33 expositions de la scène RHP au même moment de la journée pour une cohorte particulière réduit le risque d'un effet de confusion potentiel. En termes de dose-réponse et l'efficacité, la protection la plus robuste RHP médiée par accident vasculaire cérébral focal est survenu lorsque le tMCAO a été induite deux semaines suivantes l'exposition hypoxique finale, 3 à un moment où RHP-traité des souris saines présentent un phénotype immunosuppresseur (dans le absence de lésion ischémique). 7 Ce point de temps de 2 semaines peut ne pas coïncider avec la période de protection maximale contre d'autres blessures graves du système nerveux central, ou dans d'autres systèmes d'organes. Tant le protocole RHP, et les caractéristiques temporelles de la réponse épigénétique, seront sans aucun doute besoin d'optimisation pour chaque nouvelle utilisation de translation.
Une des plus grandes limites de la procédure tMCAO est la distribution hétérogène de l'infarctus voLumes, comme le montre cet ensemble de données représentant. La circulation de la garantie fournie par le Cercle de Willis, anastomoses leptoméningées, et dorsale jonctions de garantie peut conduire à des volumes infarctus incompatibles. 34 Variations entre le Cercle de Willis dans différentes souches de souris, ainsi que la présence et la perméabilité des postérieurs artères communicantes, 25 , 35 peut réduire davantage la cohérence des volumes d'infarctus au sein des groupes. La taille des échantillons solides et la réplication sont souvent nécessaires pour produire des résultats concluants et devraient être inclus dans la conception de l'expérience après la mise sous tension en conséquence. D'autres méthodes de course induction, méthodes ischémique focal particulier distales telles que l'occlusion de la branche primaire MCA via un trou de trépan dans le crâne latérale, ou photothrombosis des branches distales du MCA, produisent souvent moins de variation du volume d'éjection. Photothrombotique coups sont limitées, cependant, car ils produisent un œdème intracellulaire et extracellulaire simultanée, un phénoménon pas vu dans les accidents ischémiques cérébraux chez les humains. 36 Inversement, tMCAos sont plus directement applicable à la clinique que plus de 60% de tous les AVC chez les humains se produire en raison de l'obstruction de l'artère cérébrale moyenne. 37 Enfin, l'anesthésie utilisée pendant tMCAO, isoflurane , a été montré pour induire une neuroprotection. 38 Afin de tenir compte de cette neuroprotection, isoflurane niveaux devraient être compatibles entre chirurgies et entre les groupes expérimentaux traités et non traités, et maintenu à <3% afin de réduire ses effets neuroprotecteurs potentiels. 39
Le temps est également critique dans le processus de coloration TTC. Bien qu'il y ait une grande variation dans la course littérature sur le délai dans lequel TTC coloration peut être effectuée après l'ischémie, variant de 4 h à 7 jours post-AVC, 18,40 TTC coloration doit avoir lieu entre 24 et 48 heures après un AVC pour la plupart volumes cohérents et clairement délimitées infarctus. Volumes d'infarctus TTC ont abeillen trouvé pour stabiliser 24 h après l'accident vasculaire cérébral, mais après 48 heures, un afflux de macrophages dans le cerveau ischémique rend définissant le volume de l'infarctus difficile. 14,40 De plus, la coloration des tissus du cerveau avec TTC devrait suivre immédiatement sacrifice. Retarder coloration va diminuer la qualité de la tache en raison de l'augmentation mort mitochondrial résultant de mort de l'animal, pas un infarctus cérébral. Une augmentation similaire de la mort mitochondrial se produira si le cerveau est pas maintenu humide pendant l'insertion des lames. Bien que ce protocole illustre clairement les avantages de l'analyse de l'infarctus avec TTC coloration, d'autres taches immunohistologiques peuvent être utilisés pour quantifier le volume de l'infarctus suivante tMCAO. Le violet de crésyl ou fluoro-jade coloration ont des exigences de temps moins rigides pour la coloration après le sacrifice, mais ces taches classiques nécessitent sections très fines obtenues par cryostat ou microtome, et nécessitent donc plus de temps pour sommation et analyse intégrative. 14 En outre, ces stains ne peuvent pas être utilisés en conjonction avec EB quantification de rupture de la BHE, telle que développée par les autres, 15 éliminant la possibilité d'une comparaison directe entre le volume de l'infarctus et BBB intégrité dans un cerveau donné. Il convient de noter que les animaux généralement exposées rose RHP-traitée par opposition à des volumes d'un blanc pur. 6 Afin d'éviter lavage de l'infarctus chez les souris RHP-traités, nous utilisons une période plus courte pour coloration TTC qui en résulte dans les tissus sains plus rose par opposition au rouge foncé. Evans Bleu traitement peut également assombrir la zone de l'infarctus infarctus blanc si pur est peu probable avec la coloration double de quantification présentée dans ce protocole.
Afin de comparer EB quantification au sein et entre les groupes, tous les animaux doivent subir des temps de circulation équivalentes pour EB. D'autres ont injecté EB reperfusion immédiatement après et a permis EB de circuler jusqu'à 72 h, 41 h ou à 4 post-tMCAO de circuler pendant 4 heures, 15 comme alternativapproches e. La quantité d'EB qui traverse la BHE perturbé et pénètre dans le tissu cérébral représente l'accumulation intégrante de colorant lié à l'albumine, de temps en temps de l'injection de sacrifice. Ainsi, la méthode décrite dans le présent document révèle l'état de la BBB précisément le temps entre 22 et 24 heures de reperfusion, et peut manquer tôt ou plus tard ouvertures ou fermetures de la barrière. Inversement, la méthode employée par Wang et al. révèle l'état de la BBB pendant 72 heures après un AVC, y compris tous les changements dans l'état BBB pendant ce temps trois jours post-AVC 42 Ni protocole est meilleur ou pire. bien qu'il subsiste un risque de "disparus" une ouverture transitoire de la BHE en utilisant des temps de circulation plus court, il permet aux enquêteurs d'identifier les caractéristiques temporelles spécifiques de BBB physiopathologie et de le coupler avec d'autres méthodes, comme indiqué ici. D'autres ont combiné TTC et EB par injection intracardiaque EB 1 min après perfusion transcardial. 18 Toutefois, cette rencontrehod produit des résultats incohérents et est une procédure beaucoup plus complexe que le protocole décrit ci-dessus.
Une des orientations futures les plus prometteuses pour RHP est l'application de translation de ce protocole de préconditionnement à d'autres états pathologiques. Expositions hypoxiques intermittents ont été trouvés à avoir un effet protecteur dans des conditions pro-inflammatoires du système nerveux central autres que l'ischémie. Dans un modèle de rat de la maladie d'Alzheimer, 2 semaines de 4 h d'exposition quotidienne à l'hypoxie hypobare réduit la perte de valeur de conservation de la mémoire et la perte des neurones corticaux après des injections intracérébrales de bêta-amyloïde. 43 hypoxie intermittente (2 semaines de 15 h expositions quotidiennes à l'hypoxie hypobare ) a également été constaté un effet protecteur chez les rats après L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (L-BSO) perfusion, un modèle de la maladie de Parkinson qui altère la transmission dopaminergique du striatum. 44 Cependant, ces modèles de la maladie d'Alzheimer et de Parkinson seulement étudié la effets à court terme depréconditionnement hypoxique. 43,44 Étude de la neuroprotection à long terme induite par RHP peut être une orientation future fructueuse pour la recherche. En outre, la neuroprotection induite par RHP peut étendre à l'amélioration de l'intégrité BBB dans des modèles murins de la maladie d'Alzheimer, qui pourrait être analysé avec l'EB. 45 La TTC et EB analyse double serait encore plus utile dans le modèle de la maladie de Parkinson car il induit des lésions du striatum 46 et BBB perturbations, 47 qui peut être quantifié avec TTC 48 et EB, 49 respectivement. Globalement RHP est une forme simple, puissante de préconditionnement avec un grand potentiel de translation comme il induit unique à long terme, anti-inflammatoire, et des effets neuroprotecteurs. Le double quantification des TTC et EB pourrait également être facilement appliquée à d'autres états pathologiques qui impliquent la perturbation mitochondriale, la mort cellulaire, et la fuite du Bureau.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flowmeters, regulators | VetEquip, Inc | Specialty order | Four flowmeters are attached to 6.0 mm flexible PVC tubing which connects to the inlet port on each induction chamber with a plastic female connector. These flowmeters are bolted to a 6.5" x 1" x 1" metal bar. This metal bar is bolted to a MI-246-P pressure gauge with a DISS outlet. This pressure gauge and flowmeter equipment can be attached to each new gas cylinder with a wrench. |
| 21% O2 tank | AirGas | OX USP200 | |
| 11% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 8% O2 tank | AirGas | Specialty order | |
| 15 L induction chambers | VetEquip | 941454 | |
| Moor Laber Dopper Flow | Moor Instruments | moorVMS-LDF1-HP | 0.8 mm diameter probe |
| High Intensity Illuminator | Nikon | NI-150 | |
| Zoom Stereo Microscope | NIkon | SMZ800 | Other surgical microscopes may be used. |
| Kent Scientific Right Temperature CODA | Kent Scientific Corporation | Discontinued | Recommended replacement is PhysioSuite with RightTemp Temperature Monitoring and Homeothermic Control (Kent Scientific, #PS-RT). |
| Hovabator Incubator | Stromberg's | 2362-E | Our model is the 2362N. 2362E is a later model and includes an electronic thermostat. |
| V010 Anesthesia system | VetEquip | 901807 | Includes: ten foot high-pressure oxygen hose, frame, flowmeter, oxygen flush assembly, vaporizer, breathing circuit, chamber, nosecones, waste gas evacuation tubing and two VapoGuard filters |
| 250 ml isoflurane | Butler Schein | NDC-11695 | |
| D-6 Vet Trim Animal Cordless Trimmer | Andis | #23905 | Replacement blades are available from Andis (#23995) |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-898-867 | |
| Q-tips | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Gauze Pads | Fisher Scientific | 67622 | |
| Surgical drape | Fisher Scientific | GM300 | |
| Silk Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP115 | |
| Nylon Sutures | Look/Div Surgical Specialties | SP185 | |
| Durmont #5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11251-35 | Angled 45° |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| 3 mm Vannas | Kent Scientific Corporation | INS600177 | Straight blade |
| Hartman Hemostats | Fine Scientific Tools | 13002-10 | |
| Occluding filaments | Washington University | Specialty order | Filaments are silicone coated at Washington Univeristy and provided to UTSW facilities for a fee. |
| Evans Blue | Sigma Aldritch | E2129-10G | |
| Filter Paper | Sigma Aldritch | WHA1001150 | 150 mm, circles, Grade 1 |
| Weigh Boats | Fisher Scientific | 02-202-101 | 2.5" diameter |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter Pharmaceutics | 2B1321 | |
| 0.3 cc insulin syringe with 29 gauge needle | Becton Dickinson Labware | 309301 | |
| Flat bottom restrainer | Braintree Scientific | FB M | 2.0" diameter |
| TTC | Sigma | T8877 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| Water Bath | Multiple sellers | Catalog number not available | Scintillation tubes with TTC may be manually held under running warm water as an alternative to the water bath. |
| Styrofoam board | Multiple sellers | Catalog number not available | |
| Large Syringe Kit | PumpSystems Inc | P-SYRKIT-LG | |
| Perfusion Pump | PumpSystems Inc | NE-300 | |
| 60 cc syringe | Fisher Scientific | NC9203256 | |
| 27 gauge winged infusion set | Kawasumi Laboratories, Inc | D3K1-25G 1 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 50-367-126 | |
| Stainless steel spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Alto acrylic 1.0 mm mouse brain, coronal | CellPoint Scientific | Catalog number not available | |
| 0.21 mm stainless steel blades, 25 pk | CellPoint Scientific | Catalog number not available | Reusable cryostat blades are an inexpensive alternative. |
| 4% paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | SC-281692 | |
| Superfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HP Scanjet G4050 | Multiple sellers | Catalog number not available | Other commercial scanners are suitable for this step in the protocol. |
| ImageJ | National Institute of Health | Catalog number not available | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 205U | |
| Precision Compact Oven | Thermo Scientific | PR305225M | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes (Eppendorfs) | Denville Scientific | C2170 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| 96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-9 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek | Catalog number not available |
References
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