I följande protokoll, beskriver vi ett mycket enkelt sätt att isolera neutrofila Extracellulär fällor (nät) från humant helblod använder lättillgängliga reagens. Vi visar sedan hur de isolerade NET kan användas i en in vitro-vidhäftningsanalys med cancerceller.
Neutrofila Extracellulär Fällor (nät) har nyligen identifierats som en del av neutrofila s antimikrobiell armamentarium. Bortsett från deras roll i kampen mot infektioner, har ny forskning visat att de kan vara inblandade i många andra sjukdomsprocesser, inklusive cancer progression. Isolera renade NET är en avgörande faktor för att möjliggöra studier av dessa funktioner.
I denna video visar vi en förenklad metod för cellfritt NET isolering från humant helblod använder lättillgängliga reagens. Isolerade NET kan sedan användas för immunofluorescensfärgning, läsk eller olika funktionella analyser. Detta möjliggör en bedömning av deras biologiska egenskaper i frånvaro av de potentiella felkällor effekter neutrofiler själva.
En densitetsgradient separationsteknik används för att isolera neutrofiler från frisk donator helblod. Isolerade neutrofiler stimuleras sedan genom forbol 12-myristate 13-acetat (PMA) för att inducera NETosis. Aktiverade neutrofiler sedan kasseras och en cellfritt NET lager erhålls.
Vi visar sedan hur isolerade NET kan användas i en vidhäftningsanalys med A549 humana lungcancerceller. NET lager används för att belägga brunnarna i en 96 brunnars cellodlingsplatta O / N, och efter att garantera en tillräcklig NET monoskikt bildning på botten av brunnarna, märkta CFSE A549-celler tillsätts. Vidhäftande celler kvantifieras med hjälp av en Nikon TE300 fluorescerande mikroskop. I vissa brunnar, är 1000U DNAse1 sattes 10 minuter före räkning att nedbryta NET
Neutrofila cellulära fällor (nät) är nyupptäckta neutrofilspecifika härledda element består av strängar av extracellulärt DNA dekorerade av hundratals proteiner och histoner. De utsöndras av neutrofiler i samband med infektion och inflammation följande specifika stimuli och de ursprungligen erkänt att vara en del av neutrofila försvarsmekanismer mot infektioner. De var först visat att främja infångning av olika mikrobiella inkräktare inklusive bakterier, virus och svampar 1-3. Svällning av mikroben skulle då leda till dess undergång både direkt av NET-associerade proteiner 3,4 och indirekt genom lokal rekrytering av fagocytceller 5,6. Roll NET dock inte verkar vara begränsat till värdförsvaret. På senare tid har de visat sig spela en viktig roll vid autoimmuna sjukdomar 7,8, trombos 9, graviditetsrelaterade störningar 10 och även cancer progression11,12. Följaktligen förefaller det som NET spelar en viktig roll i ett stort antal olika fysiologiska processer. Men med tanke på nya karaktären av sådan forskning, återstår mycket att belysas med avseende på de mekanismer genom vilka NET utövar sina effekter. Häri, presenterar vi en förenklad metod för isolering av NET i frånvaro av neutrofiler.
I följande video visar vi en förenklad och enkel teknik för att isolera NET från humant helblod. Cellfria NET kan sedan användas i ett antal in vitro-försök, vilket omfattar färgning, imuunofluorescence, läsk liksom ett antal analyser, såsom adhesion, spridning och migrering. Andra protokoll existerar 13, 19, men de är vanligen långa, komplexa, dyra och ofta, lågt utbyte 13. Detta förenklade protokoll använder basiska reagens och minskar antalet steg som krävs för att isolera neutrofiler således minimera längden av procedure samtidigt maximera avkastningen.
Följande metod kombinerar olika tekniker för neutrofil isolering tidigare beskrivits i litteraturen för att erhålla ett enkelt protokoll vilket gav ett mycket rent prov av levande neutrofiler. Som föreslås i litteraturen, är venöst blod samlas i EDTA-rör och används inom 10 minuter för att undvika neutrofilaktivering 14. Vi använder lymfocytseparationsmedium media (LSM) densitetsgradientcentrifugering för att isolera granulocyter och röda blodkroppar från hepariniserat helblod, en metod anpassad från Ficoll densitetscentrifugering teknik initialt beskrivits av Boyum m.fl. 15. LSM är en modifiering av Boyum formulering som ersätter natrium diatrizoat för natrium metrizoate och har använts med framgång i många studier att isolera neutrofiler 16-18.
Efter differentiell densitetscentrifugering, är monocyter och lymfocyter kastas; röda blodkroppar är sedan sedimentmed hjälp av en 6% dextran-lösning 14 och de återstående RBC lyseras för att erhålla en population av rena neutrofiler, vilket verifieras med trypanblått och metylenblått färgning.
Talrika medel har använts för att inducera NETosis både in vitro och in vivo, inkluderande lipopolysackarid (LPS), och forbolmyristatacetat (PMA) och interleukiner (IL-8) 3,5,6. I följande protokoll, är isolerade neutrofiler stimuleras med 500 nM PMA under 4 timmar, vilket har visat sig vara en lämplig koncentration för att möjliggöra en konsekvent och pålitlig NET bildning utan att främja apoptos 19,20.
Efter isolering, visar vi hur cellfria NET erhållna från detta protokoll kan användas i en adhesionsanalys. DNAse1 används för att smälta och bryta ned NET såsom tidigare beskrivits och tjänar sålunda som en kontroll 2,3,11. Andra alternativ är att använda neutrofilelastas hämmare (NEi) att hämma NET formatipå, vilket är ett acceptabelt alternativ när målet är att hämma NET bildningen i stället påverka deras nedbrytning 11. Även NEi har ett antal olika funktioner, har det tidigare visat att NET nedfall kan hämmas genom NEi genom blockering av kromatin decondensation, kärnkraft degranulation och neutrofil död 12
Den neutrofila Extracellulär Trap isoleringsprotokoll demonstreras i den här videon kombinerar olika tekniker som används i litteraturen för neutrofila isolering och NET bildning. Det förenklar en ganska komplex och variabel processen och erbjuder en mycket pålitlig och reproducerbara sättet att isolera renade cellfria NET med färre steg än andra protokoll. Dessutom är lättillgängliga reagenser sysselsatt lägga till protokoll enkelhet och avsevärt minska sina kostnader. Tillämpningen av NET mot ett statis…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
CFSE | Invitrogen | C1157 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |