Summary
Целью этого протокола является определение степени окисления ДНК-маркера, 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo) с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных.
Abstract
Оксидативный стресс, связанный с многих физиологических и патологических процессов, а также метаболизма ксенобиотиков, приводит к окислению биомакромолекул, в том числе ДНК. Таким образом, эффективность обнаружения окисления ДНК важно для различных исследовательских дисциплин, в том числе медицины и токсикологии. Общий биомаркер окислительного поврежденной ДНК является 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo; часто ошибочно называют 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозин (8-OH-dGuo или 8 оксо-DG)). Несколько протоколов для 8-оксо-dGuo измерения методом жидкостной хроматографии под высоким давлением с электрохимическим детектированием (ВЭЖХ-ЭД) были описаны. Тем не менее, они были в основном применяется для очищенной ДНК, обработанной прооксидантов. Кроме того, из-за методологических различий между лабораториями, в основном из-за различий в аналитическом оборудовании, принятие опубликованных методов обнаружения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД требуется тщательная оптимизация по каждой лаборатории.комплексный протокол, описывая такой процесс оптимизации, не хватает. Здесь Подробный протокол описан для обнаружения 8-оксо-dGuo с помощью ВЭЖХ-ЭД, в ДНК из культивируемых клеток или тканей животных. Это показывает, как подготовка проб ДНК может быть легко и быстро оптимизированы, чтобы свести к минимуму нежелательное окисление ДНК, которые могут возникнуть при подготовке пробы. Этот протокол показывает, как определить 8-оксо-dGuo в культивированных человеческих клеток аденокарциномы альвеолярного (т.е. клетки А549), обработанные с окислителем KBrO 3, и из селезенки мышей, подвергнутых воздействию полициклических ароматических углеводородов дибензо (DEF, р) хризена (DBC, ранее известный как дибензо (, л) пирена, DalP). В целом, эта работа показывает, как методика ВЭЖХ-ЭД может быть легко оптимизирована для обнаружения 8-оксо-dGuo в биологических образцах.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК), чьи стационарное уровни могут увеличить в течение многих патологических состояний и xenotoxic метаболизма, способствует увеличению частоты окислительного повреждения ДНК. Среди нескольких возможных нуклеотидных продуктов окисления, окислительного повреждения ДНК легко может быть измерена с помощью стабильного маркер 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dGuo), который является одним из окисленных форм 2 ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-оксо-dGuo является наиболее распространенным поражение DNA 2, и, следовательно, был изучен более подробно в качестве биомаркера окисления ДНК, несмотря на существование нескольких продуктов окисления ДНК 3. В людях, это повреждение можно отремонтировать с помощью базовой ремонта вырезания на 8-оксогуанин гликозилазы 1 (hOGG1) 4. Если осталось без ремонта, 8-оксо-dGuo может способствовать формированию базовых мутаций пара-замещение (т.е. е к т трансверсии) 4. Важно отметить, что 8-оксо-dGuo является установленным маркером FOг повреждение ДНК в отношении установления и развития канцерогенеза 2. Таким образом, точное определение количества 8-оксо-dGuo является полезным и желательным биомаркер окислительного повреждения ДНК 5.
Существует распространенное заблуждение в литературе о правильных названий окислительно-поврежденных форм 2-дезоксигуанозина и, кроме того, правильное название соединения (ий) обычно измеряется в качестве биомаркеров окислительного повреждения ДНК 6. В 6,8-дикето и 6-енольные, 8-кето таутомерные формы 8-оксо-dGuo (показано на рисунке 1) являются двумя наиболее видные таутомерам, обсуждаемые в литературе 5,7. Форма 6,8-дикето является наиболее заметной формой при физиологическом рН 7,4, и наиболее заметным продуктом окисления ДНК 7. Таким образом, 8-оксо-dGuo, а не 8-гидрокси-dGuo является наиболее подходящее название для этого продукта окисления 6. Важно также отметить, что 2-дезоксигуанозин (dGuo), а не nucleobаза гуанин (гуа) или рибонуклеозид гуанозин (Го), соответственно, обнаружена в большинстве методов 6.
Точное обнаружение и количественное определение 8-оксо-dGuo является сложной задачей из-за: я) изменчивости в переваривании образца ДНК, II) случайный окисление dGuo 8-оксо-dGuo, которые могут возникнуть во время подготовки образца, и III) необходимость для эффективного проверки результаты анализа методом ВЭЖХ-ЭД 8. В этом протоколе, мы нацелены на достижение I), обеспечивая условия, благоприятные для полного переваривания ДНК и б) путем включения хелатор металла и хелаторных обработанных растворов и специального ДНК-выделении реагента, а III) был только частично решены путем включения Положительные контроли и, таким образом, обеспечивая, что метод способен обнаруживать 8-оксо-dGuo в биологических образцах. Кроме того проверка выходит за рамки данной статьи. Тем не менее, мы уверены, что этот протокол поможет перспективнымпользователи определяют степень, до которой они должны формально подтвердить протокол, в зависимости от их целей. Перечень шагов, необходимых для формального проверки метода обеспечивается дальше. В ходе разработки и развертывания метода для обнаружения 8-оксо-dGuo, опубликованных методов были рассмотрены и консолидированы. Таким образом, этот метод устраняет необходимость сбора информации из нескольких опубликованных источников, которые зачастую не имеют важные экспериментальные детали, а также предоставляет быстрый и простые средства тестирования, если метод обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo успешно принят. Это адаптировать метод был использован для успешного анализа образцов ДНК из культивируемых клеток мышиной и ткани. Это видео статья поможет другим группам в создании эффективного способа для надежного обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Убедитесь, что все животноводство, жилье, обработки и эксперименты в соответствии с местными нормами и правилами и что экспериментирование протоколы утверждаются до начала каких-либо исследование. Для описанных экспериментов, уход за животными, обработка и лечение были одобрены Комитетом по уходу здравоохранения Канады животного. Смотрите таблицу "Реагенты" для информации поставщиков.
