Summary
I den følgende protokol, beskriver vi en meget enkel måde at isolere neutrofile Ekstracellulære fælder (net) fra humant fuldblod ved anvendelse af let tilgængelige reagenser. Vi derefter vise, hvordan de isolerede garn kan anvendes i et in vitro adhæsionsassay med cancerceller.
Abstract
Neutrocyt Ekstracellulære Fælder (net) er for nylig blevet identificeret som en del af neutrofile s antimikrobielle armamentarium. Ud over deres rolle i bekæmpelsen af infektioner, har nyere forskning vist, at de kan være involveret i mange andre sygdomsprocesser, herunder kræft progression. Isolering oprensede NET er et afgørende element for at tillade studiet af disse funktioner.
I denne video viser vi en forenklet fremgangsmåde til cellefri NET isolation fra humant fuldblod ved anvendelse af let tilgængelige reagenser. Isolerede garn kan derefter anvendes til immunfluorescensfarvning, blotting eller forskellige funktionelle assays. Dette muliggør en vurdering af deres biologiske egenskaber i fravær af de potentielle forstyrrende virkninger af neutrofiler selv.
En densitetsgradient separation teknik anvendes til at isolere neutrofiler fra sunde donor fuldblod. Isolerede neutrofiler derefter stimuleret af phorbol-12-MYRistate 13-acetat (PMA) til at inducere NETosis. Aktiverede neutrofiler derefter kasseres, og en cellefri NET lager opnås.
Vi derefter vise, hvordan isolerede garn kan anvendes i en adhæsion assay med A549 humane lungecancerceller. NET lager anvendes til at coate brøndene i en 96-brønds celledyrkningsplade O / N, og efter sikring af en passende NET monolagsformation på bunden af brøndene, CFSE mærkede A549-celler tilsættes. Adhærente celler kvantificeres ved hjælp af et Nikon TE300 fluorescensmikroskop. I nogle brønde er 1000U DNAse1 tilsat 10 min før tælling til at nedbryde NET
Introduction
Neutrofile ekstracellulære fælder (net) er nyopdagede neutrofil-afledte elementer sammensat af strenge af ekstracellulært DNA dekoreret af hundredvis af proteiner og histoner. De udskilles ved neutrofiler i forbindelse med infektion og inflammation følgende specifikke stimuli, og de oprindeligt blev anerkendt for at være en del af neutrofile forsvarsmekanismer mod infektioner. De blev først vist sig at fremme indfangning af forskellige mikrobielle angribere herunder bakterier, vira og svampe 1-3. Indfangning af mikroben vil så føre til dens ødelæggelse både direkte af Net-associerede proteiner 3,4 og indirekte gennem lokal rekruttering af fagocytceller 5,6. Rolle NET dog ikke synes at være begrænset til at være vært forsvar. Mere nyligt har de vist sig at spille en vigtig rolle ved autoimmune sygdomme 7,8, trombose 9, graviditet lidelser 10 og endog kræft progression11,12. Følgelig fremgår det, at NET spiller en vigtig rolle i en lang række forskellige fysiologiske processer. Men i betragtning af romanen karakter af en sådan forskning, stadig meget at blive belyst med hensyn til de mekanismer, som NET udøver deres virkninger. Heri præsenterer vi en forenklet metode til isolering af NET i fravær af neutrofiler.
I den følgende video viser vi en forenklet og nem teknik til at isolere NET fra humant fuldblod. Cellefrie NET kan derefter anvendes i en række af in vitro forsøg, herunder farvning imuunofluorescence, blotting samt en række assays, såsom adhæsion, proliferation og migration. Andre protokoller findes 13, 19, men de er sædvanligvis langvarig, komplekse, dyre og ofte lavt udbytte 13. Denne forenklede protokol anvender basiske reagenser og nedsætter antallet af nødvendige trin til at isolere neutrofiler derfor minimere længden af Procedure samtidig maksimere udbyttet.
