Abstract
Zellen von Tieren, Pflanzen und Einzelzellen durch eine Barriere genannt Zellmembran in das Cytoplasma von außen trennt umschlossen. Zellschichten wie Epithelien bilden ebenfalls eine Barriere, die von außen nach innen oder verschiedenen Kompartimenten mehrzelligen Organismen trennt. Ein Schlüsselmerkmal dieser Hindernisse ist die differentielle Verteilung der Ionen über die Zellmembranen oder Zellschichten. Zwei Eigenschaften erlauben diese Verteilung: 1) Membranen und Epithelien zeigen selektive Permeabilität auf bestimmte Ionen; 2) Ionen werden durch Pumpen durch die Zellmembranen und Zellschichten transportiert. Diese Eigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebephysiologie und fungieren als Signal Hinweise nach der Beschädigung während der Reparatur oder unter pathologischen Zustand. Die ionenselektive selbst verweisMikroElektrode ermöglicht Messungen bestimmter Flüsse von Ionen, wie Calcium, Kalium oder Natrium auf Einzelzell und Gewebespiegel. Die Mikroelektrode enthält ein Ionophor Cocktail, der istselektiv durchlässig, um eine bestimmte Ion. Die interne Fülllösung enthält eine Reihe Konzentration des Ions von Interesse. Das elektrische Potential der Mikroelektrode wird durch die Außen Konzentration des Ions bestimmt. Da die Ionenkonzentration variiert, ändert sich das Potential der Mikroelektrode in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Ionenaktivität. Wenn vor und zurück in der Nähe einer Quelle oder Senke des Ions (dh in einem Konzentrationsgradienten aufgrund Ionenfluß) bewegt die Mikroelektrodenpotential schwankt mit einer Amplitude proportional zu der Ionenfluss / Steigung. Der Verstärker verstärkt das Mikroelektrodensignal und das Ausgangssignal wird auf dem Rechner aufgezeichnet. Ionenflusses kann dann durch Fickschen Diffusionsgesetz unter Verwendung der Elektrode Potentialschwankung, die Auslenkung der Mikroelektrode und andere Parameter, wie die spezifische Ionenmobilitäts berechnet werden. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail das Verfahren zur Berechnung der extrazellulären Ionenflüsse zu messen unter Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode eind präsentieren einige repräsentative Ergebnisse.
Introduction
Alle Tierzellen sind durch eine Lipiddoppelschicht-Membran, die das Zytoplasma von der äußeren Umgebung trennt umgeben. Die Zelle hält einen elektrischen Membranpotentials negativ innen, durch aktiven Transport von Ionen 1. Das Membranpotential ist eine gespeicherte Energiequelle, die die Zelle zu verwenden, um verschiedene molekulare Vorrichtungen in der Membran 2 zu betreiben. Neuronen und anderen erregbaren Zellen verfügen über große Membranpotentialen. Schnelles Öffnen von Natriumkanälen kollabiert das Membranpotential (Depolarisation) und erzeugt das Aktionspotential, das entlang der Länge des Neurons 2 transportiert wird. Abgesehen von diesen schnellen elektrischen Veränderungen, viele Gewebe und Organe erzeugen und aufrechtzuerhalten signifikante langfristige elektrische Potentiale. Zum Beispiel, Haut und Hornhaut-Epithel erzeugen und aufrechtzuerhalten transepitheliale Potenziale und extrazelluläre elektrische Ströme durch gerichtetes Pumpen von Ionen (vor allem Natrium und Chlorid) 3.
Zelt "> Während Messungen von endogenem extrazellulären elektrischen Strom unter Verwendung des vibrierenden Sonde 4-6 und Messungen der Membran oder transepithelialen Potentiale mit der Mikroelektrodensystem 7-10 ermöglichen die Messung der elektrischen Parameter der Zellmembranen und epithelialen Zellschichten, geben sie keinen Angabe der beteiligten Ionenspezies.Mikroelektroden mit selektive Ionophor können bestimmte Ionenkonzentration in der Lösung zu messen. Ionengradienten oder Flußmittel könnte mit zwei oder mehr Elektroden, die an verschiedenen Positionen gemessen werden. Jedoch würde die intrinsische Spannungsdrift jeder Sonde unterschiedlich sein, was zu ungenauen Messungen oder Detektion eines Gradienten, der nicht vorhanden war. Eine einzelne Elektrode in "selbstverweis" -Modus verwendet werden, wobei es bei niedrigen Frequenzen bewegt zwischen zwei Punkten löst dieses Problem. Nun ist die Ionenfluss kann vor dem Hintergrund einer relativ langsamen und stabilen Signaldrift zu sehen ist (siehe 3B). Die ionensensitiven Messsystem verwendet ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden auf kleine extrazellulären Flüsse von Ionen in der Nähe von Gewebe oder einzelne Zellen zu erkennen. Das System besteht aus einem Verstärker, der das Signal von der Mikroelektrode und einem Mikro-Schrittmotor und Treiber, um die Bewegung des Mikrokontrollverfahren. Die ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode, die den Stromkreis zu schließen sind, um den Verstärker über einen heads Vorverstärker (1A) verbunden ist. Computer-Software bestimmt, welche Parameter der Mikrobewegung (Frequenz, Entfernung) und zeichnet den Ausgang des Verstärkers. Der Schrittmotor steuert die Mikrobewegung über eine dreidimensionale Mikropositionierers. Ein Niederfrequenzvibrationsionenselektive Mikroelektroden wurde erstmals 1990 entwickelt, die spezielle Calciumfluss 11 zu messen. Sowie Calcium, sind kommerziell zugänglich Ionophor Cocktails jetzt für MICR machenoelectrodes empfindlich Natrium, Chlorid, Kalium, Wasserstoff, Magnesium, Nitrat, Ammonium, Fluorid, Lithium oder Quecksilber.
Grundsätzlich wandelt das selbst verweisende ionenselektive Mikroelektroden-Technik die Aktivität eines spezifischen Ions in einer Lösung gelöst, in ein elektrisches Potential, das von einem Voltmeter gemessen werden kann. Das Ionophor Cocktail ist eine nicht mischbare Flüssigkeit (organisch lipophile Phase) mit Ionenaustauscheigenschaften. Das Ionophor selektiv Komplexe (bindet) spezifische Ionen reversibel und überträgt sie zwischen der in der Mikroelektrode (Elektrolyt) enthaltenen wässrigen Lösung und der wässrigen Lösung, in der die Mikroelektrode eingetaucht ist (Figur 1D). Diese Ionentransfer führt zu einer elektrochemischen Gleichgewichts und eine Änderung des elektrischen Potentials zwischen der Mikroelektrode und der Referenzelektrode wird durch das Voltmeter gemessen. Die Spannung ist proportional zu dem Logarithmus der spezifischen Ionenaktivität nach der Nernst equation ermöglicht die Berechnung der Ionenkonzentration (2A und B).
Derzeit mehrere Systeme ermöglichen die Messung von Ionenfluss mit einem ähnlichen Konzept oder Prinzip. Zum Beispiel kann die Scanning ionenselektive Elektrode Technique (SIET) 12,13 oder der Mikroelektrode Ion Flux Estimation (MIFE) Technik, die von Newman und Shabala 14-16 entwickelt sind im Handel erhältlich und weit von der Forschungsgemeinschaft, um bestimmte Ionen zu bestimmen Flüsse an Zellmembran und Gewebe vorkommenden in einer Vielzahl von Tieren, Pflanzen und einzelnen lebenden Zellmodellen. Ionenselektive Mikroelektroden wurden verwendet, um Wasserstoff, Kalium- und Calciumflusses über die Pflanzenwurzeln 17, Chlorid Flussmittel in Ratten zu messen Hirnarterien 18 und in Pollenschläuchen 19, Wasserstofffluss in Skate Retinazellen 20, Calcium-Fluss in Mausknochen 21, verschiedene Ionen Flüsse in Pilzhyphen 22 und in rbei Hornhaut 23 und schließlich Calciumfluss während der einzelnen Zelle Wundheilung 12,24. Siehe auch die folgende Rezension für detaillierte Informationen über ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden 25.
Der folgende Artikel beschreibt im Detail, wie die Vorbereitung und durchführen Messung der endogenen extrazellulären Ionenflüsse mit der ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden-Technik auf Einzelzellebene.
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Protocol
1. Ionenselektive selbst verweisende Mikroelektroden-Vorbereitung
- Herstellung von ionenselektiven Mikro
- Wärme dünnwandigen Borosilikatglas Kapillaren zu ziehen, ohne Filament (1,5 mm Außendurchmesser, 1,12 mm Innendurchmesser) mit einem Mikroelektroden-Abzieher.
Hinweis: Diese gibt Tipps 3-4 & mgr; m im Durchmesser. Kleinere Spitzen haben höhere Widerstand, der Mikroelektroden anfälliger für elektronisches Rauschen macht und ist auch mit einer langsameren Reaktion auf eine Änderung in der Ionenkonzentration verbunden. Nützliche Informationen finden Sie in dem von Smith et al. 26 veröffentlichte Papier gefunden werden. - Silanisiert werden die Elektroden, die Innenfläche hydrophobe Retention des lipophilen lonophor Cocktail Hilfe zu leisten. Platzieren der Mikroelektroden in einem Metallgestell und Wärme O / N in einem Ofen bei> 100 ° C zu trocknen. Die Zahnstange ist eine Metallplatte mit 2 mm Durchmesser Bohrungen einen Teil des Weges durch. Platzieren Sie die Elektroden in die Löcher Spitze nach oben mit einem 250 ml glass Becher über sie.
- Am Morgen, schalten Sie den Backofen ausschalten und während isolierte Handschuhe tragen, entfernen Sie vorsichtig die Metallgestell mit den Elektroden und Becher in Position. Schließen Sie die Ofentür, um die Wärme zu halten.
- Anlegen von Latex oder Nitril Handschuhe, Kittel und Schutzbrille. Mit einem Kunststoff-Pasteurpipette einen Tropfen Silanisierung Lösung, die ich an der Basis jeder Elektrode (halten den Becher in Ort, verwenden Sie den Ausguss für Pipettenzugang). Die Silanisierung Lösung durch die Heizplatte verdampft und silanizes die Innenseite der Elektroden. Verwenden Sie einen chemischen Dunstabzugshaube für diese Stufe. Platzieren Sie die Zahnstange / Becher / Elektroden wieder in den heißen Ofen für ein paar Stunden, damit der verbleibende Silanisierung Lösung zu verdampfen.
Hinweis: Aus Sicherheitsgründen nicht drehen Sie den Ofen wieder ein. Legen Sie ein Etikett auf dem Ofen anzeigt, muss nicht eingeschaltet werden, da es schädlich und entzündbare Dämpfe enthalten. - Nach dem Abkühlen, speichern Sie die Mikroelektroden in einem Mikroelektroden-Vorratsglas inside ein Glas Exsikkator mit 400 g Trockenmittel. Mikroelektroden kann somit für viele Wochen gelagert werden.
Hinweis: Eine alternative Methode der Silanisierung ist in Smith et al 26. - Zutückgeben die Mikroelektrode mit 50 bis 100 ul (eine Länge von etwa 1 cm) einer Lösung, die 100 mM des Ions gemessen werden (siehe Tabelle 1 und 1B). Verwenden Sie eine Einweg-Kunststoff-Pasteurpipette Wärme in einem Bunsenbrenner zog zu einem feinen Faden. Spülen Sie die Pipette in dH 2 O danach zur Verstopfung zu verhindern.
Hinweis: Alternativ Einstellen der Ionenkonzentration der Verfüllung Lösung, die Konzentration der Ionen in der externen Lösung 27 entsprechen. - Beachten Sie die Mikroelektrode unter einem Binokular, um die Abwesenheit von Luftblasen sicherzustellen.
- Wenn Luftblasen vorhanden sind, tippen Sie auf die Mikroelektrode leicht mit einem Fingernagel, während die Elektrode senkrecht halten (Spitze nach unten) und / oder drücken Sie die Blases die Spitze, indem Gegendruck unter Verwendung einer Spritze mit einem Silikonschlauch Auswechseln der Nadel geändert.
- Tip-füllen die Mikroelektrode mit 15 bis 20 nl (eine Länge von 30-50 um) der ionenspezifischen Ionophor-Cocktail (siehe Tabelle 1). Setzen Sie einen kleinen Tropfen der Ionophor-Cocktail an der kurzen Seite eines Objektträgers. Beachten Sie die Mikroelektrodenspitze unter einem Binokular und verschieben Sie sie in Richtung der Objektträger, bis der Mikroelektrodenspitze das Ionophor Cocktail berührt nur etwa eine halbe Sekunde. Zeichnen Sie das Ionophor Cocktail in der Mikroelektrode durch Kapillardruck.
Hinweis: Vermeiden Sie eine lange Kolonne von Ionophor Cocktail, da dies erhöht die elektrische Widerstand der Sonde die sie anfällig für elektronische Störungen (Rauschen) machen können und verlangsamt auch die Reaktionszeit. - Montieren Sie die Mikroelektrode in einer geraden Mikroelektrodenhalter mit einem gold 1 mm Stecker und AgCl (Ag +) Draht (1B). </ Li>
- Bringen Sie den Mikroelektrodenhalter auf den Kopf der Bühne auf einem dreidimensionalen computergesteuerten elektronischen Mikropositionierer (Abbildung 1A) montiert.
- Setzen Sie den Mikroelektrodenspitze in Messlösung angemessen, dass die zu messende Probe (physiologische Kochsalzlösung, Kulturmedium, etc.), damit der Mikroelektroden, für eine oder zwei, oder sogar über Nacht hr stabilisieren.
- Wärme dünnwandigen Borosilikatglas Kapillaren zu ziehen, ohne Filament (1,5 mm Außendurchmesser, 1,12 mm Innendurchmesser) mit einem Mikroelektroden-Abzieher.
- Herstellung der Referenzelektrode
- Referenzelektroden (1C) sind die gleichen wie oben Kapillaren. Schneiden Sie die Kapillare mit einem Diamantstift in 5 cm Länge und an jedem Ende für 1-2 sec in einer Bunsenflamme feuerpoliert.
- Füllen dieser Elektroden mit ~ 200 & mgr; l einer 3 M Lösung von NaCl, CH 3 CO 2 K (Kaliumacetat) oder KCl mit 2% Agarose ist. Wählen Sie die Lösung in Abhängigkeit von der zu messenden Ions (der Bezugselektrode nicht den Ionen gemessen enthalten, siehe Tabelle 1). Mischendie Agarose und die Lösung und Wärme fast Kochen in der Mikrowelle. Rühren Sie die Agarose aufzulösen (die Lösung geht klar).
- Befestigen Sie die Referenzelektrode auf einem Kunststoffpasteurpipette und zeichnen Sie die heiße Lösung in die Kapillare.
- Löschen Sie die Elektrode in kaltem 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K oder KCl-Lösung und speichern Sie in diesem 3-M-Lösung in verschlossenen Röhrchen vor der Verwendung. Entsorgen Sie alle Referenzelektroden mit Luftblasen.
- Montieren Sie die Referenzelektrode in einer geraden Mikroelektrodenhalter (vorgefüllt mit 3 M Lösung) mit einem AgCl (Ag +) Pellet im Inneren und eine Gold 2 mm-Stecker (1C) und befestigen Sie die Elektrode und den Halter an einer manuellen Mikrostellungs auf einem Magnetständer montiert.
2. Ionenselektive selbst verweisende Mikroelektroden-Kalibrierung
- Vorbereiten der Kalibrierung Lösungen, die die Ionen von Interesse als in der Referenzlösung; siehe Tabelle 1 (zB Kulturmedien, physiologische Kochsalzlösung) ist. Das heißt, eine Kalibrierungslösung muß eine niedrigere Ionenkonzentration als in der Messlösung enthalten, und eine höher.
- Verwenden Sie beispielsweise Kochsalzlösung, die 1 mM K + enthält. Um diese Konzentration einklammern auflösen KCl-Pulver in entionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 10, 1 und 0,1 mM in seriellen Verdünnungen. Verwenden Sie diese Kalibrierungslösungen. Alternativ können mindestens zwei dieser Lösungen.
- Tauchen Sie die ionenselektiven Mikroelektroden und der Referenzelektrode in die Eichlösungen und lassen Sie den Spannungswert für 1 bis 3 Minuten stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung mit Hilfe der speziellen Software (siehe Tabelle 1).
- Da die Software speichert die Daten (Verstärkerausgang) als txt-Datei, kopieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. Zur Erstellung der Mikroelektrodenausgang (mV) gegen den Logarithmusdas molare Ionenkonzentration (2A).
- Tragen Sie eine lineare Regression und berechnen die Nernst-Steilheit, abfangen und R 2 Wert. Übernehmen Sie die Mikroelektrode, wenn die Nernst-Steilheit ist 58 ± 11 mV / Dekade für einwertige Ionen und 29 ± 11 mV / Dekade für zweiwertige Ionen (Kationen ist die Nernst-Steilheit positiv, für Anionen ist negativ). Darüber hinaus sollten gute Mikroelektroden haben eine starke lineare Korrelation (R 2> 0,9; 2B).
Hinweis: Das mV Ausgang des Verstärkers verwendet hier gibt mV Lesung mit einem zehnfachen Gewinn. Werte um einen Faktor zehn geteilt werden. - Verwenden Sie die lineare Regression Formel, um die rohen mV-Ausgang der Mikroelektrode in tatsächliche Ionenkonzentration (2B) zu konvertieren.
3. Die Validierung der ionenselektiven Mikroelektroden-Technik
- Herstellung eines künstlichen Quelle
- Künstlichen Quelle Kapillaren sind die gleichen wie Kapillarenüber. Hitze ziehen die Kapillare mit einer Mikroelektrode Puller, wie in Schritt 1.1.1.
- Verfüllen diese Kapillaren mit 200 ul einer 1 M Lösung von NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O oder pH 4 Puffer. Wählen Sie das künstliche Source-Lösung in Abhängigkeit von der zu messenden Ionen (siehe Tabelle 1).
Hinweis: Alternativ können Elektroden mit größeren Spitzendurchmesser (~ 20 & mgr; m) und ziehen Spitze seitig mit den gleichen Lösungen, sondern enthält 0,5-1% Agarose (Agarose wird jeden Großlösungsstrom zu verhindern). - Montieren Sie den künstlichen Quelle Kapillare auf einem Mikromanipulator und tauchen sie in die verwendet werden, um den Fluss der Ionen in den Proben zu messen Lösung. Verlassen die künstliche Lichtquelle in der Lösung für 30 min bis 1 h, um eine Stabilisierung des Gradienten zu ermöglichen.
- Validierung der ionenselektiven Mikro
- Eintauchen der ionenselektive Mikroelektroden etwa einen Zentimeter entfernt von der künstlichen Quelle Kapillare in der Lösung verwendet, diese Maßere der Fluss von Ionen an den Proben und schließen Sie die Schaltung mit der Bezugselektrode wie zuvor. Ließ sich der Spannungswert für 1-3 min stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung über das dedizierte Software für 1 bis 2 min. Dieser Wert entspricht der Pufferwert (in der Literatur auch als Referenz, Hintergrund oder Blindwert bezeichnet).
- Bewegen Sie den ionenselektiven Mikroelektroden bis etwa 5 um von der künstlichen Quelle und lassen Sie den Spannungswert für 1 bis 3 Minuten stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung mit Hilfe der Software für 1 bis 2 min.
- Das obige Verfahren wird durch Anordnen des ionenselektive Mikroelektroden 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 und 1280 & mgr; m entfernt von der künstlichen Quelle Kapillare.
- Extrahieren Sie die Daten als txt-Datei und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei.
- Berechnung der Ionenkonzentration entsprechend den mV Werte in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungswerte. Zeichnen Sie den Wert.
Neinte: Wird ein Ionenfluss vorhanden ist, erkennt der Mikroelektrode einen Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen den zwei Positionen (3B). Wenn die künstlichen Quelle enthält mehr Ionen der gemessen wird, als die Lösung Arten sollte die Konzentration höher ist nahe an der Quelle als weit entfernt sein, die Validierung der Fähigkeit des ionenselektive Mikroelektroden, die Richtung eines Ionenflusses korrekt zu erfassen (in diesem Fall Auslauf; für eine künstliche Waschbecken, mit geringeren spezifischen Ionenkonzentration als Messmedium, sollte Zustrom sein).- Berechnen Sie den Ionenfluss mit Fickschen Diffusionsgesetz: J = c μ (dc / dx) wobei c die Ionenkonzentration in der Lösung (mol cm -3), μ ist die Ionenmobilität (mol cm N -1 s -1) und dc die Konzentrationsdifferenz über den Abstand dx (cm) (2C). Ionenfluss-Daten werden in der Regel in pmol cm -2 s vorgestellt-1 Oder nmol cm -2 s -1.
Anmerkung:.. Eine alternative Methode der von Smith et al 26 beschriebene Ionenstromberechnung verwendet werden. Hauptunterschiede sind die Verwendung des Diffusionskoeffizienten anstelle der Ionenmobilität und die Subtraktion der Hintergrundionenflusses (auch Spannungsdrift oder Korrekturfaktor) aus der Messung des Ionenflusses in Kochsalzlösung ohne Probe berechnet. - Plotten der Mittelwert der Ionenflüsse jeder Stufe gegenüber dem Abstand von der Quelle (2D). Weg von der Quelle zu beobachten eine exponentielle Abnahme der Flusswert Validierung der Fähigkeit des ionenselektive Mikroelektroden auf unterschiedliche Größe der Ionenflüsse zu erfassen.
- Haben die künstlichen Quelle Validierungs einmal für jeden spezifischen Ions soll, um die korrekte Richtung und Größe Messungen mit einem großen Signal-zu-n validieren aufzuzeichnendenoise-Verhältnis.
Hinweis: Ion Flussmessung des Puffers ohne Proben gibt die Hintergrundebene oder Lärm. Typischerweise Puffer Messung keine deutlichen Schwankungen der Ionenkonzentration, die zu sehr kleinen Fluß, der unterschiedlichen Richtungen zeigt.
- Berechnen Sie den Ionenfluss mit Fickschen Diffusionsgesetz: J = c μ (dc / dx) wobei c die Ionenkonzentration in der Lösung (mol cm -3), μ ist die Ionenmobilität (mol cm N -1 s -1) und dc die Konzentrationsdifferenz über den Abstand dx (cm) (2C). Ionenfluss-Daten werden in der Regel in pmol cm -2 s vorgestellt-1 Oder nmol cm -2 s -1.
4. Vorbereitung der Messkammer
Hinweis: Vor dem Versuchen, sollten die zu messende Probe und wie die Probe zu befestigen und die Mikroelektroden immobilisiert werden.
- Für Xenopus laevis Oozyten Messungen schneiden Sie ein 1 cm Quadrat einer 800 & mgr; m Nylon-Mesh (Nitex mesh) und kleben Sie es in eine Kunststoff-Petrischale (1E).
5. Ion Flussmessung
- Messung der Ionenkonzentration in dem Puffer verwendet, um die Messungen auf der Probe in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungslösung auszuführen vorhanden. X. laevis Oozyten benötigen Marks Modifizierte Ringer (MMR). D100 NaCl, 2 KCl, CaCl 2, 1 MgCl und 5 HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl und HEPES in deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration (mM) zu erreichen. Den pH-Wert des Puffers auf 7,5 mit NaOH.
- Legen Sie die Probe in die Messkammer und bringen die ionenselektiven Mikroelektroden in der Nähe der Probe (etwa 10 & mgr; m entfernt) mit der Mikropositionierer in die geschlossene Position der Mikroelektrode (3A) zu definieren.
- Starten Sie den niedrigen Frequenz (0,3 Hz) Ausflug (100 um) der Mikroelektrode zwischen der geschlossenen Position und einer Position weg von der Probe (fernen) unter Verwendung der speziellen Software. Sicherzustellen, dass die Bewegung der Mikroelektrode senkrecht zur Oberfläche der Probe.
Hinweis: Der Ausflug der Mikroelektrode kann über die Software eingestellt werden. Große Auslenkung nimmt die Steigung zu lesen erlaubt eine einfachere Erkennung kleiner Flüsse während der Messung, während verlängert die Abtastzeit, und verringert die Zeitauflösung. Sehen- Starten Sie die Aufnahme mit Hilfe der Software. Die Mikroelektrode Pausen bei jeder Position und das elektrische Potential in mV auf dem Computer aufgezeichnet. Erhalten Sie Messungen für mindestens 2 min, wodurch Signalstabilisierung. Bei kurzen Zeitraffer-Experimente, Plattenpotentialänderungen an der Stelle von Interesse für den gesamten Zeitverlauf.
- Extrahieren Sie die Daten als txt-Datei und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei.
- Berechnung der Ionenkonzentration entsprechend den mV Werte in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungswerte. Zeichnen Sie den Wert.
Hinweis: Wenn ein Ionenfluss vorhanden ist, erkennt der Mikroelektrode einen Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen den zwei Positionen (3B).- Berechnung der Ionenfluss mittels Fickschen Diffusionsgesetz wie zuvor (Schritt 3.3.1).
- Wiederholen Sie den Messpuffer vor der Messung einer neuen Probe und wiederholen Sie die Prozedur des Flussmessung und die Berechnung für jedes neueProbe.
6. Statistische Analyse und Datenpräsentation
- Testen Sie die unabhängige Wirkung der Position und / oder der Zeit auf Ionenflüsse unter der Kontrolle Zustand mit Hilfe eines ANCOVA-Modell mit gemischten Effekten 28.
Hinweis: Kovarianzanalyse (ANCOVA) ist eine allgemeine lineare Modell, dass ein normales ANOVA und Regressions mischt, indem sowohl kategorische und kontinuierliche Maßnahmen, um als unabhängige Variable verwendet werden. Zusätzlich wird in der Gegenwart von korrelierten Fehler von wiederholten Messungen pro Individuum und eventuelle verschachtelte Effekte induziert werden gemischte Wirkungen Modelle verwendet werden, um genaue Schätzungen der festen als auch zufällige Effekte zu modellieren. - Berechnen Sie paarweise Vergleiche mit Student t -Test zwischen Gruppenebene mit Bonferroni-Korrektur für multiples Testen 28.
- Erzeugen Boxplots zum Ionenfluß Messungen nach Position und Zeit zusammenzufassen. Schließen p-Werte von der beschriebenen paarweisen Student toben (Figur 3D) und bestimmen Signifikanzniveaus von p-Werte wie folgt: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0.001 29
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Representative Results
Wir haben bereits gezeigt, dass Calcium-Einstrom erscheint nach Einzelzelle Verwundung 24. Wir haben daher die Frage, ob andere Ionenflüsse auf Einzelzell Verwundung auftritt. Wir haben das X. laevis Oozyten, ein gut etabliertes Modell für einzelne Zelle die Wundheilung 30-34 und elektrophysiologische Ableitung 24,35-39. Interessanterweise sind Kaliumionen mehr in X. konzentrierten laevis Oozyten (ca. 110 mM) 40 als in der extrazellulären Lösung verwendet (in MMR 1x: 1 mm), was ein Ausströmen von Kalium nach Verwundung. Um diese Hypothese zu bestätigen, haben wir den Kaliumfluss im Verlauf von X. laevis Oozyten Zellmembran Heilung mit der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode.
Um die Eizelle gewickelt, zuerst eine Kapillare Elektrode ziehen mit einem großen Düsengröße (~ 50 & mgr; m). Bringen Sie die Elektrode in eine gerade Elektrodenhalter und Montage auf einer manuellen Mikrostellungsregler. Wund die oocyte durch Berührung der Membran mit der Elektrodenspitze 24. Bald nach der Verwundung wir entdeckt einen großen Abfluss von Kalium (bis zu 250 nmol cm -2 s -1; 3B - D). Da die Membran Wunde verheilt ist, dieser Fluß vermindert, Rückkehr zu unverwundeten Flußwerte in der intakten Membran beobachtet (~ 5 nmol cm -2 s -1) ist, wenn die Wunde verheilt (bis zu 16 min nach der Verletzung; 3B - D). ANCOVA ergab eine signifikante Wirkung der Zeit nach der Verletzung auf Kalium Flussmessungen (p <0.001). Post-Hoc-Analysen zeigten deutlich den Kaliumausfluss erhöht bei 1-2 min (p <0,001) und bei 5-6 min (p <0,05), aber nicht bei 15-16 min nach der Verwundung im Vergleich zu intakten Zellmembran Zustand (3D). Wir schlossen daraus, dass bei Einzelzellen Verwundung, erscheint ein Ausströmen von Kalium auf der Ebene der Wunde, die du vermindernRing der Heilungsverlauf.
| Ion | Ionophor Cocktail | Elektrolytlösung (100 mM) | Bezugslösung (3 M) | Artificial-Source-Lösung (1 M) |
| Ca 2+ | Calciumionophor I Cocktail A (cat # 21048) | CaCl 2 2H 2 O | KCl | CaCl 2 2H 2 O |
| Na + | Natrium-Ionophor II Cocktail A (cat # 71178) | NaCl | KCl | NaCl |
| Cl - | Chloride Ionophore I Cocktail A (cat # 24902) | NaCl | CH 2 CO 2 K (Kaliumacetat) | NaCl |
| K + | Kalium-Ionophor I Cocktail A (cat # 60031) KCl | NaCl | KCl | |
| H + | Wasserstoff Ionophore I Cocktail A (cat # 95291) | pH-Wert 7,0 | KCl | pH-Wert 4,0 |
Tabelle 1:. Beispiele für häufig verwendete Ionophor Cocktails Ebenfalls gezeigt sind geeignete Lösungen in den Mikroelektroden zu platzieren, für die künstliche Quelle und um die Kalibrierung durchzuführen. Katalognummern sind von Sigma-Aldrich.
Abb. 1: Ionenselektive Mikroelektroden (A) Schematische Darstellung der ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektrodensystem. (B) ionenselektive Mikroelektrode. (C) Referenzelektrode. (D) Ionenaustausch zwischen der Lösung und der externen microelectrode über das Ionophor. (E) Schema der Messkammer für X verwendet laevis Oozyten.
Abbildung 2: Ionenselektive Mikroelektroden Kalibrierung, künstliche Quelle und Flussberechnung (A) Kalibrierkurve.. (B) Die Gleichung der Eichkurve und die Berechnung der Ionenkonzentration. (C) Berechnung der Ionenfluss. (D) Ionenfluss gemessen an bestimmten Abständen von der künstlichen Quelle (1 M KCl).
Abbildung 3: Entwicklung der Kaliumstrom bei X. laevis Oozyten Wunde während der Heilung. (A) Fotografie und Illustration der Exkursionder ionenselektive Mikroelektroden-Messionenkonzentration an X. laevis Oozyten Wunde; die gestrichelte Linie zwischen '' a '' und '' V '' steht für die animal-vegetativen Achse. (B) Darstellung der Variation der Kaliumionenkonzentration in X. laevis Oozyten Wunde während der Heilung. (C) Scatter (xy) Auftragung, die die mittlere und die Standardfehler der Kaliumflussmessung auf der Ebene der Wunde zu unterschiedlichen Zeit während X. laevis Oozyten Wundheilung. (D) zeigt Boxplot Kaliumflussmessung auf der Ebene der Wunde zu unterschiedlichen Zeit während X. laevis Oozyten Wundheilung (n = 16; p wie folgt angegeben Werte: *: p <0,05; ***: p <0.001).
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Discussion
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Messung der extrazellulären Ionenflüsse in vivo sind: die Verringerung der Geräusche, die korrekte Herstellung des ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode und die Positionierung der Probe und den beiden Elektroden.
Um den Lärm zu minimieren, sollte das Aufzeichnungssystem in einem geerdeten (geerdet) Faraday-Käfig, vorzugsweise mit einem Metall-Spitze (Schwingungsisolation) Tabelle, die ebenfalls geerdet ist, sein. Darüber hinaus sollte das Mikroskop Chassis auch geerdet werden. Quellen von elektrischen Störungen sind die Lichtquelle. Eine faseroptische "lüfterlosen 'Lichtquelle bewirkt minimale elektrische Störungen. Schließlich halten die Silberdraht und Pellet in der Mikroelektrodenhalter chlorierten auch minimiert Geräusche (dip in Natriumhypochlorit-Bleichmittel und spülen Sie in dH 2 O) .Die Anwesenheit von Luftblasen in der ionenselektiven Mikroelektroden oder in der Bezugselektrode wird in Messergebnis Scheitern als dieLeitfähigkeit der Mikroelektrode wird nil oder beeinträchtigt werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um die Elektroden unter dem Mikroskop vor der Montage auf die Halter zu verifizieren. Sehen Sie das Protokoll für die detaillierte Vorgehensweise, um Luftblasen zu entfernen. Die korrekte Positionierung sowohl der Probe und den Mikroelektroden, um verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Die Messung des Ionenflusses ist abhängig von der Auslenkung der Mikroelektrode und ihre Position relativ zu der Probe. Es ist wichtig, genau zu identifizieren den Bereich von Interesse, die auf der Probe gemessen wird und die Position der Mikroelektrode, eine senkrechte Bewegung von der Probe haben. Jede Auslenkung der Mikroelektroden in einer Weise, die nicht senkrecht zu der Probe wird in veränderter Ionenflüsse führen Messungen und erhöhte Variabilität zwischen den Proben.
Ionophor Cocktails gewidmet spezifische Ionen zu messen, beispielsweise Kalium-, kann auch erfassen die Anwesenheit von anderen Ionen, wie Natrium.In dem Fall, dass die Messlösung eine hohe Menge eines konkurrierenden Ionen zur Ionophor Cocktail enthält, ist es wichtig, die Selektivität der Ionophor Cocktail durch Verwendung des künstlichen Quelle Experiment bestimmen. Hier verwendet die Lösung Kultur X. laevis Oozyten (MMR) enthält eine hohe Konzentration von Natrium. Somit ist es wichtig, festzustellen, ob das Kalium Ionophor Cocktail verwendet spürt Natrium. Durch die Verwendung des Kalium-Ionophor Cocktail gefüllt Mikroelektroden, können wir versuchen, eine Natrium-Fluss zu messen unter Verwendung einer künstlichen Quelle, die hohe Natriumkonzentration enthält (1 M NaCl; siehe Tabelle 1) halten die gleiche Messlösung. Die chemische Gradienten begünstigt den Austritt von Natrium, sondern im Idealfall sollte kein Natriumfluss durch den Kalium-spezifischen Ionophor Cocktail nachgewiesen werden. Wenn ein signifikanter Durchsatz gemessen wird, sollte die experimentellen Bedingungen optimiert werden. Zum Beispiel könnte die Konzentration der konkurrierenden Ionen bis zu dem Punkt der m gesenkt werdenicroelectrode keinen Sinn mehr aus, während diese die Natriumflusses durch die Plasmamembran während Kalium Fluxmessungen was zu möglichen Störungen auswirken. Im Idealfall kann ein Korrekturfaktor von der künstlichen Quelle Experiment berechnet auf die Daten angewendet werden, oder ein anderes Ionophor Cocktail getestet werden können. Ionenfluss-Messungen unter Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode die die Messung der Ionenflüsse an Zellen und Gewebe in wäßriger Lösung auftritt. Messungen der Ionenflüsse in Zellen oder Geweben, die normalerweise in Kontakt mit einer Luftumgebung sind erfordert das Vorhandensein einer Lösung, die nicht von Natur aus in ihrer Umgebung vorhanden ist und daß die Ionenfluss und den Austausch, die unter normalen Bedingungen auftritt, zu ändern. Besondere Aufmerksamkeit hat man, um die Inhalte einer solchen Lösung zu definieren, und die Abweichung von der ursprünglichen, physiologischen Umgebung zu minimieren. Das Spektrum von Ionen, die durch die ionenselektive selbst verweis microele gemessen werden kannctrode Technik hängt von der Verfügbarkeit und der Existenz spezifischer Ionophor Cocktails selektiv für das interessierende Ion.
Ionenfluss-Messungen mit der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode durchgeführt werden in Lösung durchgeführt, in der Regel in der Nähe der Oberfläche von Zellen oder Gewebe, so dass die nicht-invasive Messung der extrazellulären Ionenflüsse. Dieses Verfahren erlaubt nicht die Messung der Ionenflüsse innerhalb Gewebe zwischen Zelle und interzellulären Raum. Die ionenselektive selbst verweisMikroElektrode ist nicht die einzige Methode, die Messung der Ionenflüsse ermöglicht in vivo. Eine alternative neue Verfahren nutzt fluoreszierende Bioelektrizität Reporter 41, der die Messung von Ionenflüssen, die nicht mit Mikroelektroden sind möglich ermöglicht. Diese Farbstoffe ermöglichen Messungen der Ionenflüsse innerhalb Geweben und Zellen und subzelluläre Lokalisierung zu erreichen. Diese Technik kann räumliche Informationen des Ionenflusses innerhalb Gewebe und Zellen, nicht aber Ionen ex erwerbenwechseln zwischen dem Gewebe und den extrazellulären Raum. Darüber hinaus sind die fluoreszierenden Biostrom Reportern in der Regel erzeugen semi-quantitative Daten. Die Verwendung von Mikroelektroden-basierte Technologie zu Ionenflüsse zu messen noch gültig ist und notwendig und bringt zusätzliche Informationen zur Verwendung von fluoreszierenden Reportern Bioelektrizität, so dass sie einander ergänzen und nicht als konkurrierende Techniken. Außerdem interessant jüngsten Entwicklungen gehören amperometrischen selbst verweisende Detektoren von Sauerstoff, Stickoxid und Neurotransmitter Dopamin und Glutamat 42,43. Amperometrische Sensor auf einer chemischen Reaktion an der Sensorspitze bezogen. New faseroptischen Mikroelektroden ("Optroden") wurden entwickelt, um nicht-invasiv metabolischen Sauerstofffluss 34,35 und mit hoher Selektivität und Sensitivität 45,46 pH 44 zu messen. Es ist nun auch ein Enzym-basierte Nanopartikel beschichtet Sonde empfindlich Glucose 47.
Wir haben gesehen, dass the ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode ermöglicht Messungen von extrazellulären Ionenflüsse in vivo. Ionen werden nicht nur zwischen den Zellen / Geweben und Extrazellularraum, sondern auch zwischen den Zellen und Geweben in lebenden Organismen ausgetauscht. Es ist wichtig, diese Technik mit anderen wie fluoreszierende Bioelektrizität Reportern, um die räumliche Auflösung der Ionenflüsse innerhalb Geweben zusätzlich zu den tatsächlichen Messungen der Ionenflüsse in der Nähe seiner Oberfläche zu schätzen zu kombinieren. Zusätzlich Ionenflüsse stellen einen wichtigen Teil der bioelektrischen Zustand, Zellen und Gewebe mit Zellmembranpotential, trans-Epithelien Potential oder extrazellulären elektrischen Ströme definiert. Ist es wichtig, zusätzlich zu der Messung der Ionenflüsse zu messen, die in Kombination Zellmembran und trans-Epithelien Potential sowie extrazellulären elektrischen Ströme 24.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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