Summary

Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Published: April 16, 2015
doi:

Summary

In de onderstaande voorschriften beschrijven we een zeer eenvoudige manier om neutrofielen extracellulaire vallen (NET) uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia isoleren. Wij dan tonen hoe de geïsoleerde netten kunnen worden gebruikt in een in vitro adhesietest met kankercellen.

Abstract

Neutrofielen Extracellular traps (NET) zijn onlangs geïdentificeerd als onderdeel van antimicrobiële armamentarium de neutrofielen's. Naast hun rol bij de bestrijding van infecties, heeft recent onderzoek aangetoond dat zij betrokken zijn bij vele ziekteprocessen, met inbegrip van kanker progressie. Isoleren gezuiverd NET is een cruciaal element om de studie van deze functies mogelijk te maken.

In deze video tonen we een vereenvoudigde werkwijze voor celvrije NET isolatie uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia. Geïsoleerde netten kunnen vervolgens worden gebruikt voor immunofluorescentie kleuring, blotting of verschillende functionele assays. Dit maakt een beoordeling van hun biologische eigenschappen bij afwezigheid van de mogelijke verstorende effecten van neutrofielen zelf.

Een dichtheid gradiënt scheidingstechniek toegepast om neutrofielen uit gezonde donor volbloed te isoleren. Geïsoleerde neutrofielen worden dan gestimuleerd door forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) aan NETosis induceren. Geactiveerde neutrofielen worden dan weggegooid, en een cel-vrij NET voorraad wordt verkregen.

Vervolgens hebben we zien hoe geïsoleerd netten kunnen worden gebruikt in een adhesietest met A549 menselijke longkankercellen. De NET voorraad wordt gebruikt voor het bekleden van de putjes van een 96 putjes celkweekplaat O / N, en na een adequate NET monolagen bodem van de putjes, CFSE gelabelde A549 cellen worden toegevoegd. Hechtende cellen worden gekwantificeerd met behulp van een Nikon TE300 fluorescentiemicroscoop. In sommige putten, wordt 1000U DNAse1 10 min voordat het tellen naar NET degraderen toegevoegd

Introduction

Neutrofielen extracellulaire vallen (NET) zijn nieuw ontdekte neutrofiel-afgeleide elementen opgebouwd uit strengen van extracellulair DNA ingericht door honderden eiwitten en histonen. Zij worden uitgescheiden door neutrofielen in de context van infectie en ontsteking na specifieke stimuli en werden initieel gedeelte van afweermechanismen neutrofielen tegen infecties. Ze werden voor het eerst getoond aan het opsluiten van verschillende microbiële indringers zoals bacteriën, virussen en schimmels 1-3 te bevorderen. Het vangen van de microbe zou dan leiden tot de vernietiging zowel direct door-NET-geassocieerde eiwitten 3,4 en indirect via de lokale werving van fagocyterende cellen 5,6. De rol van NET betekent echter niet te worden beperkt tot de verdediging te organiseren. Recenter bleken ze een belangrijke rol in auto-immuunziekten 7,8 spelen, trombose 9, zwangerschap gerelateerde aandoeningen 10 en zelfs progressie van kanker11,12. Derhalve blijkt dat NET spelen een belangrijke rol in een groot aantal verschillende fysiologische processen. Gezien het nieuwe karakter van dergelijk onderzoek, nog veel worden toegelicht met betrekking tot de mechanismen die NET hun werking uitoefenen. Hierin presenteren we een vereenvoudigde werkwijze voor de isolatie van netten voor de afwezigheid van neutrofielen.

In de volgende video, demonstreren we een eenvoudige en gemakkelijke techniek om NET's uit humaan totaal bloed geïsoleerd. Celvrije netten kunnen vervolgens worden gebruikt in verschillende in vitro experimenten, waaronder kleuring imuunofluorescence, evenals blotting een aantal testen zoals hechting, proliferatie en migratie. Andere protocollen bestaan ​​13, 19, maar ze zijn vaak langdurig, ingewikkeld, duur en vaak lage opbrengst 13. Deze vereenvoudigde protocol gebruikt basische reagentia en vermindert het aantal stappen om neutrofielen te isoleren, dus het minimaliseren van de lengte van de procedure terwijl het maximaliseren van de opbrengst.

De volgende methode combineert verschillende technieken voor neutrofielen isolatie eerder in de literatuur beschreven van een eenvoudig protocol waarbij een zeer zuiver monster van levende neutrofielen verkrijgen. Zoals voorgesteld in de literatuur, wordt veneus bloed in EDTA-buizen en binnen 10 minuten tot neutrofiel activatie 14 voorkomen. We gebruiken lymfocyt scheidingsmedium (LSM) dichtheidsgradiënt centrifugering granulocyten en rode bloedcellen te isoleren uit gehepariniseerd volbloed, een aangepaste werkwijze uit de Ficoll dichtheidscentrifugatie techniek oorspronkelijk beschreven door Boyum et al 15. LSM is een modificatie van de Boyum formulering die natrium diatrizoaat vervangt het natrium metrizoate en is met succes gebruikt in veel studies neutrofielen 16-18 isoleren.

Na differentiële dichtheid centrifugatie, monocyten en lymfocyten worden verwijderd; rode bloedcellen worden vervolgens gesedimenteerdmet een 6% dextran-oplossing 14 en de overblijvende rode bloedcellen worden gelyseerd om een populatie van zuivere neutrofielen, die wordt gecontroleerd met trypan blauw en methyleenblauw kleuring te verkrijgen.

Talrijke middelen zijn gebruikt om NETosis induceren zowel in vitro als in vivo, waaronder lipopolysaccharide (LPS) en forbolmyristaatacetaat (PMA) en interleukinen (IL-8) 3,5,6. In het volgende protocol worden geïsoleerde neutrofielen gestimuleerd met 500 nM PMA gedurende 4 uur, waarvan is aangetoond dat een voldoende concentratie consistente en betrouwbare nettovorming toestaan ​​zonder bevorderen apoptose 19,20 zijn.

Na isolatie tonen we hoe celvrije NET verkregen van de protocol kan worden gebruikt in een adhesietest. DNAse1 wordt gebruikt verteerbaar en degraderen NET eerder beschreven en dus dient als controle 2,3,11. Andere opties zijn het gebruik van neutrofielelastase remmer (NEI) naar NET formati remmenop, hetgeen een aanvaardbaar alternatief wanneer het doel is het NET te remmen dan bewerkstelligen de afbraak ervan 11. Hoewel NEI heeft een aantal zeer gevarieerde functies, is eerder aangetoond dat NET depositie kan worden geremd door NEI door verstopping van chromatine decondensatie, nucleaire degranulatie en neutrofielen dood 12

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale institutionele ethische richtlijnen. 1. Bloed Tekening Door antecubitale venipucture, verzamel 14 buisjes bloed van een gezonde vrijwilligers in groene top (heparine) buizen en omkeren elke buis voor de afwikkeling op het ijs. Verzamel bloed binnen 10-15 min van experiment om optimale neutrofielen opbrengst te garanderen. 2. neutrofielen Isolatie van volbloed <l…

Representative Results

Succesvolle voltooiing van een statische adhesietest met NET een adequate bekleding van de putjes met een monolaag van NET vóór de toevoeging van kankercellen (figuur 1). Alle volgende stappen moeten worden gedaan met de zorg die laag niet te verstoren. Wanneer een voldoende laag NET is gevormd, wordt verwacht aanzienlijke kankercellen adhesie netten zoals getoond in figuur 2A en 2C zien. Dit effect wordt opgeheven door de toevoeging van DNAse1 die NET degradeert gezi…

Discussion

De neutrofielen extracellulaire Trap isolatie protocol gedemonstreerd in deze video combineert verschillende technieken die gebruikt worden in de literatuur voor neutrofielen isolatie en NET formatie. Het vereenvoudigt een vrij complex en variabel proces en biedt een zeer betrouwbare en reproduceerbare manier om gezuiverd cel-vrije NET's met minder stappen dan andere protocollen te isoleren. Bovendien zijn gemakkelijk verkrijgbaar reagentia toe te voegen aan de protocollen eenvoud en de kosten aanzienlijk vermindere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride Wisent 311-425-CL
Lymphocyte Separation Medium (LSM) Wisent 305-010-CL
Dextran hydrochloride (powder) Spectrum DE130 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder
RPMI-1640 Medium with L-glutamine Wisent 350-000-CL 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum
BD Pharm Lyse Lysing buffer BD Biosciences 555899
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Alrdrich P8139
DNAse1 Roche 11284932001
F12 DMEM Wisent 319-075-CL
Fetal Bovine Serum (FBS) Wisent 080-150
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
CFSE Invitrogen C1157
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) Falcon 353025

References

  1. Saitoh, T., et al. Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1. Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).
  2. Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA. PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons. Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).
  5. McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis. Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).
  6. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  7. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  8. Khandpur, R., et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis. Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).
  9. Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).
  10. Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss. Front Immunol. 3, 362 (2012).
  11. Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. J Clin Invest. , (2013).
  12. Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. Neutrophil extracellular traps in cancer progression. Cell Mol Life Sci. , (2014).
  13. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), (2010).
  14. Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).
  15. Boyum, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).
  16. Calado, R. T., et al. Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells. Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).
  17. Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. Characterization and regulation of bv8 in human blood cells. Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).
  18. Wu, Y. J., et al. In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).
  19. Saffarzadeh, M., et al. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones. PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).
  20. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).

Play Video

Cite This Article
Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. J. Vis. Exp. (98), e52687, doi:10.3791/52687 (2015).

View Video