I den etterfølgende protokoll beskriver vi en meget enkel måte å isolere Neutrofil Ekstracellulære feller (garn) fra humant fullblod ved å bruke lett tilgjengelige reagenser. Vi viser hvordan de isolerte NET kan brukes i en in vitro adhesjonsassayet med kreftceller.
Nøytrofile Ekstracellulære feller (NETS) har nylig blitt identifisert som en del av nøytrofile er antimikrobielle armamentarium. Bortsett fra deres rolle i bekjempelsen av infeksjoner, har nyere forskning vist at de kan være involvert i mange andre sykdomsprosesser, blant annet kreft progresjon. Isolere rensede NET er et avgjørende element for å tillate studiet av disse funksjonene.
I denne videoen viser vi en forenklet metode for celle gratis NET isolasjon fra humant fullblod ved hjelp av lett tilgjengelige reagenser. Isolerte NET kan deretter brukes til immunfluorescens farging, blotting eller ulike funksjonelle analyser. Dette muliggjør en vurdering av deres biologiske egenskaper i fravær av de potensielle konfunderende effekter av nøytrofile selv.
En densitetsgradient separasjonsteknikk er anvendt for å isolere neutrofiler fra frisk donor helblod. Isolerte nøytrofile blir så stimulert av phorbol 12-myriState 13-acetat (PMA) for å indusere NETosis. Aktiverte neutrofiler blir deretter kastes, og en celle-fri NET lager oppnås.
Vi viser hvordan isolert NET kan brukes i en adhesjonsassayet med A549 humane lungekreftceller. NET lager brukes til å belegge brønnene i en 96-brønners cellekulturplate O / N, og etter å sikre en tilstrekkelig NET monolag dannelse på bunnen av brønnene, CFSE merket A549 celler tilsettes. Festede celler kvantifiseres ved hjelp av et Nikon TE300 fluorescerende mikroskop. I noen brønner, er 1000U DNAse1 lagt 10 min før telling å degradere NET
Nøytrofile ekstracellulære feller (garn) er nylig oppdaget nøytrofile-avledet elementer sammensatt av tråder av ekstracellulært DNA dekorert av hundrevis av proteiner og histoner. De er utskilt av nøytrofile granulocytter i sammenheng med infeksjon og betennelse følgende spesifikke stimuli, og de ble i utgangspunktet anerkjent for å være en del av nøytrofile forsvarsmekanismer mot infeksjoner. De ble først vist seg å fremme fangst av ulike mikrobielle inntrengere som bakterier, virus og sopp 1-3. Fangst av mikroben vil da føre til sin ødeleggelse både direkte av NET-assosierte proteiner 3,4 og indirekte gjennom lokal rekruttering av fagocyttceller 5,6. Rollen til NET imidlertid ikke synes å være begrenset til å være vert forsvar. Mer nylig, har de vist seg å spille en viktig rolle ved autoimmunsykdommer 7,8, trombose 9, graviditet-relaterte lidelser 10 og med kreft progresjon11,12. Følgelig synes det som om NET spiller en viktig rolle i et stort antall forskjellige fysiologiske prosesser. Imidlertid, gitt den nye arten av slike undersøkelser, er det fortsatt mye å bli klarlagt med hensyn til de mekanismer som NET utøver sine effekter. Heri presenterer vi en forenklet metode for isolering av NET i fravær av nøytrofile.
I følgende video, vi demonstrere en forenklet og enkel teknikk for å isolere NET fra humant fullblod. Cellefrie NET kan så brukes i en rekke in vitro eksperimenter inkludert farging, imuunofluorescence, blotting, så vel som en rekke analyser som adhesjon, proliferasjon og migrasjon. Andre protokoller eksisterer 13, 19, men de er som regel lange, komplekse, kostbare og ofte lavt utbytte 13. Denne forenklede protokoll benytter basiske reagenser, og reduserer antallet trinn som kreves for å isolere neutrofiler, og derfor minimalisere lengden av procedure samtidig maksimere utbyttet.
Følgende metode kombinerer forskjellige teknikker for nøytrofil isolasjon som tidligere er beskrevet i litteraturen for å oppnå en enkel protokoll som gir en meget ren prøve av levende nøytrofiler. Som foreslått i litteraturen, er venøst blod ble samlet i EDTA-rør og brukt i løpet av 10 min for å unngå nøytrofil aktivering 14. Vi bruker Lymphocyte Separation Media (LSM) tetthetsgradient-sentrifugering for å isolere granulocytter og røde blodceller fra heparinisert helblod, en metode tilpasset fra Ficoll tetthetssentrifuge teknikken opprinnelig beskrevet av Boyum et al 15. LSM er en modifikasjon av Boyum formulering som erstatter natrium- diatrizoat for natrium metrizoate og har vært brukt med hell i mange studier for å isolere neutrofiler 16-18.
Etter differensial tetthet sentrifugering, er monocytter og lymfocytter forkastet; røde blodceller blir deretter sedimentertved hjelp av en 6% dekstran-løsning 14 og de gjenværende røde blodceller lyseres for å oppnå en populasjon av rene neutrofiler, som blir verifisert med Trypan blått og metylen blå farging.
Mange midler er blitt brukt til å indusere NETosis både in vitro og in vivo, med lipopolysakkarid (LPS), og forbolmyristatacetat (PMA) og interleukiner (IL-8) 3,5,6. I den følgende protokoll, blir isolerte nøytrofiler stimulert med 500 nM PMA i 4 timer, noe som har vist seg å være en tilstrekkelig konsentrasjon til å tillate konsistent og pålitelig NET dannelse uten å fremme apoptose 19,20.
Etter isolering, viser vi hvordan cellefrie NET hentet fra denne protokollen kan brukes i en adhesjonsassayet. DNAse1 brukes til å fordøye og nedbryte NET som tidligere beskrevet, og tjener således som en kontroll 2,3,11. Andre alternativer inkluderer bruk av Neutrofil elastase inhibitor (nei) for å hemme NET forming avon, som er et akseptabelt alternativ når målet er å inhibere dannelsen NET fremfor bevirke deres nedbrytning 11. Selv om nei har en rekke varierte funksjoner, har det tidligere blitt vist at NET deponering kan bli hemmet av Nei gjennom blokkering av kromatin decondensation, kjernekraft degranulation og nøytrofile døden 12
Den Neutrofil Ekstracellulær Trap isolasjon protokollen demonstrert i denne videoen kombinerer ulike teknikker som brukes i litteraturen for nøytrofile isolasjon og NET formasjon. Det forenkler en ganske kompleks og variabel prosess og tilbyr en svært pålitelig og replikerbart måte å isolere rensede cellefrie nøter med færre trinn enn andre protokoller. Videre er lett tilgjengelige reagenser sysselsatte legge til protokoller enkelhet og betydelig redusere kostnadene. Anvendelsen av NET mot en statisk adhesjonsas…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
CFSE | Invitrogen | C1157 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |