Abstract
動物、植物、単一細胞からの細胞は、外部から細胞質を分離し、細胞膜と呼ばれるバリアによって囲まれています。例えば、上皮細胞層としても外側または多細胞生物の異なる区画の内部を分離するバリアを形成します。これらの障害の重要な特徴は、細胞膜または細胞膜を横切るイオンの微分分布です。二つの特性は、この配布を許可する：1）膜および上皮は、特定のイオンを選択的に透過性を表示します。 2）イオンは、細胞膜および細胞膜を横切るポンプを介して輸送されます。これらの特性は、組織の生理機能の維持に重要な役割を果たし、修理の際に、損傷後の手がかりを信号として機能し、または病理学的条件の下で。イオン選択自己参照微小電極は、単一の細胞および組織レベルでのカルシウム、カリウムやナトリウムなどのイオンの特定のフラックスの測定を可能にします。微小電極は、イオノフォアのカクテルが含まれています特定のイオンを選択的に透過。内部充填溶液は、目的のイオンの設定濃度が含まれています。微小電極の電位はイオンの外濃度によって決定されます。イオン濃度が変化するように、微小電極の電位がイオン活性の対数の関数として変化します。 （これはイオン束に濃度勾配で、すなわち ）イオンのソースまたはシンクの近くに前後に移動すると微小電極電位はイオンフラックス/勾配に比例した振幅で変動します。増幅器は、微小信号を増幅し、出力は、コンピュータに記録されます。イオン束は、その後、特定のイオン移動度として、電極電位変動、微小電極の偏位、および他のパラメータを使用して拡散フィックの法則によって計算することができます。本稿では、イオン選択自己参照微小電極のANを用いて細胞外のイオンフラックスを測定するための方法論を詳細に説明しますいくつかの代表的な結果を提示するdは。
Introduction
全ての動物細胞は、外部環境から細胞質を分離する脂質二重膜で囲まれています。セルは、イオン1の能動輸送により、内部の電気膜電位、負を維持します。膜電位は、細胞は、膜2に、様々な分子デバイスを動作させるために利用することができる保存されたエネルギー源です。ニューロンおよび他の興奮性細胞は、大きな膜電位を有します。ナトリウムチャネルの迅速な開口部は膜電位（脱分極）の崩壊と神経2の長さ方向に沿って搬送される活動電位を生成します。別にこれらの急速な電気的変化から、多くの組織や器官が発生し、重大な長期的な電位を維持します。例えば、皮膚、角膜上皮が発生し、イオンの方向励起（主にナトリウムと塩化物）3によって経上皮電位および細胞外の電流を維持します。
10トン">内因性細胞外電流の測定は微小電極システム7-10は、細胞膜および上皮細胞層の電気的パラメータの測定を可能に用いて振動プローブ4-6および膜または経上皮電位の測定値を使用している間、彼らはない与えます関与するイオン種の指標。選択的イオノフォアと微小電極は、溶液中の特定のイオン濃度を測定することができます。イオン勾配またはフラックスは異なる位置に2つ以上の電極を用いて測定することができます。しかし、各プローブの固有の電圧ドリフトは、不正確な測定または存在しなかった勾配であっても検出を引き起こし、異なるであろう。それは2点間の低周波数で移動することにより、「自己参照」モードで使用される単一の電極は、この問題を解決します。ここで、イオンフラックスは、（ 図3B参照 ）は、比較的ゆっくりと安定した信号ドリフトの背景を見ることができます。 イオン感受性測定システムは、組織または単一細胞に近いイオンの小さな細胞外フラックスを検出するために、イオン選択自己参照微小電極を使用しています。システムは、微小電極からの信号を処理し、マイクロステッピングモータとドライバは、微小電極の動きを制御するための増幅器で構成されています。回路を閉じるイオン選択微小電極および参照電極をヘッドステージ前置増幅器（ 図1A）を介して増幅器に接続されています。コンピュータソフトウェアは、微小運動（周波数、距離）のパラメータを決定し、また、増幅器の出力を記録します。ステッピングモータは、三次元マイクロポジショナーを介して微小電極の移動を制御します。イオン選択性微小電極を振動、低周波は、まず、特定のカルシウム流11を測定するために1990年に開発されました。同様に、カルシウムなど、商業的にアクセス可能なイオノフォアカクテルは今MICRを作るために利用可能ですナトリウム、塩化物、カリウム、水素、マグネシウム、硝酸、アンモニウム、フッ化リチウム、水銀に敏感oelectrodes。
基本的には、自己参照イオン選択微小電極技術は、電圧計で測定することができる電位に溶液中に溶解し、特定のイオンの活性を変換します。イオノフォアカクテルは、イオン交換特性を有する非混和性液体（有機親油性）相です。イオノフォアは、選択的可逆的に（結合する）特定のイオンと錯体を形成し、微小電極（電解液）に含まれる水溶液と微小電極が浸漬させた水溶液（ 図1D）との間でそれらを転送します。このイオンの移動は、電気化学的平衡をもたらし、微小電極と参照電極との間の電位の変動を電圧計により測定されます。電圧は、ネルンストeによる特定のイオン活性の対数に比例していますイオン濃度（ 図2AおよびB）の計算を可能にするquation。
現在、いくつかのシステムでは、同様の概念や原理を用いてイオン流の測定を可能にします。例えば、走査型イオン選択電極法（SIET）12,13またはニューマンとShabala 14-16によって開発された微小電極のイオンフラックスの推定（MIFE）技術は市販されており、広く特定のイオンを決定するために、研究コミュニティによって使用されます動物、植物および単一生細胞モデルの多様にわたって細胞膜および組織で生じる磁束。マウスの骨におけるイオン選択性微小植物の根17を横切って、水素、カリウムおよびカルシウムフラックスを測定するために使用されている、塩化フラックスラット大脳動脈18と花粉管19、水素流量スケート網膜細胞20、カルシウムフラックス21、様々なイオン菌糸22であり、rでフラックス単一細胞の創傷中に角膜23、および最終的にカルシウム流で12,24治癒 。また、イオン選択自己参照微小電極25の詳細については、以下のレビューを参照してください。
次の記事では、準備し、単一細胞レベルでのイオン選択自己参照微小電極技術を用いて、内因性の細胞外イオンフラックスの測定を実行する方法を詳細に説明しています。
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Protocol
1.イオン選択自己参照微小電極作製
- イオン選択性微小電極の作製
- 熱は微小電極プラーを使用してフィラメント（1.5ミリメートル外径、1.12ミリメートル内径）を使用せずに薄い壁ホウケイ酸毛細血管を引き出します。
注：これは、先端に直径3-4ミクロンを提供します。小さいヒントは、電子ノイズの微小電極受けやすく、また、イオン濃度の変化に遅く応答と関連する、より高い抵抗性を有します。有用な情報は、Smith らによって発表された論文に記載されています。26。 - 親油性イオノフォアカクテルの保持を補助するための内側表面を疎水性にするために電極をSilanize。それらを乾燥させるために> 100℃のオーブンで金属ラックおよび熱O / Nで微小電極を配置します。ラックは、直径2mmの孔を有する金属板を介して方法の一部を掘削します。 250ミリリットルgの上向きの穴先端に電極を配置しますその上小娘ビーカー。
- 午前中は、オーブンをオフにして、絶縁手袋を着用し、慎重に所定の位置に電極を、ビーカーの金属ラックを削除します。熱を保持するためにオーブンのドアを閉じます。
- ラテックスまたはニトリル手袋、白衣と目の保護具を着用します。プラスチック製パスツールピペットで、私は、各電極の基部にシラン化溶液の液滴を配置（場所にビーカーを保つ、ピペットアクセスのための注ぎリップを使用します）。シラン化ソリューションは、ホットプレートで気化して、電極の内部をsilanizesれます。この段階での化学抽出ヒュームフードを使用してください。数時間は残りのシラン化液が蒸発することを可能にするために高温のオーブンでラック/ビーカー/電極を裏面に配置します。
注意：安全のため、背面にオーブンの電源を入れないでください。それは有害で可燃性蒸気を含んでいてもよいように、それがオンにされてはならない示すオーブンのラベルを配置します。 - 冷却後、微小電極の保存瓶INSIに微小電極を保存乾燥剤400gでガラスデシケーターをデ。微小電極は、何週間もこのようにして保存することができます。
注意：代替のシラン化方法は、Smith らに記載されている26。 - 測定されるべきイオンの100mMの（ 表1及び図1Bを参照）を含む溶液の50〜100μlの微小電極（約1cmの長さ）をバックフィル。細かいフィラメントにブンゼンバーナーに引っ張ら使い捨てのプラスチック製パスツールピペットの熱を使用してください。閉塞を防止するために、その後のdH 2 Oでピペットを洗浄します。
代替的に、外部溶液27中のイオンの濃度に一致するように埋め戻し液のイオン濃度を調整注：。 - 気泡が存在しないことを保証するために、解剖顕微鏡下で微小電極を観察します。
- 垂直方向に電極を保持しながら気泡が指の爪で軽く微小電極存在タップしている場合（先端を下に）および/または泡をプッシュ針を交換するシリコーンチューブで修飾された注射器を使用して、背圧を適用することにより、先端をね。
- イオン固有のイオノフォアカクテルの15〜20 NL（30〜50ミクロンの長さ）で微小電極をヒントフィル（ 表1参照）。顕微鏡スライドの短辺にイオノフォアカクテルの小液滴を配置します。解剖顕微鏡下で微小電極の先端部を観察し、微小電極の先端が約半分しか秒間イオノフォアカクテルに接触するまで、顕微鏡スライドに向かって移動します。毛細管圧力によって微小電極にイオノフォアカクテルを描画します。
注意：これは、電子干渉（ノイズ）にそれが影響を受けやすくすることができ、プローブの電気抵抗が増加し、また、応答時間を遅くするようイオノフォアカクテルの長い列を避けてください。 - 金1ミリメートルオスコネクタとのAgCl（銀+）線（ 図1B）でストレート微小電極ホルダーに微小電極をマウントします。</ LI>
- 3次元コンピュータ制御の電子マイクロポジショナー（ 図1A）に搭載されたヘッドステージに微小電極ホルダーを取り付けます。
- サンプルを測定するための適切なソリューションを測定する微小電極の先端を配置し（生理食塩水、培地など ）微小電極が時間または2つ、あるいは一晩安定化することを可能にします。
- 熱は微小電極プラーを使用してフィラメント（1.5ミリメートル外径、1.12ミリメートル内径）を使用せずに薄い壁ホウケイ酸毛細血管を引き出します。
- 参照電極の作製
- 参照電極（ 図1C）は 、上記と同様の毛細血管です。 5cmの長さにダイヤモンド鉛筆でキャピラリをカットし、ブンゼン火炎中1-2秒間の各端部での火災は、研磨。
- 2％アガロースでのNaClの3M溶液、CH 3 CO 2 K（酢酸カリウム）またはKClを〜200μlでこれらの電極を埋めます。イオンに応じてソリューションを測定することを選択します（参照電極は、測定されるイオンを含むべきではありません。 表1を参照）。ミックスアガロースとほぼ電子レンジで沸騰するまで溶液および熱。アガロースを溶解するために撹拌し（溶液は透明になります）。
- プラスチックパスツールピペットに参照電極を取り付け、キャピラリー内に高温の溶液を引き出します。
- 使用前に密封されたチューブ内でこの3 M溶液に冷3 MのNaCl、CH 3 CO 2 KまたはKCl溶液とストアに電極をドロップします。気泡を有する任意の参照電極を捨てます。
- ストレート微小電極ホルダーに参照電極内部（事前に充填された3 M溶液を用いて）のAgCl（銀+）でペレットと金2ミリメートルオスコネクタ（ 図1C）をマウントし、手動マイクロポジショナーに電極とホルダーを取り付けます磁気スタンドに取り付けられました。
2.イオン選択自己参照微小電極のキャリブレーション
- 参照溶液のように、目的のイオンを含むキャリブレーション溶液を調製します。 表1を参照してください例えば 、培地、生理食塩水）です。つまり、1つの較正溶液は、測定溶液中のイオンのより低い濃度を含有し、そして高い方なければならないれます。
- 例えば、K + 1mMのが含まれている生理食塩水を使用しています。この濃度をブラケットに、連続希釈で10、1および0.1mMの濃度になるように脱イオン水中でのKCl粉末を溶解します。これらのキャリブレーションソリューションを使用しています。また、これらの解決策のうちの少なくとも2つを使用します。
- それぞれの較正溶液中のイオン選択性微小電極および参照電極を浸し、電圧値が（ 表1参照）は、専用のソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に、1〜3分間安定化させ。
- ソフトウェアとしてtxtファイルとしてデータ（アンプ出力）を保存し、スプレッドシートファイルにデータをコピーします。の対数に対して微小出力（MV）をプロット分子イオン濃度（ 図2A）。
- 線形回帰を適用し、ネルンストの傾き、切片およびR 2の値を計算します。ネルンスト傾斜は、二価イオンの価イオンおよび29±11 mVの/十年のための58±11 mVの/ディケード（アニオンのためにそれが否定された陽イオンのために、ネルンスト傾斜は、正である）である場合に微小電極を受け入れます。さらに、良好な微小電極は強い線形相関（; 図2B R 2> 0.9）を持っている必要があります。
注：ここで使用される増幅器のMV出力はMVが10倍のゲインで読書ができます。値は、10のファクタで分割する必要があります。 - 実際のイオン濃度（ 図2B）に微小電極の生のMV出力を変換するために、線形回帰式を使用してください。
イオン選択微小電極法の3検証
- 人工光源の準備
- 人工光源の毛細血管は同じ毛細血管です上記。熱は、ステップ1.1.1のように微小電極プラーを使用してキャピラリを引き出します。
- 塩化ナトリウム、塩化カリウムの1 M溶液200μl、CaCl 2を 2 H 2 OまたはpH 4緩衝液を用いて、これらのキャピラリーを埋め戻します。選択イオンに応じて人工光源溶液（ 表1参照）を測定します。
注：別の方法として、大きな先端径（〜20ミクロン）で電極を引き出し、同じソリューションを、先端充填が、百分の0.5から1アガロースを含む（アガロース溶液のいずれかの大きな流れを防ぐことができます）。 - マイクロマニピュレータに人工光源キャピラリをマウントし、試料中のイオンの流れを測定するために使用される溶液中に浸します。勾配の安定化を可能にするために、1時間に30分間、溶液中の人工光源のままにしておきます。
- イオン選択性微小電極の検証
- measuするために使用される溶液中の人工光源のキャピラリーから約1センチメートル離れたイオン選択性微小電極を浸しサンプルのイオンのフラックス再と以前のように参照電極と回路を閉じます。電圧値が1〜2分間の専用ソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に1~3分間安定させ。この値は、バッファ値に対応する（文献でも参照、背景やブランク値と呼びます）。
- 人工光源から約5μmにイオン選択性微小電極を移動して、電圧値が1〜2分間のソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に1〜3分間安定化させます。
- 人工光源の毛細管から離れて10、20、40、80、160、320、640と1280ミクロンでイオン選択微小電極を配置することにより、上記の手順を繰り返します。
- txtファイルなどのデータを抽出し、スプレッドシートファイルに値をコピーします。
- 校正値と同じ方法でmVの値に対応するイオン濃度を計算します。値をプロットします。
いいえTE：イオンフラックスが存在する場合、微小電極は、二つの位置（図3B）との間のイオン濃度の差を検出します。人工光源は、溶液よりも測定した種の多くのイオンが含まれている場合は、濃度が正しく、この場合には（イオン束の方向を検出するために、イオン選択微小電極の能力を検証し、遠くよりもソースに高い近くなければなりません流出;人工シンクのために、培地を測定するよりも低い特定のイオン濃度と、それが流入する必要があります）。- cは 、溶液中のイオン濃度（モルcm -3程度）であり、μはイオン移動度である（モルセンチN -1秒-1）J = Cμ（DC / DX）：拡散のフィックの法則を用いてイオンフラックスを計算します、およびDC距離dx（CM）（ 図2C）上の濃度差です。イオンフラックスデータは、通常、 ピコモルcm -2でSに提示されています-1またはナノモルcm -2で秒-1。
注：Smithら26によって記載されたイオンフラックス計算する別の方法を用いることができます。主な違いは、代わりに、イオン移動度の拡散係数を使用し、サンプルなしで生理食塩水溶液中のイオン流束の測定値から算出し、バックグラウンドイオンフラックス（また、電圧ドリフト又は補正係数）の減算を含みます。 - ソース（ 図2D）からの距離に対する各ステップのイオンフラックスの平均値をプロットします。源から離れた場所に移動すると、イオンフラックスの異なる大きさを検知するイオン選択性微小電極の能力を検証するフラックス値の指数関数的減少を観察します。
- 大きな信号対nでの正しい方向と大きさの測定値を検証するために記録されることを意図し、各特定のイオンに対して一度人工光源の検証を行いオワーズ比。
注：サンプルを含まない緩衝液のイオンフラックス測定は、バックグラウンドレベルやノイズを示しています。典型的には、バッファは、測定変数の方向が表示され、非常に小さな束につながるイオン濃度の明確な変動を示さありません。
- cは 、溶液中のイオン濃度（モルcm -3程度）であり、μはイオン移動度である（モルセンチN -1秒-1）J = Cμ（DC / DX）：拡散のフィックの法則を用いてイオンフラックスを計算します、およびDC距離dx（CM）（ 図2C）上の濃度差です。イオンフラックスデータは、通常、 ピコモルcm -2でSに提示されています-1またはナノモルcm -2で秒-1。
商工会議所の測定4.準備
注：実験の前に、サンプルを測定することが考慮し、サンプルがどのように実装され、微小電極の測定のために固定化します。
- アフリカツメガエル卵母細胞のための測定は800ミクロンのナイロンメッシュ（nitexメッシュ）の1cm角にカットし、プラスチックシャーレ（ 図1E）にそれを接着ツメガエル 。
5.イオンフラックス測定
- 較正溶液の場合と同様に試料の測定を行うために使用される緩衝液中に存在するイオン濃度を測定する。X.ツメガエルの卵母細胞は、マークの改変リンガー（MMR）が必要です。 D（MM）の最終濃度に達するまでの脱イオン水にissolveのNaCl、KClを、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびHEPES：100のNaCl、2のKCl、2塩化カルシウム、塩化マグネシウム1及び5 HEPES。 NaOHを用いて7.5に緩衝液のpHを調整します。
- 測定チャンバー内に試料を置き、微小電極（ 図3A）の近くに位置を定義するためにマイクロポジショナーを使用して（約10μm離れた）サンプルに近いイオン選択微小電極をもたらします。
- 近くに位置し、専用ソフトウェアを使用して離れたサンプル（遠い）からの位置の間の微小電極の低周波数（0.3ヘルツ）エクスカーション（100μm）を起動します。微小電極の移動は、試料の表面に垂直であることを確認してください。
注：微小電極の遠足は、ソフトウェア上で設定することができます。大きな遠足は勾配がサンプリング間隔を長くし、時間分解能が低下している間、測定中の小束を容易に検出することができ読み取る増加します。見ます- ソフトウェアを使用して録画を開始します。微小電極は、それぞれの位置で一時停止し、mV単位電位がコンピューターに記録されています。信号の安定化を可能にする、少なくとも2分間の測定値を取得します。短い時間経過実験では、全体の時間のコースに興味のある位置での電位の変化を記録します。
- txtファイルなどのデータを抽出し、スプレッドシートファイルに値をコピーします。
- 校正値と同じ方法でmVの値に対応するイオン濃度を計算します。値をプロットします。
注意：イオンフラックスが存在する場合、微小電極は、二つの位置（ 図3B）との間のイオン濃度の差を検出します。- （ステップ3.3.1）以前のように、拡散のフィックの法則を用いたイオンフラックスを計算します。
- 新しいサンプルを測定する前に、バッファの測定を繰り返し、すべての新しいのためのフラックス測定と計算の手順を繰り返しますサンプル。
6.統計分析とデータ表示
- および/ または混合効果28とANCOVAモデルを用いた制御条件でイオンフラックスの時間の位置の独立した効果をテストします。
注：共分散分析（ANCOVA）をカテゴリと連続の両方の対策が独立変数として使用することができるようにすることで、定期的なANOVAと回帰をミックス一般線形モデルです。また、個々のおよび最終的なネストされた効果につき反復測定によって誘発される相関誤差の存在下で、混合効果モデルは、両方の固定およびランダム効果の正確な推定値をモデル化するために使用されます。 - 複数のテスト28ボンフェローニ補正を持つグループレベル間のスチューデントt検定を使用して対比較を計算します。
- 位置や時間に応じてイオンフラックス測定を要約する箱ひげ図を生成します。記載ペアワイズスチューデントの tからp値を含みます（ 図3D）は、上記と以下のようにp値の有意水準を示す：*：P <0.05; **：P <0.01; ***：P <0.001 29
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Representative Results
我々は以前、カルシウム流入は、単一のセルが24を負傷した後に表示されることが示されています。したがって、我々は、他のイオン束は、単一の細胞損傷の際に発生するかどうか尋ねました。我々は、Xを使用しました卵母細胞をアフリカツメガエル 、単一のセルのための十分に確立されたモデルは30〜34と電気生理学的記録24,35-39創傷治癒します 。興味深いことに、カリウムイオンは、Xの内部に、より集中しています創傷時のカリウムの流出を示唆している：（1 mMのMMR 1Xに）使用される細胞外溶液中よりも卵母細胞（約110 mM）の40を アフリカツメガエル 。この仮説を確認するために、我々は、Xの過程でカリウムフラックスを測定しましたイオン選択自己参照微小電極を用いた卵母細胞の細胞膜の治癒をアフリカツメガエル 。
卵母細胞を創傷に、最初の大きな先端サイズ（〜50μm）を有するキャピラリ電極を引き出します。ストレート電極ホルダに電極を取り付け、手動マイクロポジショナーにマウントします。 oocy巻き電極チップ24を有する膜に触れることにより、TE。まもなく創傷後、私たちは（; - D図3B 250ナノモルcm -2の秒-1まで）のカリウムの大流出を検出しました。 （; - D図3B創傷後16分まで）は、膜の傷が癒されるように、このフラックスは、無傷の膜に見られる無傷のフラックス値（〜5ナノモルcm -2の秒-1）創傷が治癒しに戻って、減少しました。 ANCOVAカリウムフラックスを測定した（p <0.001）で創傷後の時間の有意な効果を明らかにした。 事後解析1-2分（p <0.001）で5-6分（p <0.05）で有意に増加し、カリウム流出が明らかになったが、ない無傷の細胞膜条件（ 図3D）と比較した場合、創傷後15〜16分で。我々は、単一の細胞損傷の際に、カリウムの流出は、デュを減らす傷のレベルで表示されていることを結論付けました治癒の過程を鳴らします。
| イオン | イオノフォアカクテル | 電解液（100 mM）の | 参照溶液（3 M） | 人工光源溶液（1 M） |
| のCa 2+ | カルシウムイオノフォアIカクテルA（カタログ＃21048） | のCaCl 2 2H 2 O | 塩化カリウム | のCaCl 2 2H 2 O |
| のNa + | ナトリウムイオノフォアIIカクテルA（カタログ＃71178） | 塩化ナトリウム | 塩化カリウム | 塩化ナトリウム |
| CL - | 塩化イオノフォアIカクテルA（カタログ番号24902） | 塩化ナトリウム | CH 2 CO 2 K（酢酸カリウム） | 塩化ナトリウム |
| K + | カリウムイオノフォアIカクテルA（カタログ番号60031） 塩化カリウム | 塩化ナトリウム | 塩化カリウム | |
| H + | 水素イオノフォアIカクテルA（カタログ＃95291） | pHは7.0 | 塩化カリウム | pHは4.0 |
表1：一般的に使用されるイオノフォアカクテルの例も示したが人工光源のため、微小電極に配置すると、キャリブレーションを実行するための適切なソリューションです。カタログ番号は、Sigma-Aldrichからです。
図1：イオン選択自己参照微小電極システムのイオン選択微小電極（A）概略図。 （B）イオン選択微小電極。 （C）参照電極。外液とmicroel間（D）イオン交換イオノフォアを介しectrode。測定室の（E）スキームは、X用に使用します卵母細胞をアフリカツメガエル 。
図2：微小電極のキャリブレーション、人工光源とフラックス計算イオン選択（A）検量線。 （B）イオン濃度の検量線と計算式。 （C）イオン流束の計算。 （D）イオンフラックスは人工光源（1 MのKCl）から特定 の距離で測定しました。
図3：X.でカリウムフラックスの進化治癒中に卵母細胞の傷をアフリカツメガエル 。遠足の（A）写真およびイラストX.でイオン濃度を測定し、イオン選択性の微小電極卵母細胞の傷をアフリカツメガエル 。 '' A ''と '' V 'との間の破線は、「動物植物軸を表します。 X.におけるカリウムイオン濃度の変化（B）イラスト治癒中に卵母細胞の傷をアフリカツメガエル 。 （C）散布（XY）は、平均して、X中の異なる時点での創傷のレベルでのカリウムフラックス測定の標準誤差を示すプロット卵母細胞の創傷治癒をアフリカツメガエル 。 （D）箱ひげ図は、Xの中に異なる時間に傷のレベルでカリウムフラックス測定を示します卵母細胞の創傷治癒アフリカツメガエル（N = 16;次のように示されたp値を：*：P <0.05; ***：P <0.001）。
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Discussion
in vivoでの細胞外イオンフラックスの測定に成功するために最も重要な手順は次のとおりです。ノイズの低減、イオン選択微小電極と参照電極の正確な製造、およびサンプルと両電極の配置。
ノイズを最小にするために、記録システムは、好ましくは、接地された金属張り（防振）テーブルでアース（接地）ファラデーケージにする必要があります。また、顕微鏡シャーシも接地する必要があります。電気ノイズの発生源は、光源を含みます。光ファイバ「ファンレス」光源は、最小限の電気的ノイズの原因となります。最後に、所有者はまた、塩素化微小電極に銀線、ペレットを維持すること（次亜塩素酸ナトリウム漂白剤に浸漬してのdH 2 Oですすぎ）ノイズを最小限に抑え、イオン選択微小電極や測定になります参照電極中の気泡の選択図存在として失敗微小電極の導電率はゼロか、改ざんされます。これにより、所有者にそれらをマウントする前に顕微鏡下で電極を検証することが重要です。気泡を除去するための詳細な手順のためのプロトコルを参照してください。サンプルおよび微小電極の両方の正確な位置決めが確実かつ再現可能な結果を保証するために必要とされます。イオンフラックスの測定は、微小電極の遠足と試料との相対位置に依存しています。これは、正確に試料上で測定される関心領域を特定し、試料からの垂直運動を有するように微小電極を配置することが重要です。サンプルに対して垂直ではない方法で、微小電極のいずれかの遠足は、変更されたイオンフラックスの測定をもたらし、サンプル間の変動を増加します。
特定のイオンを測定するために専用のイオノフォアカクテルは、例えば、カリウムのため、また、ナトリウムのような他のイオンの存在を感知することができます。測定溶液は、イオノフォアカクテルを競合イオンを多量に含む場合には、人工光源の実験を用いて、イオノフォアカクテルの選択性を決定することが重要です。ここで、溶液は、培養に使用されるX.ツメガエル卵母細胞（MMR）は、ナトリウムを高濃度に含まれています。したがって、それはまた、使用されるカリウムイオノフォアカクテルナトリウムを感知するかどうかを評価することは重要です。 （1 MのNaCl; 表1を参照）のカリウムイオカクテル充填微小電極を使用することにより、我々は、高ナトリウム濃度が含まれている人工的な光源を使用してナトリウムフラックスを測定しようとすることができ、同じ測定液を保持します。化学勾配は、ナトリウムの排出に有利に働くが、理想的にナトリウムフラックスは、カリウム特異的イオノフォアカクテルによって検出されるべきではありません。有意なフラックスを測定した場合、実験条件は最適化されるべきです。例えば、競合イオンの濃度は、点Mまで低下させることができこれは、カリウムフラックスの測定の間に潜在的な干渉につながる形質膜を横切るナトリウムフラックスに影響を与える可能性がありながらicroelectrodeは、もうそれを感知しません。理想的には、人工光源の実験から計算補正係数は、データに適用することができ、または他のイオノフォアカクテルを試験することができます。イオンは、イオン選択性自己参照微小電極を用いた測定は、イオンフラックスの測定は、水溶液中での細胞および組織で生じる可能フラックス。大気環境と接触している正常細胞または組織におけるイオンフラックスの測定は、それらの環境中に天然に存在せず、それは、通常の条件下で発生したイオンフラックス及び交換を変化させることができる溶液の存在を必要とします。特定の関心は、そのような解決策の内容を定義し、元の、生理的環境からの偏差を最小にするために行われなければなりません。イオン選択自己参照microeleにより測定することができるイオンのスペクトルctrode技術は、目的のイオンに対して選択特定のイオノフォアカクテルの可用性および存在に依存します。
イオン選択自己参照微小電極を用いて行っイオン束測定は、細胞外のイオンフラックスの非侵襲的測定を可能にする、通常は細胞又は組織の表面の近くに、溶液中で行われます。この方法は、細胞と細胞間隙の間に、組織内のイオンフラックスを測定することはできません。イオン選択自己参照微小電極は、 生体内でのイオンフラックスの測定を可能にする唯一の方法ではありません。代替新しい方法は微小電極を使用して可能ではない、イオンフラックスの測定を可能にする蛍光生体電気の記者41を使用しています。これらの染料は、組織および細胞内部のイオン流束の測定を可能にし、細胞内局在化を達成することができます。この技術は、組織および細胞内部のイオン流束の空間的な情報ではなく、イオンの元を取得することができます。組織および細胞外空間との間で変化します。また、蛍光生体電気の記者は、通常、半定量的データを生成します。イオンフラックスを測定するための微小電極ベースの技術を使用することは、依然として有効かつ必要であるし、それらが相補することなく、技術を競合する、蛍光生体電気レポーターの使用に追加的な情報をもたらします。また、興味深い最近の進展は、酸素、窒素酸化物及び神経伝達物質ドーパミンとグルタミン酸42,43の電流滴定自己参照検出器を含みます。電流測定検出は、センサ先端の化学反応に基づいています。新しい光ファイバ微小電極（「オプトロード」）は、高い選択性と感度45,46と非侵襲的に代謝酸素フラックス34,35およびpH 44を測定するために開発されてきました。 47をグルコースに敏感な酵素ベースのナノ粒子で被覆されたプローブは、今もあります。
私たちは目を見ました電子イオン選択自己参照微小電極は、 生体内で細胞外のイオンフラックスの測定を可能にします。イオンは、細胞/組織および細胞外空間との間だけでなく、生物内の細胞や組織の間で交換されるだけではありません。それは、その表面付近のイオンフラックスの実際の測定に加えて、組織内のイオンフラックスの空間分解能を理解するために、蛍光生体電気レポーターとして他の人とこの技術を組み合わせることが重要です。また、イオンフラックスは、一緒に、細胞膜電位、経上皮電位または細胞外の電流で細胞および組織を定義する生体状態の重要な部分を表します。これは、組み合わせて、細胞膜およびトランス上皮電位、ならびに細胞外電流24を測定するために、イオンフラックスの測定に加えて、重要です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) or from “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Hazardous, handle as recommended by provider |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
References
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