Den følgende fremgangsmåde kombinerer forskellige teknikker til neutrofil isolation tidligere beskrevet i litteraturen til opnåelse af en simpel protokol giver en meget ren prøve af levende neutrofiler. Som foreslået i litteraturen, er veneblod opsamlet i EDTA-rør og anvendt inden for 10 min for at undgå neutrofilaktivering 14. Vi bruger Lymfocyt Separation Media (LSM) densitetsgradientcentrifugering at isolere granulocytter og røde blodlegemer fra hepariniseret fuldblod, en fremgangsmåde tilpasset fra Ficoll-densitetscentrifugering teknik oprindeligt beskrevet af Boyum et al 15. LSM er en modifikation af Boyum formulering, der erstatter natrium diatrizoat for natrium metrizoat og har været anvendt med succes i mange undersøgelser til at isolere neutrofile 16-18.
Efter forskellen densitetscentrifugering, er monocytter og lymfocytter kasseret; røde blodlegemer derefter bundfældesved anvendelse af en 6% Dextran opløsning 14 og de resterende røde blodlegemer lyseres til opnåelse af en population af rene neutrofiler, som bekræftes med Trypan blå og methylen blå farvning.
Talrige midler er blevet anvendt til at inducere NETosis både in vitro og in vivo, herunder lipopolysaccharid (LPS) og phorbolmyristatacetat (PMA) og interleukiner (IL-8) 3,5,6. I den følgende protokol, er isolerede neutrofiler stimuleret med 500 nM PMA i 4 timer, hvilket har vist sig at være en tilstrækkelig koncentration til at tillade konsekvent og pålidelig NET formation uden at fremme apoptose 19,20.
Efter isolering vi vise, hvordan cellefrie NET opnået fra denne protokol kan anvendes i en adhæsion assay. DNAse1 anvendes til at fordøje og nedbryde NET som tidligere beskrevet og derfor tjener som kontrol 2,3,11. Andre valgmuligheder omfatter brugen af neutrofilelastase hæmmer (NEI) at hæmme NET formatipå, hvilket er et acceptabelt alternativ, når målet er at inhibere NET formation stedet bevirke deres nedbrydning 11. Selv NEI har en række forskellige funktioner, er det tidligere blevet vist, at NET deposition kan inhiberes af NEI gennem blokering af chromatin dekondensering, nuklear degranulering og neutrophil død 12
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de lokale institutionelle etiske retningslinjer.
1. Blod Tegning
- Gennem antecubital venipucture, indsamle 14 rør af blod fra en rask frivillig i grøn top (hepariniserede) rør og vend hvert rør før afregning på is. Saml blod inden for 10 - 15 min af eksperiment for at sikre optimal neutrofil udbytte.
2. Neutrofil Isolering fra fuldblod
- Vask hver grøn overrør af blod med 5 ml PBS uden Ca og Mg at fortynde blodet. I hver af 4 x 50 ml koniske rør, tilsættes 15 ml Lymphocyte Separation Medier (LSM) ved stuetemperatur. Ved hjælp af en 18 G nål monteret på en 60 ml sprøjte, omhyggeligt lag det fortyndede blod på LSM, at skabe en skarp LSM-blod interface.
BEMÆRK: Undgå at blande af lagene så meget som muligt. - Centrifuger ved 800 x g i 30 minutter ved 21 ° C uden pause.
BEMÆRK: Pludselig pauser kanforårsage blanding af de forskellige lag. - Overhold erytrocytter og neutrofiler sediment i bunden. Aspirer og kassér de øverste 2 lag (plasma og LSM) og sørg for at slippe af grænsefladen mellem disse lag, der indeholder lymfocytter og mononukleære celler, så kun den nederste røde lag.
- Til hvert rør tilsættes 20 ml phosphatbuffer saltvand (PBS) og 20 ml 6% Dextran opløsning. Vend forsigtigt hvert rør for at blande med laget af erytrocytter og neutrofiler og tillade at sidde ved stuetemperatur i 30 min.
BEMÆRK: Dette vil give røde blodlegemer (RBC) at sedimentere på bunden. - Efter 30 minutter overføre neutrofile rige supernatant i friske rør og kassér RBC pellets. Centrifuger supernatanter ved 450 xg ved 4 ° C i 5 minutter. Efter centrifugering kassere supernatanten. Pillen vil indeholde det meste neutrofiler og få røde blodlegemer.
- Der fremstilles en lyserende opløsning ved tilsætning af 0,5 ml lyseringsbuffer til 4,5 ml sterilt vand. Lyse resterende RBC med than forberedte 5 ml lyseringsopløsning, overføre alle resuspenderede pellets i et rør. Tillad lysis ved stuetemperatur i mørke i 10 min.
- Der centrifugeres ved 450 xg ved 4 ° C i 5 min. Supernatanten kasseres, og vask pellet med 5 ml PBS uden Ca og Mg og centrifugeres igen ved 450 xg ved 4 ° C for at slippe af med resterende lyseringsopløsning. Den opnåede pellet på dette tidspunkt indeholder neutrofiler. Resuspender pellet i 30 ml kold 3% RPMI samt lagt på is.
BEMÆRK: 3% RPMI er lavet ved at supplere RPMI medier med 3% kalvefosterserum (FBS) - Kontroller renheden af prøven under anvendelse af methylenblåt-blåfarvning. > 95% af cellerne bør være granulocytter med multi-Lobar kerner. Brug Trypan blåfarvning at verificere> 95% levedygtighed af celler og tælle den endelige neutrofil udbytte. Fortynd neutrofiler i iskold 3% RPMI for at opnå en endelig koncentration på 5 x 10 6 neutrofiler / ml.
3. NET Generation
- Stimuler neutrofiler med 500 nM PMA (per 30 ml neutrofil opløsning) og inkuber på en 150 x 25mm flad vævskulturskål med 20 mm gitter i 4 timer ved 37 ° C 5% CO2. Dette vil give NETosis.
- Efter 4 timer af stimulering, forsigtigt aspireres og kassere medierne, forlader lag af NET og neutrofiler klæbet på bunden. Du må ikke forstyrre dette lag.
- Ved hjælp af en i alt 15 ml kold PBS uden Ca og Mg pr skål vaskes bunden af hver skål ved pipettering 15 ml PBS på bunden af skålen for at løfte alle klæbende materiale fra bunden.
- Saml opløsning opnået fra vask hver skål (trin 3.3) i en 15 ml konisk rør og centrifugeres i 10 minutter ved 450 xg ved 4 ° C. Neutrofiler og eventuelle resterende celler vil bundfælde på bunden, forlader en celle-fri NET-rige supernatant.
- Divide supernatant i 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugering i 10 minutter ved 18.000 xg ved 4 ° C. Dette vil tillade alle DNA pellet.
BEMÆRK: Centrifugering i større tuBES er lettere og mindre tidskrævende, hvis sådanne høje hastigheder er opnåelige på den almindelige centrifuge, ellers bliver nødt til at opdele supernatanter i mindre rør for at kunne bruge højhastigheds mikro-centrifuge. - Supernatanten kasseres, og resuspender alle opnåede pellets sammen i iskold PBS til en koncentration svarende til 2 x 10 7 neutrofiler per 100 pi PBS. Dette vil give den cellefrie NET lager, som kan anvendes til efterfølgende eksperimenter.
- Mål DNA-koncentration i prøven opnået ved anvendelse metri eller alternative DNA kvantificering værktøj. En passende koncentration i prøven bør ligge mellem 140-180 ng / pl.
4. NET-Cancer Cell Static adhæsionsassay
- Tilsæt 100 pi af den tidligere opnåede NET lager per brønd i en 96 brønds fladbundet plade og tillade at coate brønde O / N ved 4 ° C i mørke.
- Mellem 12 og 20 timer senere, kontrollere dannelsen af en jævn monolag af cellefrie NET på bunden af brøndene under mikroskop (Figur 1). På dette tidspunkt forsigtigt suge al ikke-klæbende materiale ud af brøndene, og sørg for ikke at forstyrre den NET monolag i bunden.
- Tilsæt 100 pi af 1% bovint serumalbumin (BSA) blokerende opløsning til hver brønd og henstår i 1 time ved stuetemperatur.
- Frigør A549 cancerceller fra en T-75 kolbe af 2 ml 0,25% trypsin-opløsning. Når fritliggende, tilsættes 10 ml A549 medier til trypsinerede celler og centrifugeres ved 450 xg ved 4 ° C i 5 min. Kassér supernatanten og resuspender cellerne i medierne for at opnå en koncentration på 2 x10 4 kræftceller pr 100 gi medier.
BEMÆRK: A549-celler blev dyrket separat. Kort fortalt blev celler dyrket og opretholdt i DMEM F12-medium indeholdende 10% FBS og 1% penicillin streptomycin og inkuberet ved 37 ° C 5% CO2. Når 70-80% celle konfluens var nået, blev de fritliggende anvendelse af 0,25% trypsin-EDTA og resuspenderet i det samme mediebeskrevet ovenfor. - Stain cancerceller ved hjælp CFSE ved at tilsætte 1 pi CFSE per ml medium og lad plette ved stuetemperatur i 10 min. Efter farvning centrifuge ned ved 450 x g ved 4 ° C i 5 minutter og derefter kassere supernatanten og resuspender cellerne i oprindelige volumen af mediet til opnåelse af en koncentration på 2 x10 4 cancerceller per 100 pi medier.
- Efter 1 time af NET blokerer, blidt aspirer blokerende opløsning, og der tilsættes 2 x10 4 kræftceller i medierne, hvilket svarer til 100 pi pr godt over nettet monolag og lad det holde sig i 90 minutter ved 37 ° C 5% CO2. Forsigtigt aspirere cellerne og tilsættes 100 pi PBS til hver brønd for at vaske eventuelle ikke-adhærente celler.
- I nogle brønde, tilføje 1000 U af DNAse1 per brønd i 10 minutter før vask at nedbryde NET. Dette vil tjene som negativ kontrol. Med andre brønde, tilsættes 100 ul sterilt vand per brønd i 10 minutter, der skal tjene som kontrol køretøj (VC).
BEMÆRK: 3 replikater pr condition er normalt udføres for at øge prøvestørrelse. - Aspirér og kassér al opløsning i brøndene så kun NET og vedhængende kræftceller i bunden. Tilsæt 100 pi 4% formaldehydopløsning pr godt at fastsætte adhærente cancerceller til net og læse assay under fluorescensmikroskop (figur 1). Plot og analysere resultaterne (figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket gennemførelse af en statisk vedhæftning assay med net kræver passende belægning af brøndene med et monolag af NET før tilsætning af kræftceller (figur 1). Alle efterfølgende trin skal udføres med omhu for ikke at forstyrre den lag. Når en passende lag af net er dannet, forventes det at se en betydelig cancerceller adhæsion til NET som det ses i figur 2A og 2C. Denne virkning er ophævet ved tilsætning af DNAse1, som nedbrydes NET, som ses i figur 2B og 2D. Omvendt bør der ikke være nogen signifikant fald i A549 vedhæftning til NET i overværelse af kontrol køretøj (figur 3). For at opnå en god vurdering af den gennemsnitlige cancer celleadhæsion pr højstyrkefelt (HPF), anbefales det at tælle mindst 4 tilfældige HPFS per brønd. Felter, der ikke er godt belagt i net som følge af tekniske problemer ikke skal tages i betragtning for CounTing som disse kan forfalske resultater.