1. Сбор биологических образцов
- Клетки или тканями животных
- Выращивают альвеолярных клеток А549 аденокарциномы человека в F12-К среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Семенной клетки примерно в 1 миллион клеток на 10 см пластины. Для каждого эксперимента, использовать набор из 12 пластин в общей сложности (три пластины в одной биологической повторности х четыре дозы), чтобы обеспечить достаточно ДНК (80 мкг) для ферментативного переваривания и анализа ВЭЖХ.
- Когда плотность клеток становится больше, чем примерномерно 70% от площади поверхности пластины, удалить носитель и промыть клетки дважды 4 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,4.
- Для культивируемых клеток животных, используют KBrO 3 в качестве положительного контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: положительный линейный отношения между KBrO 3 концентрации и частоты 8-оксо-dGuo сообщалось в литературе 9. - Растворите KBrO 3 в PBS. Убедитесь, что конечная концентрация в среде для культивирования клеток больше, чем 1 мм, чтобы получить статистически значимое увеличение 8-оксо-dGuo по отношению к не-подвергаются клетки. Добавить ту же концентрацию KBrO 3 к каждой пластине в серии (например, 12 10 см пластинах).
- Инкубируйте пластин в течение 3 ч при 37 ° С. Удалить СМИ и мыть один раз PBS.
- Добавить 1 мл раствора трипсина (акций концентрации 2,5 г / мл) и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С.
- Промыть 4 мл PBS, сбора клеток из каждого набора в единый 50 мл коническую polystyrен центрифужную пробирку, и центрифугируют при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Удалить PBS и хранить осадок клеток при -80 ° С до дальнейшего анализа. Окисление Искусственный ДНК может быть дополнительно уменьшена путем ядерного изоляции, как описано в другом месте 10.
- Тканях животных
- Доза животных, как требуется. Для этого протокола, взрослые (9-недельного возраста) лечения мужского Muta мышь через желудочный зонд ежедневно в течение трех дней подряд с 20 мг DBC / кг живой массы в растворенном в оливковом масле день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот трансгенных животных гавани инженерии λ-бактериофаг и мутации гена LacZ репортер из Е. палочка 11 используется для трансгенных грызунов мутации анализов 12. - Выполните животных вскрытии например, под наркозом мыши могут с помощью изофлуран а затем с помощью эвтаназии смещением шейных позвонков с последующим открытием полости грудной клетки. Сразу мигать замораживание ткани в жидком азоте. Магазин тканей при -80 ° С до анализа.
Примечание: Время эвтаназии после обработки может быть другим важным параметром (например, окисление ДНК была максимальной при 72 ч после воздействия шума в головном мозге крыс и печени 13).
- Доза животных, как требуется. Для этого протокола, взрослые (9-недельного возраста) лечения мужского Muta мышь через желудочный зонд ежедневно в течение трех дней подряд с 20 мг DBC / кг живой массы в растворенном в оливковом масле день.
2. ДНК Добыча, осадки и промывка (для тканей приступить непосредственно к 2.2)
- Однородный собранные клетки в 50 мл коническую центрифужную пробирку из полистирола с 1 мл ДНК изоляции агентом, таким как DNAzol. Используйте кончик 1000 мкл пипетки, чтобы разогнать осадок клеток, пока раствор не станет однородной. Передача гомогената к новому 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Инкубируют на льду в течение 10-20 мин. Перейдите к 2.3.
- Перемешать 15-20 мг ткани в 1 мл КПК антипригарной стеклянном гомогенизаторе, содержащем 500 мкл выделения ДНК агента. Аккуратно поднимать и опускать гомогенизатор около 1 мин; мягкие ткани потребуется меньше времени. Бережное обращение обеспечивает меньше стрижка ДНК. Хранить гомогената на льду в течение примерно 10-20 мин.
- ГранулаГомогенат центрифугированием в течение 10 мин при 10000 х г и 4 ° С в 1,5 мл коническую центрифужную пробирку.
- Тщательно передачи полученного супернатанта в новую 1,5 мл трубки микроцентрифужных обращая особое внимание, чтобы избежать контакта гранул.
- Осадок ДНК из гомогената путем добавления 0,5 мл 100% этанола на 1 мл гомогената. Обратить труб 10 раз, чтобы убедиться изолирующий реагент и этанола достаточно смешанные.
- В этот момент, осадок ДНК вязкая, катушка его на кончике пластмассовой пипетки (например, с максимальной удерживающей способности 200 мкл) и затем переносили в новую 1,5 мл коническую центрифужную пробирку.
Примечание: Краткое центрифугирования могут быть использованы для удаления остатков лизат из выделенной ДНК.
(ДНК Вымойте и Солюбилизация) - Добавить 1 мл 75% этанола в изолированной ДНК. Приостановить осадок ДНК тщательно обращением труб 10 раз.
- Тщательно слейте этанола из трубки. Убедитесь, что ее ДНК гранул прилипает к стороне трубки. Хранить пробирки вертикально в течение 1-2 мин и использовать пипетку, чтобы удалить избыток EtOH из нижней части трубки.
- Повторите ДНК мыть еще раз, и либо хранить образцы в EtOH при -20 ° С (стабильной в течение нескольких месяцев) или сразу перейти к перевариванию.
- Растворите ДНК в пищеварении буфера (описано ниже), а затем количественно с использованием стандартных спектроскопических методов (т.е. поглощение при 260 нм с использованием спектрофотометра NanoDrop).
3. ферментативного расщепления
- Подготовка "пищеварение буфер" путем объединения соответствующих объемов (в зависимости от количества образцов, чтобы быть переварены) 50 мМ одноосновного фосфата натрия (содержащего 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ Desferal (ДФО) и 200 мМ MgCl 2) с 50 мМ двухосновного фосфата натрия (также содержащий 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ ДФО и 200 мм MgCl 2). Каждый образец требуется 4,0 мкл одноосновных и 17,0 мкл вторичный кислый фосфат решения. <LI> Удалить все оставшиеся EtOH из нижней части образцов труб и воздушно-сухих около 5 мин. Убедитесь, что ДНК не полностью высохнуть.
- Растворить 80 мкг экстрагированной ДНК в 21,0 мкл буфера пищеварения, добавить 1 единица ДНКазы I, растворенного в 2,0 мкл буфера пищеварения.
- Вихревой слегка, чтобы получить тщательное перемешивание и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 ° С.
- В конце инкубационного периода, добавить 216,4 мкл 50 мМ двухосновного фосфата Na раствора, содержащего 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ ДФО и 200 мМ MgCl 2.
- Подготовка "пищеварение буфера-2" путем комбинирования одного объем буфера пищеварения с девяти томах двухосновных, 50 мм фосфата натрия (с 2,0 мм KCl, 1,0 мМ ДФО и 200 мм MgCl 2).
- Добавить 0,025 единиц фосфодиэстеразы (ФДЭ) я фермента в 16,3 мкл буфера пищеварения-2. Пипетка вверх и вниз в течение нескольких секунд, а затем вихрь слегка, чтобы получить тщательное перемешивание и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 ° С.
- Добавить 00,4 единицы щелочной фосфатазы (AP) в 8,0 мкл буфера пищеварения-2. Пипетка вверх и вниз в течение нескольких секунд, а затем вихрь слегка, чтобы получить тщательное перемешивание и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 ° С. Добавить 33,0 мкл ВЭЖХ метанолом.
- Запуск перевариваются образцы ДНК с помощью ВЭЖХ, а не описано ниже, сразу или хранить при температуре -80 ° С до использования, чтобы свести к минимуму окисление. ПРИМЕЧАНИЕ: 1,5-ч шаги пищеварения, предлагаемые здесь, основаны на таких интервалах предложил в другом месте 9 и на выводах, что подобные протоколы достичь полного переваривания ДНК 9. Таким образом, предполагалось, что единственным ограничивающим фактором для достижения полного переваривания было время, и что фермент, ингибирование и образец неоднородности были незначительны.
4. ВЭЖХ Пробег: Подготовка подвижной фазы, приборостроения установки и технического обслуживания
- Используйте сверхчистой воды, чтобы подготовить все буферные растворы и обрабатывают высокой прочности связи смолы (например, Chelex 100: стирол divinylbenzene сополимер с иминодиацетатную ионов, что хелатные переходных металлов с высоким сродством) к минимуму загрязнение металла и окисления ДНК пробоподготовки.
- Подготовьте 250 мм Na фосфатный буфер, рН 6,2. Использование соотношении 1: 3,6957 из двухосновного фосфата натрия (FW = 177.99 г / моль), чтобы одноосновного фосфата натрия (FW = 119.98 г / моль).
Пример: Таким образом, для 3 л раствора объединить 70,81 г одноосновной и 28,43 г порошка двухосновной, добавить воды до, например, 2,8 L и убедитесь, что рН раствора 6,2. Отрегулируйте рН с 250 мм моно или двузамещенный фосфат натрия решений, подготовленных отдельно, а не концентрированных кислот или оснований. Добавить 2,24 г KCl, чтобы получить концентрацию 10 мМ KCl. - Подготовка подвижной фазы в три бутылки, по крайней мере, 1 л каждая, содержащий: растворитель B - ВЭЖХ-класса метанола, растворитель - B сверхчистой воды и растворителя C - фосфатный буфер с шагом 4,2. Вставьте ВЭЖХ подвижной фазы трубки питания в бутылках; remainiнг трубки должны быть также погружают в одну из бутылок (например, раствор C) и грунтуют, даже если они не требуются для смешивания.
- В перспективе, смешать фазовые мобильных решений как 6% растворителя А, 74% В и растворителя 20% C растворителя для достижения конечного раствора 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6,2) с 2,0 мМ KCl, 6% MeOH.
- Снять электрод из электрохимического детектора, разобрать его и очистить ссылку и рабочие электроды с чистящими электрод решений и шлифовальные диски, рекомендованные производителем. Промыть очищенных поверхностей с особо чистой воды, вытрите воду осторожно и обеспечить детектор сухой перед включением системы на.
- Соберите детектор и подключить вход подвижной фазы к электроду. Включите потока и позволяют подвижной фазы, чтобы заполнить электрод перед установкой выпускной фазе трубки мобильного. Установите новый столбец перед началом оптимизации. Убедитесь, что установка находится в правильном направлении и Follows все рекомендации производителя.
- Включите КВУП приборов задолго (например, 1 час) образца анализы позволяют уравновешивание и снижение базовой шум. В Таблице 1, предложенных условиях; предел давления обратно должен быть установлен до 3000 фунтов на квадратный дюйм, чтобы избежать повреждения колонки. Включите дегазатора. Продолжить грунтовки насосы и установки градиента растворителя.
- Сухой премьер насосы в соответствии с инструкциями изготовителя. Для этого к влажному линии, когда подвижная фаза была заменена или впускной трубки подвергается воздействию воздуха.
- Найдите диск грунтовки и вставьте 10-15 мл пластиковый шприц там. Убедитесь, что шприц полностью вставлен перед открытием линии. Чтобы открыть линии просто поверните диск против часовой стрелки на один ход.
- Начните штрих с соответствующим выбором интерфейса ВЭЖХ. Осторожно потяните шприц для извлечения флюида в линии. После того, как жидкость течет, премьер завершения; Позволяет программезавершить пробег. Повторите для всех линий (обычно четыре, в зависимости от инструмента).
- Альтернативно, влажный простое, когда линии уже увлажненный с более ранней сухой расцвете (смотри ниже).
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда большое количество времени, прошедшее между использования (например, 2 недели или больше), сухой премьер рекомендуется. - Изменение состава компонентов подвижной фазы растворителей до 25% каждого с помощью пользовательского интерфейса ВЭЖХ. Из интерфейса, выберите опцию "Функция прямого", а затем выберите опцию "Мокрый" Премьер. Это будет премьер все линии в то же время.
- Убедитесь, что все воздух из системы путем наблюдения мокрой основную линию, как он поступает в контейнер для отходов. После хорошего расцвете, убедитесь, что не было пузырей слева в строке. Если пузырьки сохраняются, повторите грунтования.
- После того, как насос заполнен, начинают перемещение подвижной фазы ВЭЖХ. Использование интерфейса ВЭЖХ вручную изменить состав подвижной фазы до 6% метанола (растворитель A) и 94%Вода (растворитель В), и выбрать скорость потока 0,9 мл / мин. Разрешить 5 мин, чтобы очистить любую метанола из колонки стадии очистки.
- Через 5 мин, изменение состава до 6% метанола (растворитель А), 74% воды (растворитель B), 20% буфером (растворителем C), увеличивают скорость потока 1,0 мл / мин. Установить другие параметры, как в таблице 1, и установить предел противодавления до 3000 фунтов на квадратный дюйм, чтобы избежать повреждения колонки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможные проблемы с установкой ВЭЖХ включают дрейфующий базовый, сплит пика и интенсивность уменьшилась сигнала. Они, как правило, могут быть преодолены путем очистки колонку после каждого использования, частая очистка электрода, и обеспечение того, буферные растворы свободны от загрязнения (например, твердых частиц или микробного роста). - Запуск подвижной фазы около 1-1,5 ч, чтобы достичь стабильного сигнала линии.
- Использование интерфейса инструмент программного обеспечения, выберите параметры, как указано в таблице 1, и набор эксплуатацию время до 15 мин. Вводите СэмPLE. Использование увеличение времени работы для сложных образцов (эмпирически определить это путем наблюдения за наличие или отсутствие пиков после 15-минутного интервала).
ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение прибора позволяет программировать иллюстративный характер условиях бегать и установки для autosampling. - После работает уже завершены, выключите ячейку детектора с помощью интерфейса детектора. Важно следовать рекомендациям производителя относительно выключения детектора, как неправильного обращения и выключения может привести к повреждению прибора. НЕ выключайте ячейки путем переключения обратно детектора как это может привести к повреждению прибора.
- Ручное изменение фазового состава мобильный до 6% метанола и 94% воды. Запуск в течение 5 мин.
- Вручную уменьшить скорость потока 0,7 мл / мин, немедленно изменить состав до 50% МеОН и 50% воды. Запуск по крайней мере 20 мин. Невыполнение запустить этот шаг для рекомендованного времени может привести к повреждению колонки и детектора. Выключите поток,D затем выключите дегазатора.
5. Приготовление стандартов
- Подготовка буфера подвижной фазы, как описано в пунктах 4.1-4.3 выше. Важно использовать подвижной фазы ВЭЖХ для подготовки стандартов, чтобы избежать пиков в результате смешения разнородных растворов после инъекции пробы.
- Развести это решение один в пяти сверхчистой водой перед использованием, и окончательное решение должно содержать 6% МеОН.
- dGuo Стандартный
Примечание: высокий окислительный потенциал, необходимые для обнаружения dGuo может увеличить риск измерения вмешательства электроактивных соединений. Это может быть проверено, например, со стандартной кривой УФ-детектированием на dGuo при 260 нм, и сравнив ее с калибровочной кривой, созданной при обнаружении EC. Если оба выровнять хорошо (например, Дополнительное Рисунок 1) и матричные эффекты образец были приняты во внимание, можно приступить обнаружения dGuo УФ при 260 нм, а не обнаружения EC.- Вихрь на высокой скорости до dGuo полностью растворяется. Это основной инвентарь; хранить при -20 ° С в течение нескольких недель.
- Для создания вторичного dGuo запас (0,5 мм), разбавленной 143 мкл первичного dGuo складе в 857 мкл подвижной фазы ВЭЖХ. Храните на льду до использования и подготовить свежий ежедневно.
- Проведение дальнейших разбавлений, чтобы создать стандартную кривую (например, Таблица 2). Хранить растворы на льду и подготовить свежий ежедневно. Запуск стандарты в серии с экспериментальными образцами.
- До запуска, варьировать детектора напряжение, используя самую высокую концентрацию акций, чтобы найти оптимальное напряжение.
- 8-оксо-dGuo Стандартный
- Мера 1,0 мг 8-оксо-dGuo в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 0,1 мл МеОН ВЭЖХ. Вихрь на высокой скорости до 8-оксо-dGuo полностью растворяется. Это основной запас 8-оксо-dGuo. Хранить при -20 ° С в течение SEVEral недели.
- В отдельную пробирку, объединить 2,9 мкл первичного складе и 997,1 мкл подвижной фазы ВЭЖХ буфера, вихря. Это вторичный фондовый (10000 нм).
- Чтобы создать рабочий раствор для стандартной кривой (250 нм), объединить 24,4 мкл вторичного складе и 975,6 мкл буфера подвижной фазы.
- Выполните дальнейшие разведения, чтобы обеспечить решения, необходимые для создания стандартной кривой (например, таблица 3). Хранить растворы на льду и подготовить свежий ежедневно. Запуск стандарты с экспериментальными образцами.
- Определение
- Интеграция площадь под кривой для обоих 8-оксо-dGuo и dGuo с использованием стандартного программного обеспечения (как часть ВЭЖХ-компьютерный интерфейс, см Дополнительный рисунок 2А).
- Построить стандартную кривую (известную концентрацию в каждой пробе против площади под кривой (Дополнительное фиг.2В). Используя уравнение стандартной кривой, рассчитать соотношение для 8-оксо-dGuo / dGuo для каждого образца.
6. Электрофорез в агарозном геле
ПРИМЕЧАНИЕ: электрофорез в агарозном геле, может быть выполнена проверка полноты пищеварения ДНК.
- Подготовка 50x Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфер, путем растворения 242 г трис-основания (FW = 121,14) в 750 мл сверхчистой воды. Добавить 57,1 мл ледяной уксусной кислоты и 100 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0; ЭДТА будет полностью растворяются при рН раствора доводят до 8,0 с помощью, например, NaOH) и добавить сверхчистой водой до конечного объема 1 л Хранить при комнатной температуре, разбавить этот раствор 50x до использования.
- Взвесить 1 г агарозы и растворить его в 100 мл 1x TAE буфер, отопления в микроволновой печи в течение 1-2 мин. Носите защитные очки и средства защиты, чтобы избежать контакта с кипящей агарозы.
- не Охлаждают раствор вниз примерно до 50 ° С, добавить 5 мкл этидийбромида (Внимание: мутаген) и залить его в агарозном геле проточной аппарата. Вставьте расческу.
- Подождите, пока не затвердеет раствор, заливают TAE буфер на геле и загрузить образцы (объем зависит от размера гребень; правило, 10-20 мкл образца ДНК загружен, смешанный с управлением 6x красителя для визуализации и облегчает загрузку).
- Запуск гель, пока краситель не мигрирует примерно 2/3 длины геля (например, 45 мин при 150 V). Представьте полос ДНК под УФ-светом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
dGuo наблюдалось иметь время удерживания 4,7 мин, тогда как 8-оксо-dGuo имел врем удерживани приблизительно 6,4 минут (фиг.2А и Б). Существует около 1000-кратное различие в пиковых высот между двумя аналитов, как видно на фиг.2С. Вольтамперограммах для 8-оксо-dGuo и dGuo были получены путем запуска стандартов на рабочем потенциала в диапазоне от 0,2 до 1,1 В. оптимальной рабочей потенциал 8-оксо-dGuo была определена в 0,5 В, а 0,9 В течение dGuo (Рисунок 3). Эти потенциалы находятся в согласии с другими стеклянными угольных электродов, описанных в литературе 14,15. Предел обнаружения и динамического диапазона 8-оксо-dGuo и dGuo электрохимическим детектированием, как сообщается, в femtomole и наномолю диапазоне, соответственно 8,9. Стандартные кривые для dGuo и 8-оксо-dGuo следует работать ежедневно, чтобы обеспечить линейную обнаружения по приемлемого диапазона концентраций и надлежащее выполнениеANCE прибора (рисунок 4). Стандартные кривые при нанесении площадь пика как функция известной концентрацией аналита (Дополнительный рисунок 2), что позволяет рассчитать концентрацию анализируемого вещества в образцах из уравнения генерируемой из стандартных кривых.
Полное расщепление ДНК требуется для точных измерений частоты 8-оксо-dGua и несколько геномных методов варки ДНК были предложены 8,15,16. При необходимости, эффективность экстракции ДНК и пищеварения могут быть проверены с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг.5А) и ВЭЖХ-ED (фиг.5В). Дорожки с явным мазка ДНК на рисунке 5А (например, полосы 2, 4, 6, 9, 11 и 13) указывают на присутствие непереваренной ДНК, тогда образцы с переваренных фрагментов ДНК бежать гель и, таким образом незамеченными. Плато на рис 5B показывает, что дальнейшие incubatiна ДНК с пищеварением ферментов за 1,5 ч не приводит к большему количеству dGuo обнаружен, предполагая, почти полное переваривание после 1,5 ч. Кроме того, как электрофорез в агарозном геле и ВЭЖХ-ЭД были использованы для проверки полезность на основе фосфата пищеварения ДНК буфера, используемого здесь. Этот буфер хорошо подобраны к подвижной фазе HPLC и не приводят к появлению шума детектора обусловлено смешением разнородных решений (данные не показаны). Таким образом, переход от буфера предложено в литературе (например, Трис-HCl 8) в натрий-фосфатном буфере рекомендуется для этого протокола (слева по сравнению с правой стороны на фиг.5А). Пожалуйста, обратите внимание, что основные предположения для оптимизации пищеварения ДНК, что Ингибирование фермента и образец неоднородности были незначительными и время пищеварения был единственным ограничивающим фактором, как было указано выше. Возможность того, что неполное переваривание ДНК в результате фрагментов, которые слишком малы, чтобы быть DeteИДКТК на агарозном останков геля. Даже если такие систематическая ошибка будет влиять на все образцы одинаково, дальнейшие эксперименты (например, обработка культивируемых клеток с радиоактивной меткой про-окислителя 10) может быть проведена полностью исключить такую возможность.
В отличие от стандартных решений, расщепленную ДНК, то ли от изолированных клеток или тканей мышей, производится несколько дополнительных пиков (рис 6а и 6b). Они были далеки от пиков 8-оксо-dGuo и dGuo, но пики эксперименты как часть упражнений проверки изложенных в обсуждении необходимо изучить, если дополнительные пики (т.е., образца из-за примеси матричных эффектов, например) мешать количественного , 8-оксо-dGuo пика была подтверждена соответствие времени удерживания со стандартом; и, кроме того, повысить в 8-оксо-dGuo пика для образцов из клеток или животных, прошедших лечение про-окислителя (фиг.7). Pro-окислителя KBrO 3 участвует в одноэлектронного абстракции от гуанина, что приводит к образованию 8-оксо-dGuo 17. Следует отметить, что при отсутствии напряжения прооксидантного, 2,4 молекулы 8-оксо-dGuo на 10 7 dGuo были обнаружены в клетках А549 (7А). Это сопоставимо с 4,5 молекулами 8-оксо-dGuo / 10 7 dGuo, обнаруженных в клетках А549 с использованием наблюдаемых альтернативу, масс-спектрометрия на основе подхода, призванного решать потенциальные недостатки метода ВЭЖХ-ЭД 9. Лечение DBC (т.е. 20,0 мг в день DBC / кг веса тела в день в течение трех дней) повышение уровня 8-оксо-dGuo в селезенки мыши ДНК. Это также ожидаемый результат, так как РОС, как известно, производится в процессе метаболизма полициклических ароматических углеводородов в естественных условиях 8. Относительные уровни 8-оксо-dGuo в селезенке животных были неподчеркнутых 8.3-9.4 8-оксо-dGuo / 10 6 dGuo (7В), который находится в отличном agreemenт с опубликованными значений четырех молекул 8-оксо-DG / 10 6 dGuo измеренных в мышиных клеток селезенки в стандартных условиях с помощью ВЭЖХ-ЭД 18. 6 и 7 показывают, что уровни 8-оксо-dGuo выше базовой линии очень малы , Таким образом, если ДНК окисляется до более низких уровнях, чем здесь наблюдается, уровни 8-оксо-dGuo может быть неотличим от исходного, которые должны иметь в виду, потенциальными пользователями протокола.
Рисунок 1. Структура 8-оксо-dGuo и его таутомер 8-ОН-dGuo. Следует отметить, что 8-оксо-dGuo, а не 8-ОН-dGuo является основным таутомер при рН 7,4.
Рисунок 2. Срок хранения для dGuo (а) и 8-оксо-dGuo (б). HPLC-ED хроматограммы были получены из 10,0 мкл инъекции либо dGuo, (1,0 нмоль всего) или 8-оксо-dGuo (1000 общая фмоль) и обнаружен на 0,9 В (А) или 0,5 V (B). Пик удержания dGuo для составляло примерно 4,7 мин (А) и что для 8-оксо-dGuo была приблизительно 6,4 мин (B). Широкий пик на 2-3 мин, вероятно, вызвано нарушениями инъекций и не влияет (т.е. всегда присутствует на аналогичной интенсивности) в концентрации 8-оксо dGuo. (С) накладывается хроматограммы из двух отдельных инъекций, описанных в (а) и (В) обнаруживает УФ (260 нм). Эти стандарты были бежать в тот же день, используя одинаковые условия показы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
ES / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Детектор Оптимизация напряжения. (А) вольтамограмму dGuo (конечная концентрация 1 нмоль) обнаружено путем анализа ВЭЖХ-ЭД в диапазоне 0,7-1,1 В. (В) вольтамограмму 8-оксо-dGuo (конечная концентрация 500 фмоль) обнаружено путем анализа ВЭЖХ-ЭД в диапазоне 0,3-0,7 В. помощью трех независимых экспериментов (n = 3) ± стандартное отклонение показано. В некоторых случаях планки погрешностей меньше, чем черчения символов.
Рисунок 4. стандартной кривой для dGuo (A) и 8-оксо-dGuo (В). Десять микролитров либо dGuo или 8-оксо-dGuo вводили и измеренные с помощью ВЭЖХ-ЭД 0,9 V (A) или 0,6 V (B ). Средства трех независимых экспериментов (N = 3) ± стандартное отклонение показано. В некоторых случаях ошибка бары смAller, чем в заговоре символов.
Рисунок 5. Оптимизация пищеварения ДНК. (А) Восемьдесят мкг семенников лосося ДНК расщепляли, как описано в 8 Трис-HCl, глицин-ацетатный буфер (слева) или натрий-фосфатный буфер (справа). Электрофорез в агарозном геле (1,0%) проводили при 150 V в течение 45 мин. Дорожка 1 и 8: ДНК лестницы; полосы 2, 4 и 6: непереваренные ДНК; дорожки 3, 5, и 7: расщепленной ДНК; дорожках 9, 11 и 13: непереваренные ДНК (фосфатный буфер); полос движения 10, 12 и 14:. расщепленную ДНК (фосфатный буфер) (B) ДНК семенников лосося (80 мкг) переваривали в настоящее описание посредством инкубации с ДНКазой I, PDE I, и точки доступа для 0,5-2,5 ч на каждой стадии, в 50 мМ фосфатный буфер, содержащий хлорид магния и ДФО. Пятьдесят микролитров каждого образца, содержащего 7,3 мкг переваренной ДНК, анализировали с помощью ВЭЖХ (например, 0,9 В и 1 мл / мин Floж) для обнаружения dGuo. Рисунок показывает средства в трех независимых экспериментах (N = 3) ± стандартная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. хроматограммы для 8-оксо-dGuo обнаружения в культивируемых клетках (А) или животной ткани (В). (А) расщепленной ДНК из клеток А549, обработанных или не обработанных KBrO 3. (Б) расщепленной ДНК из селезенки DBC -обработанной мышей. Пики сдвигается влево из-за удаления защитной колонки (из-за повышения давления в аппарате, их позиция была подтверждена со стандартами). Стандарты и образцы запустить в тот же день с использованием идентичных условий выполненияS и 10 мл объемы инъекции, при скорости потока 1 мл / мин и 0,5 и 0,9 V для dGuo и 8-оксо-dGuo, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь , для увеличения версии панели А вот для панели B.
Рисунок 7. Количественное определение 8-оксо-dGuo в биологических образцах. Пики были интегрированы и по сравнению со стандартными кривыми (см Дополнительный рисунок 2 для более подробной информации) с получением уровни 8-оксо-dGuo в ДНК из клеток А549, обработанных KBrO 3 ( ), уровни или 8-оксо-dGuo в ДНК из селезенки DBC-обработанных мышей (В). Звезды (*) указывают статистическую значимость (р <0.05, Один дисперсионный анализ (ANOVA) (А), т-критерий Стьюдента (В)). Средства трех (A) или пяти (B) независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего показаны. Образцы были собраны 4 или 24 ч после 3-й день лечения.
| Подвижная фаза | 50,0 мМ Na фосфатный буфер, рН 6,2, содержащий 6% МеОН и 2,0 мМ КСl |
| Расход подвижной фазы | 1,0 мл / мин |
| Тип столбца | УМС-BASIC с облигационного сферической кремнезема |
| Длина колонки | 15 см |
| Колонка внутренний диаметр | 3,5 мм |
| Температура колонки | 35 ° С |
| Температура детектора | 29 ° С |
| Установка напряжения для 8-оксо-dGuo | +0,5 |
| Установка напряжения для dGuo | 0,9 В |
| Объем впрыска | 10,0 мл |
Таблица 1. Параметры прибора для обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo по ВЭЖХ-ЭД.
| нмоль | 100 нМ стандарт, мкл | ВЭЖХ Подвижная фаза, мкл | Разведение, сложите |
| 5 | 300 | 0 | 1 |
| 2.5 | 150 | 150 | 2 |
| 1 | 60 | 240 | 5 |
| 0,5 | 30 | 270 | 10 |
| 0,25 | 15 | 285 | 20 |
| 0,1 | 6 | 294 | 50 |
Таблица 2. </ STRONG> Подготовка стандартной кривой для dGuo.
| фмолей | 250 нМ стандарт, мкл | ВЭЖХ Подвижная фаза, мкл | Разведение, сложите |
| 2500 | 300 | 0 | 1 |
| 1000 | 120 | 180 | 2.5 |
| 500 | 150 | 150 | 5 |
| 250 | 150 | 150 | 10 |
| 100 | 120 | 180 | 25 |
| 50 | 150 | 150 | 50 |
Таблица 3. Получение калибровочной кривой для 8-оксо-dGuo.
Sup дополняющих Рисунок 1. Сравнение электрохимического (EC) и УФ-основе выявления dGuo. Стандартная кривая была создана для обнаружения dGuo электрохимическим обнаружения (ЕС) или УФ-детектированием (260 нм). Площади пиков были интегрированы для dGuo пика примерно в 4,7 мин обоими методами. N = 3, означает ± стандартное отклонение показано.
Рисунок 2. Дополнительное Количественное dGuo от стандартной кривой. Пример использования стандартной кривой, чтобы определить концентрацию dGuo показано. (А) Площадь пика может быть определена путем интеграции с использованием стандартного программного обеспечения. (Б) Эта информация используется построить калибровочную кривую для того, чтобы использовать уравнение линии для вычисления неизвестной концентрации анализируемого вещества в образце.52697 / 52697fig9large.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя 8-оксо-dGuo сообщалось полезным биомаркеров окисления ДНК, его надежность количественное может создать проблему. Хотя существует несколько опубликованных методов, есть необходимость всеобъемлющего, описательной обзор протокола, чтобы позволить исследователям развернуть метод в своих лабораториях. Здесь мы представляем подробный обзор протокола ВЭЖХ на основе, что позволит новых пользователей, чтобы установить эффективный метод для обнаружения и количественного 8-оксо-dGuo.
Три основных метода, которые были описаны для количественного определения 8-оксо-dGuo. Они включают твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) основе коммерческие наборы 19, жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии методы (MS) (например, как описано в другом месте 9 и методы ВЭЖХ-ED, такие как, как описано в данном документе. Методы ELISA могут страдать от помех с некоторых соединений в биологических образцах 19. В целом, результаты, полученные с помощью Chromatographic методы считаются более надежными для 8-оксо-dGuo количественного в сравнении с ИФА-методов, основанных 20. При сравнении методов ВЭЖХ-ЭД с методами МС-базирующихся, преимущество бывший относительно недорогое оборудование (т.е. примерно на порядок дешевле, чем оборудование для методов МС-базирующихся). Кроме того, ВЭЖХ-МС превосходят методов ВЭЖХ-ЭД, как бывший не склонны к потенциальных помех с электроактивных соединений и обеспечивают однозначные количественные измерения, используя изотопы 21.
Высказывались опасения по поводу использования традиционных методов экстракции фенолом по добыче геномной ДНК, которые будут использоваться для 8-оксо-dGuo количественного 22. Некоторые исследователи отмечают, что условия, связанные со стандартным экстракции фенолом можно ввести нежелательные dGuo окисления, таким образом, увеличивая базовый уровень 1,9. Для решения этой проблемы, ячейка и анимал геномной ДНК может быть извлечено и очищено с использованием модифицированного протокола 22 DNAzol. DNAzol содержит высокие концентрации гуанидинтиоцианата, и предыдущие исследования отметили 9 нижний базальный уровень 8-оксо-dGuo образование, когда DNAzol используется по сравнению с традиционными фенол- и методов добычи NaI основе. Железа хелатирующее соединение ДФО был использован, чтобы минимизировать АФК и окисления ДНК пробоподготовки. Как отмечалось выше, уровни 8-оксо-dGuo в безударном клетках А549 (7А) были очень похожи на то, что было измерено с помощью MS-метода, основанного 13. Это говорит о том, что включение мер предосторожности, описанных в МС на основе методов 13 разрешено минимизации нежелательного окисления ДНК в процессе подготовки и анализа проб, чтобы достичь точного 8-оксо-dGuo количественное с помощью ВЭЖХ-ЭД. Сроки вскрытии или промысловой культуры клеток после лечения прооксидантного может быть еще одним важным фактором, как видно здесь сокращается 8-оксо-dGuo уровнив селезенке на 24 ч по сравнению с 4 ч после последней обработки (фиг.7В). Это может быть связано с активацией ремонта базы эксцизионной устранить повреждение ДНК.
