Forenklet human neutrofil Ekstracellulære Fælder (NET) Isolering og Håndtering
Summary
I den følgende protokol, beskriver vi en meget enkel måde at isolere neutrofile Ekstracellulære fælder (net) fra humant fuldblod ved anvendelse af let tilgængelige reagenser. Vi derefter vise, hvordan de isolerede garn kan anvendes i et in vitro adhæsionsassay med cancerceller.
Abstract
Neutrocyt Ekstracellulære Fælder (net) er for nylig blevet identificeret som en del af neutrofile s antimikrobielle armamentarium. Ud over deres rolle i bekæmpelsen af infektioner, har nyere forskning vist, at de kan være involveret i mange andre sygdomsprocesser, herunder kræft progression. Isolering oprensede NET er et afgørende element for at tillade studiet af disse funktioner.
I denne video viser vi en forenklet fremgangsmåde til cellefri NET isolation fra humant fuldblod ved anvendelse af let tilgængelige reagenser. Isolerede garn kan derefter anvendes til immunfluorescensfarvning, blotting eller forskellige funktionelle assays. Dette muliggør en vurdering af deres biologiske egenskaber i fravær af de potentielle forstyrrende virkninger af neutrofiler selv.
En densitetsgradient separation teknik anvendes til at isolere neutrofiler fra sunde donor fuldblod. Isolerede neutrofiler derefter stimuleret af phorbol-12-MYRistate 13-acetat (PMA) til at inducere NETosis. Aktiverede neutrofiler derefter kasseres, og en cellefri NET lager opnås.
Vi derefter vise, hvordan isolerede garn kan anvendes i en adhæsion assay med A549 humane lungecancerceller. NET lager anvendes til at coate brøndene i en 96-brønds celledyrkningsplade O / N, og efter sikring af en passende NET monolagsformation på bunden af brøndene, CFSE mærkede A549-celler tilsættes. Adhærente celler kvantificeres ved hjælp af et Nikon TE300 fluorescensmikroskop. I nogle brønde er 1000U DNAse1 tilsat 10 min før tælling til at nedbryde NET
Introduction
Neutrofile ekstracellulære fælder (net) er nyopdagede neutrofil-afledte elementer sammensat af strenge af ekstracellulært DNA dekoreret af hundredvis af proteiner og histoner. De udskilles ved neutrofiler i forbindelse med infektion og inflammation følgende specifikke stimuli, og de oprindeligt blev anerkendt for at være en del af neutrofile forsvarsmekanismer mod infektioner. De blev først vist sig at fremme indfangning af forskellige mikrobielle angribere herunder bakterier, vira og svampe 1-3. Indfangning af mikroben vil så føre til dens ødelæggelse både direkte af Net-associerede proteiner 3,4 og indirekte gennem lokal rekruttering af fagocytceller 5,6. Rolle NET dog ikke synes at være begrænset til at være vært forsvar. Mere nyligt har de vist sig at spille en vigtig rolle ved autoimmune sygdomme 7,8, trombose 9, graviditet lidelser 10 og endog kræft progression11,12. Følgelig fremgår det, at NET spiller en vigtig rolle i en lang række forskellige fysiologiske processer. Men i betragtning af romanen karakter af en sådan forskning, stadig meget at blive belyst med hensyn til de mekanismer, som NET udøver deres virkninger. Heri præsenterer vi en forenklet metode til isolering af NET i fravær af neutrofiler.
I den følgende video viser vi en forenklet og nem teknik til at isolere NET fra humant fuldblod. Cellefrie NET kan derefter anvendes i en række af in vitro forsøg, herunder farvning imuunofluorescence, blotting samt en række assays, såsom adhæsion, proliferation og migration. Andre protokoller findes 13, 19, men de er sædvanligvis langvarig, komplekse, dyre og ofte lavt udbytte 13. Denne forenklede protokol anvender basiske reagenser og nedsætter antallet af nødvendige trin til at isolere neutrofiler derfor minimere længden af Procedure samtidig maksimere udbyttet.
Den følgende fremgangsmåde kombinerer forskellige teknikker til neutrofil isolation tidligere beskrevet i litteraturen til opnåelse af en simpel protokol giver en meget ren prøve af levende neutrofiler. Som foreslået i litteraturen, er veneblod opsamlet i EDTA-rør og anvendt inden for 10 min for at undgå neutrofilaktivering 14. Vi bruger Lymfocyt Separation Media (LSM) densitetsgradientcentrifugering at isolere granulocytter og røde blodlegemer fra hepariniseret fuldblod, en fremgangsmåde tilpasset fra Ficoll-densitetscentrifugering teknik oprindeligt beskrevet af Boyum et al 15. LSM er en modifikation af Boyum formulering, der erstatter natrium diatrizoat for natrium metrizoat og har været anvendt med succes i mange undersøgelser til at isolere neutrofile 16-18.
Efter forskellen densitetscentrifugering, er monocytter og lymfocytter kasseret; røde blodlegemer derefter bundfældesved anvendelse af en 6% Dextran opløsning 14 og de resterende røde blodlegemer lyseres til opnåelse af en population af rene neutrofiler, som bekræftes med Trypan blå og methylen blå farvning.
Talrige midler er blevet anvendt til at inducere NETosis både in vitro og in vivo, herunder lipopolysaccharid (LPS) og phorbolmyristatacetat (PMA) og interleukiner (IL-8) 3,5,6. I den følgende protokol, er isolerede neutrofiler stimuleret med 500 nM PMA i 4 timer, hvilket har vist sig at være en tilstrækkelig koncentration til at tillade konsekvent og pålidelig NET formation uden at fremme apoptose 19,20.
Efter isolering vi vise, hvordan cellefrie NET opnået fra denne protokol kan anvendes i en adhæsion assay. DNAse1 anvendes til at fordøje og nedbryde NET som tidligere beskrevet og derfor tjener som kontrol 2,3,11. Andre valgmuligheder omfatter brugen af neutrofilelastase hæmmer (NEI) at hæmme NET formatipå, hvilket er et acceptabelt alternativ, når målet er at inhibere NET formation stedet bevirke deres nedbrydning 11. Selv NEI har en række forskellige funktioner, er det tidligere blevet vist, at NET deposition kan inhiberes af NEI gennem blokering af chromatin dekondensering, nuklear degranulering og neutrophil død 12
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Neutrofil Ekstracellulær Trap isoleret protokol demonstreret i denne video kombinerer forskellige teknikker, der anvendes i litteraturen for neutrofil isolation og NET formation. Det forenkler en ret kompleks og variabel proces og giver en meget pålidelig og replikerbar måde at isolere oprensede cellefrie redskaber med færre trin end andre protokoller. Desuden er let tilgængelige reagenser, der anvendes tilføjelse til protokoller enkelhed og væsentligt reducere omkostningerne. Anvendelsen af NET i retni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
References
- Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
- McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
- Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
- Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
- Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
- Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
- Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
- Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
- Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
- Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