Figur 1. NET Monolayer. Lysmikroskopi billeder af de 96 brønde pladebrøndene belagt med redskaber, der viser (A) ensartet monolag af NET i hele godt i modsætning til (B) utilstrækkelig belægning af brønden med en afbrudt lag af net. Scale søjler repræsenterer 40 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. A549 Kræft celleadhæsion til NET in vitro. (A) A549 cancerceller (pile) overholde monolag af NET in vitro. (B) Additipå af DNAse1 falder signifikant niveauet af kræft celleadhæsion; (C) viser et repræsentativt billede af cancer celleadhæsion på NET under fluorescerende lys under fluorescensmikroskopi (Nikon TE300) før (C) og efter (D) tilsætning af DNAse1. Scale søjler repræsenterer 40 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Resultater for In Vitro adhæsionsassay. GraphPad software blev brugt til at plotte og analysere resultater fra A549 kræft celleadhæsionsassay til NET. I nærvær af DNAse, vedhæftning var 13,90% sammenlignet med ubehandlede NET. I nærværelse af vehikelkontrollen (VC), vedhæftning var 77,26% i forhold til ubehandlede NET. Data præsenteres som gennemsnit +/-SEM. Signifikans blev bestemt under anvendelse af Kruskall Wallis test med ** p <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Neutrofil Ekstracellulær Trap isoleret protokol demonstreret i denne video kombinerer forskellige teknikker, der anvendes i litteraturen for neutrofil isolation og NET formation. Det forenkler en ret kompleks og variabel proces og giver en meget pålidelig og replikerbar måde at isolere oprensede cellefrie redskaber med færre trin end andre protokoller. Desuden er let tilgængelige reagenser, der anvendes tilføjelse til protokoller enkelhed og væsentligt reducere omkostningerne. Anvendelsen af NET i retning af en statisk vedhæftning assay tjener til at demonstrere den fleksibilitet, som dette isolation teknik, som NET koncentration nemt kan manipuleres til at passe et bestemt mål (17). Følgelig kan NET isoleret ved påvist teknik anvendes til forskellige typer af assays, herunder dynamisk adhæsionsassays, migration assays, proliferation assays immunofluorescens og konfokal billeddannelse, elektronmikroskopi, flowcytometri såvel som traditionelle Western blotting. Der er en række trin i denne protokol, der er afgørende for dens succes. Først kan neutrofiler utilsigtet aktiveres under processen med isolering fører til apoptose. Det er derfor vigtigt at udføre alle isoleringstrin under sterile betingelser stinkskabet, undgå aggressiv blanding af rør, holde alle prøver på is efter RBC lyse skridt, og undgå lange ventetider mellem trin. For det andet, hvis målet for analysen er at belægge brønde med henblik på at vurdere vedhæftning, er det vigtigt at overholde den foreslåede NET koncentration per brønd samt den foreslåede endelige DNA-koncentration i "NET lager", da dette vil sikre en endnu og konsekvent monolag af NET. Lavere koncentration kan frembringe kun pletvis belægning af brønden og derfor mindre pålidelige resultater. Endelig er det også vigtigt at håndtere NET monolag nøje mens udførelse af analysen at forhindre forstyrrelser. Dette kan fremmes ved at justereintensiteten af suge- og pipettering på siderne af brøndene.
Begrænsninger af denne teknik indbefatter det faktum, at det kræver stadig en betydelig mængde tid til at producere NET, hovedsagelig forårsaget af 4 timer PMA stimulation trin. Desuden er en væsentlig mængde blod til isolering af et tilstrækkeligt antal af neutrofiler, der kræves for et eksperiment. Der helt sikkert er tabet af en betydelig mængde af garn den første centrifugering trin (trin 3.4.), Når de skiller neutrofiler. Ændringer for at minimere nettotab på dette tidspunkt i væsentlig grad kan øge den endelige NET udbytte. Desuden skal isolerede NET bruges inden 12 - 24 timer af deres isolation, som kræver omhyggelig eksperiment planlægning og tidsstyring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20 mm grid (150 x 25 mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