Два очевидных ограничений описанного способа: (1) Требование довольно больших количеств ДНК (примерно 80 мкг на образец для достижения трех технических повторов), и (2) потенциальные помехи от совместного элюирование соединений. Было установлено, что лишь очень небольшое (например, около 15 мг) часть селезенки (приблизительно 15% от общего веса ткани) было достаточно, чтобы получить 80 мкг ДНК, в результате чего достаточное количество ткани для друга (например, генная экспрессия) анализ. Количество добываемой ДНК является еще одним важным параметром, который влияет на окисление артефактом ДНК 23,24,25. Поэтому, работая с достаточно большим (~ 80 мг / образец), что мы предлагаем здесь согласуется с предыдущими рекомендациями использования> 30 мг свести к минимуму следов искусственной окисления ДНК 25.Для небольших тканей (например, гиппокамп), можно уменьшать протокол, чтобы начать с 20-30 мкг ДНК, так как это должно быть достаточно для 2-3 трасс. Большие количества ДНК, предположительно, способствовать решению пиков выше фонового шума, но это остается экспериментально проверена наличие потенциально мешающих веществ могут быть решены на индивидуальной основе случая, и очень важно, чтобы всегда включать образец ДНК из Одновременное в пробирке или в естественных условиях лечения с положительным контролем, что, как известно, вызывают окислительное повреждение ДНК (рисунок 7).
Несмотря на то, фосфата в фосфатных буферов, как сообщается, снизить активность щелочной фосфатазы, оптимизации методом эксперименты (Фигура 5) подтвердил, что фосфатный буфер легко может быть использован. Так фосфатный буфер содержится в подвижной фазе, его использование в пробоподготовки уменьшается шум детектора за счет зольвентиляционные смешивания. Таким образом, напряжение, буфер состав, выделения ДНК и пищеварение были оптимизированы и положительный контроли были включены. Кроме того, краткое описание способов эти переменные могут быть дополнительно оптимизированы отдельных лабораторий обеспечивается. Наша цель в том, чтобы производить метод, который может быть полезен для специалистов лабораторий, направленных на разработку теста для обнаружения и количественного определения 8-оксо-dGuo.
Тем не менее, отметим, что формальная проверка метода требуется, как указано в шагах проверок на Международной конференции по гармонизации технических требований, рекомендованных для регистрации лекарственных средств для человека (ICH) для проверки аналитических процедур (т.е., ICH Q2 ( R1) 26). Вкратце, элементы количественного проверки должны изучить анализа в: 1) точность (который может быть достигнуто путем включения образцов с различными количествами 8-оксо-dGuo шипами-в; 2) диапазон и линейность (линейный отклик по добсостава концентрация аналита; 3) точность (повторяемость и воспроизводимость); 4) Предел обнаружения (правило, точка, в которой отношение сигнала к шуму больше или равно 2-3; это может быть матрица-зависимого); 5) Предел количественного определения (концентрация, при которой реакция встречается некоторого заданного уровня, такие как 2 х стандартное отклонение управления; может быть матрица-зависимого); 6) Селективность / специфичность (способность обнаруживать аналит в сложных образцов по сравнению с ровными решений); 7) воспроизводимость (возможность получить тот же результат в разных лабораториях разными операторами); 8) надежность и пригодность системы. Как Цель проверки рекомендованной ICH, чтобы продемонстрировать, что это "подходит для его прямому назначению", и многие лаборатории, скорее всего, имеют разные цели, предполагаемые пользователи данного анализа должны проверить это до такой степени, считается необходимым. Точная количественная оценка 8-оксо-dGuo желательно в токсикологии и молекулярной медицины грехасе это может повысить понимание того, как окислительного стресса, и, более конкретно, окисление ДНК, механистически и эмпирически связаны с неблагоприятными последствиями для здоровья.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано Канада геномики исследований и развития инициативы в области здравоохранения (GRDI) и Стратегии канадской регулированию в области биотехнологии (CRSB). Авторы не имеют конфликта интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxo-dGuo standard | Cayman Chemical Company | 89320 | Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine"; see Fig. 1 and text for details. |
| Alkaline phosphatase | Sigma-Aldrich | P5931 | From E. coli |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | Chelates heavy metals |
| Desferoxamine mesylate | Sigma-Aldrich | D9533 | |
| dGuo standard | Sigma-Aldrich | D7145 | |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| DNA from salmon sperm | Sigma-Aldrich | D1626 | Sodium salt |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | TypeII, from bovine pancreas |
| DNAzol | Invitrogen | 10503-27 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 (e.g. with NaOH) |
| F12-K media | ATCC | 30-2004 | |
| Foetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
| Guard column | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 0204GC | Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Monobasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | Invitrogen | 15190-250 | |
| Phosphodiesterase I enzyme | Sigma-Aldrich | P3243 | Type II from Crotalus adamaneus venom |
| Teflon homogenizer | Thomas Scientific | 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively | Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed. |
| Trypsin | Invitrogen | 15050-065 | |
| YMC-BASIC column with bonded spherical silica | Chromatographic Specialties | YBA 99S03 1546WT |
References
- Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).
- Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis. J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).
- Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features. J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).
- Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature. Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).
- Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine. Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).
- Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., Møller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA. Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).
- Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3rd, Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair. Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).
- Park, J. -H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling. Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).
- Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).
- Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up. Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).
- Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).
- Test No. 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays. , Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD). Available from: http://www.oecd-ilibrary.org (2015).
- Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat. Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).
- European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).
- Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid. Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).
- Ravanat, J. -L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).
- Kawanishi, S., Murata, M. Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress. Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).
- Tahara, S., Kaneko, T. Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation. Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).
- Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA. Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).
- Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).
- Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA. Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).
- Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).
- Collins, A. R., Cadet, J., Möller, L., Poulsen, H. E., Viña, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells. Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).
- Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. Determination of new types of DNA lesions in human sperm. Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).
- Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).
- Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf (2015).
