डीएनए ऑक्सीकरण biomarker के HPLC मापन, 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine, संवर्धित कोशिकाओं और जानवरों के ऊतकों में
Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य डीएनए ऑक्सीकरण मार्कर का पता लगाना है, 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों से डीएनए में (8-ऑक्सो-dGuo) एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा,।
Abstract
ऑक्सीडेटिव तनाव डीएनए सहित Biomacromolecules के ऑक्सीकरण, के लिए अग्रणी, कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं, साथ ही xenobiotic चयापचय के साथ जुड़ा हुआ है। इसलिए, डीएनए ऑक्सीकरण की कुशल पता लगाने चिकित्सा और विष विज्ञान सहित अनुसंधान विषयों की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण है। Oxidatively क्षतिग्रस्त डीएनए के एक आम बायोमार्कर 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine (8-ऑक्सो-dGuo है, अक्सर ग़लती के रूप में भेजा 8-हाइड्रोक्सी-2'-deoxyguanosine (8 ओह dGuo या 8 -oxo-डीजी))। विद्युत का पता लगाने (एचपीएलसी-ईडी) के साथ उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा 8-ऑक्सो-dGuo माप के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। हालांकि, इन मुख्य रूप से समर्थक oxidants के साथ इलाज शुद्ध डीएनए के लिए लागू किया गया था। इसके अलावा, की वजह से मुख्य रूप से विश्लेषणात्मक उपकरणों में अंतर करने के लिए प्रयोगशालाओं के बीच पद्धति मतभेद,, एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए प्रकाशित तरीकों को अपनाने के प्रत्येक प्रयोगशाला से सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है। एइस तरह के एक अनुकूलन प्रक्रिया का वर्णन व्यापक प्रोटोकॉल, कमी है। इधर, एक विस्तृत प्रोटोकॉल संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों से डीएनए में, एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए वर्णित है। यह डीएनए नमूना तैयार आसानी से और तेजी से नमूना तैयार करने के दौरान हो सकता है कि अवांछनीय डीएनए ऑक्सीकरण को कम से कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है दिखाता है कि कैसे। इस प्रोटोकॉल ऑक्सीकरण एजेंट KBrO 3 के साथ इलाज किया सुसंस्कृत मानव वायुकोशीय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं (यानी, A549 कोशिकाओं) में 8-ऑक्सो-dGuo पता लगाने, और POLYCYCLIC सुरभित हाइड्रोकार्बन dibenzo (डीईएफ़, पी) chrysene के संपर्क में चूहों की तिल्ली से करने के लिए कैसे पता चलता है (पूर्व dibenzo (ए, एल) pyrene रूप में जाना जाता डीबीसी, DalP)। कुल मिलाकर, यह काम एक HPLC-प्रवर्तन निदेशालय कार्यप्रणाली आसानी से जैविक नमूने में 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है दिखाता है कि कैसे।
Introduction
जिसका स्थिर राज्य स्तर कई रोग की स्थिति और xenotoxic चयापचय के दौरान बढ़ा सकते हैं रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति की एक वृद्धि की आवृत्ति के लिए योगदान करते हैं। कई संभव nucleobases ऑक्सीकरण उत्पादों के अलावा, ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति आसानी से स्थिर मार्कर का उपयोग करके मापा जा सकता है 8-ऑक्सो-7,8-Dihydro-2'-deoxyguanosine 2 का ऑक्सीकरण रूपों में से एक है जो (8-ऑक्सो-dGuo), ' -deoxyguanosine (dGuo) 1। 8-ऑक्सो-dGuo इसलिए, कई डीएनए ऑक्सीकरण उत्पादों 3 के अस्तित्व के बावजूद एक डीएनए ऑक्सीकरण बायोमार्कर के रूप में अधिक से अधिक विस्तार करने के लिए अध्ययन किया गया है, सबसे प्रचुर मात्रा में डीएनए घाव 2 और। इंसानों में, इस नुकसान 8 oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4 से बेस छांटना मरम्मत के माध्यम से ठीक किया जा सकता। गैर-मरम्मती के लिए छोड़ दिया है, 8-ऑक्सो-dGuo आधार जोड़ी-प्रतिस्थापन म्यूटेशन के गठन (यानी, जी transversions टी करने के लिए) के लिए योगदान कर सकते हैं 4। महत्वपूर्ण बात है, 8-ऑक्सो-dGuo की स्थापना की एक मार्कर के लिए हैदीक्षा और कैंसरजनन 2 की पदोन्नति के संबंध में आर डीएनए की क्षति। इसलिए, 8-ऑक्सो-dGuo की सही मात्रा का ठहराव ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति 5 का एक उपयोगी और वांछनीय बायोमार्कर है।
इसके अलावा, यौगिक (ओं) का सही नाम नियमित ऑक्सीडेटिव डीएनए की क्षति 6 के एक बायोमार्कर के रूप में मापा oxidatively क्षतिग्रस्त 2-deoxyguanosine के रूपों और, के लिए सही नाम के बारे में साहित्य में बड़े पैमाने पर भ्रम की स्थिति है। 8-ऑक्सो-dGuo (चित्र 1 में दिखाया गया है) के 6,8-diketo और 6-enol, 8-कीटो tautomeric रूपों साहित्य 5,7 में चर्चा की दो सबसे प्रमुख tautomers हैं। 6,8-diketo फार्म 7.4 के शारीरिक पीएच पर सबसे प्रमुख रूप है, और सबसे प्रमुख डीएनए ऑक्सीकरण उत्पाद 7 है। इसलिए, 8-ऑक्सो-dGuo, बजाय 8-हाइड्रोक्सी-dGuo इस ऑक्सीकरण उत्पाद 6 के लिए सबसे उपयुक्त नाम है। बल्कि यह nucleob की तुलना में, कि 2-deoxyguanosine (dGuo) नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैएएसई गुआनिन (गुआ) या ribonucleoside ग्वानोसिन (गुओ), क्रमशः, सबसे विधियों 6 से पता चला है।
सटीक पहचान और 8-ऑक्सो-dGuo की मात्रा का ठहराव की वजह से चुनौती दे रहा है: डीएनए नमूने के पाचन में मैं) परिवर्तनशीलता, द्वितीय) आकस्मिक नमूना तैयार करने के दौरान हो सकता है कि 8-ऑक्सो-dGuo को dGuo के ऑक्सीकरण, और तृतीय) की आवश्यकता विश्लेषणात्मक एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय विधि 8 के प्रभावी सत्यापन के लिए। इस प्रोटोकॉल में, हम पूरी डीएनए पाचन के लिए अनुकूल और द्वितीय) में शामिल किए जाने धातु chelator और chelator इलाज समाधान और एक विशेष डीएनए को अलग अभिकर्मक ने तीन) केवल आंशिक रूप से शामिल किए जाने से संबोधित किया गया था, जबकि स्थिति, उपलब्ध कराने के द्वारा मैं) को प्राप्त करने के उद्देश्य से सकारात्मक नियंत्रण है और इस प्रकार विधि जैविक नमूने में 8-ऑक्सो-dGuo पता लगाने में सक्षम है कि प्रदान करते हैं। आगे मान्यता इस पत्र के दायरे से बाहर है। हालांकि, हम इस प्रोटोकॉल भावी मदद मिलेगी कि विश्वास कर रहे हैंउपयोगकर्ताओं के लिए जो वे औपचारिक रूप से अपने उद्देश्यों पर निर्भर करता है, प्रोटोकॉल को मान्य करने की आवश्यकता करने के लिए सीमा निर्धारित। विधि की औपचारिक सत्यापन के लिए आवश्यक कदम की एक सूची आगे प्रदान की जाती है। 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने के लिए एक विधि का विकास और तैनाती के दौरान प्रकाशित तरीकों की समीक्षा की और समेकित थे। इस प्रकार, इस विधि 8-ऑक्सो-dGuo का पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए विधि सफलतापूर्वक अपनाया गया है तो भी परीक्षण के लिए तेजी से और सीधा साधन उपलब्ध कराने, जबकि अक्सर महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक विवरण की कमी है कि कई प्रकाशित स्रोतों से जानकारी इकट्ठा करने के लिए की आवश्यकता समाप्त। यह अनुकूलित विधि सफलतापूर्वक संवर्धित कोशिकाओं और murine ऊतकों से डीएनए नमूने का विश्लेषण करने के लिए नियुक्त किया गया था। इस वीडियो लेख एचपीएलसी-प्रवर्तन निदेशालय द्वारा विश्वसनीय पता लगाने और 8-ऑक्सो-dGuo की मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रभावी तरीका स्थापित करने में अन्य समूहों की सहायता करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
8-ऑक्सो-dGuo डीएनए ऑक्सीकरण का एक उपयोगी बायोमार्कर के रूप में सूचित किया गया है, अपने विश्वसनीय मात्रा का ठहराव एक चुनौती बन सकते हैं। कई प्रकाशित तरीकों मौजूद हैं, उनके प्रयोगशालाओं में विधि को तैनात कर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध स्वास्थ्य कनाडा जीनोमिक्स रिसर्च एंड डेवलपमेंट इनिशिएटिव (GRDI) और जैव प्रौद्योगिकी के लिए नियामक कनाडा रणनीति (CRSB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखकों के हितों का कोई विवाद नहीं है।
Materials
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E.coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2′ -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- . . Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).
