Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कार्यात्मक मुताबिक़ deubiquitinating एंजाइमों की गतिविधि को मापने के लिए एक विधि का विवरण है। विशेष जांच covalently एंजाइम को संशोधित करने और पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। इस विधि को नई चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने की क्षमता रखती है।
Abstract
ubiquitin-Proteasome प्रणाली हाल ही में neurodegenerative रोगों और कैंसर सहित विभिन्न विकृतियों में फंसा दिया गया है। इस के प्रकाश में, इस प्रणाली के नियामक तंत्र के अध्ययन के लिए तकनीक के aforementioned रोगों के सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं elucidating के लिए आवश्यक हैं। इस पत्र में उल्लिखित hemagglutinin व्युत्पन्न ubiquitin जांच के उपयोग के लिए इस प्रणाली के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है। इस पत्र में एंजाइम गतिविधि deubiquitinating के प्रत्यक्ष दृश्य दे कि assays के प्रदर्शन करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है एक विधि का विवरण है। Deubiquitinating एंजाइमों proteasomal गिरावट को नियंत्रित करने और उपयोगकर्ता एक परख में कई एंजाइमों की गतिविधि की जांच करने की अनुमति देता है जो उनके सक्रिय साइटों, पर कार्यात्मक अनुरूपता साझा करें। Lysates कोमल यांत्रिक सेल व्यवधान के माध्यम से प्राप्त की है और सक्रिय साइट निर्देशित जांच के साथ incubated हैं। निष्क्रिय एंजाइमों अपार रहते हैं, जबकि कार्यात्मक एंजाइमों जांच के साथ टैग कर रहे हैं। रननिंग इस परख, उपयोगकर्ता गतिविधि और एक तेज और आसान तरीके से कई deubiquitinating एंजाइमों के संभावित अभिव्यक्ति दोनों के बारे में जानकारी प्राप्त करता है। वर्तमान पद्धति मानव कोशिका में भविष्यवाणी की एक सौ deubiquitinating एंजाइमों के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी का उपयोग की तुलना में काफी अधिक कुशल है।
Introduction
ubiquitin-Proteasome प्रणाली (यूपीएस) स्तनधारी सेल में प्रमुख गिरावट रास्ते में से एक के रूप में कार्य करता है। Proteasome में गिरावट के लिए बाध्य Substrates covalently ubiquitin (यूबी) 1 के पॉलिमर के साथ टैग कर रहे हैं। लक्षित सब्सट्रेट गिरावट के लिए Proteasome में प्रवेश से पूर्व, पाली ubiquitin टैग हटा दिया जाना चाहिए। एंजाइमों (बताती है) deubiquitinating रूप में जाना जाता एंजाइमों का एक वर्ग ubiquitin अणुओं 2 के हटाने और रीसाइक्लिंग के लिए जिम्मेदार है। यह सेल 3 में काम कर रहे लगभग एक सौ बताती हैं कि वहाँ मानव जीनोम से भविष्यवाणी की गई है। UB-मध्यस्थता सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने बताती है की इतनी बड़ी संख्या के साथ इन एंजाइमों का अध्ययन केवल अभिव्यक्ति के स्तर के बारे में जानकारी देता है mRNA के तकनीक गतिविधि और पश्चिमी सोख्ता के बारे में जानकारी देने के लिए नहीं करते हैं क्योंकि एक चुनौती प्रस्तुत करता है।
इन्फ्लूएंजा hemagglutinin (हेक्टेयर) का उपयोग एक सहसंयोजक आधुनिक विपणन के लिए अनुमति देता सक्रिय साइट निर्देशित जांच UB-व्युत्पन्न, टैग कियाकार्यात्मक बताती है और इसलिए की ification एक पश्चिमी धब्बा 4 पर इन एंजाइमों की गतिविधि का एक प्रत्यक्ष दृश्य देता है। जांच सक्रिय साइट सिस्टीन अवशेषों 5 के लिए एक आत्मघाती सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है कि एक सी टर्मिनल thiol प्रतिक्रियाशील समूह है। इन जांच के साथ, यह सेल के दोनों रोग और शारीरिक राज्यों के तहत कई बताती है की गतिविधि और संभावित अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए संभव है।
डब गतिविधि में परिवर्तन ऐसे पार्किंसंस, अल्जाइमर, एनीमिया और विभिन्न प्रकार के कैंसर 6-10 के रूप में रोग की स्थिति की एक श्रेणी में शामिल किया गया है। इस तकनीक को बीमारी के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। वर्तमान पत्र में, हम ग्लास मनकों का उपयोग lysed किया गया है कि HeLa और M17 कोशिकाओं में इस तकनीक के आवेदन दिखा। इसके अतिरिक्त, हम माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के नमूनों में इस विधि का उपयोग करने के लिए कैसे रूपरेखा। इस तकनीक से प्राप्त जानकारी की पहचान करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैचिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिन्न रोग की स्थिति के अध्ययन के लिए की स्थापना मॉडल। इस तकनीक का सच उपयोगिता एक भी परख में कई बताती है के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता में निहित है।
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Protocol
1. lysis बफर तैयारी
- एक 2 एम स्टॉक समाधान बनाने के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी में सुक्रोज भंग। 0.22 polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) फिल्टर संचालित एक निर्वात का उपयोग कर सुक्रोज के एक 2 एम समाधान फ़िल्टर।
- अवायवीय स्थितियों के तहत एक 500 मिमी शेयर समाधान और दुकान बनाने के लिए डि पानी में dithiothreitol (डीटीटी) भंग। एक 100 मिमी स्टॉक समाधान बनाने के लिए डि पानी में मैग्नीशियम क्लोराइड (2 MgCl) भंग। एक 50 मिमी स्टॉक समाधान बनाने के लिए डि पानी में एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट (एटीपी) disodium हाइड्रेट भंग।
- डि पानी में Trizma हाइड्रोक्लोराइड भंग और सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) का उपयोग पीएच का समायोजन करके 7.4 पीएच में एक Tris समाधान करें।
- 250 मिमी, 1 मिमी, 5 मिमी की एक 2 MgCl एकाग्रता, 1 मिमी की एक एटीपी एकाग्रता और 50 मिमी की एक Tris एकाग्रता की एक डीटीटी एकाग्रता की एक sucrose एकाग्रता के साथ एक lysis बफर बनाने के लिए डि पानी में स्टॉक समाधान के कुछ भागों का मिश्रण । उदाहरण के लिए, Tris, 50 की 535.3 μl मिश्रण2 MgCl के 0 μl, 1.25 सुक्रोज की मिलीलीटर, डीटीटी के 20 μl, एटीपी के 200 μl और डि पानी की 7.4947 मिलीग्राम lysis बफर के 10 एमएल बनाने के लिए। यह लगभग 20 प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रयोग के लिए 2. संवर्धन प्रकोष्ठों
- DMEM + 10% एक 50 मिलीलीटर में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) शंक्वाकार ट्यूब के 30 मिलीलीटर aliquoting द्वारा मीडिया बनाओ।
- गुनगुने पानी के साथ एक छोटे से बीकर के लिए तरल नाइट्रोजन भंडारण से जमे हुए M17 या HELA कोशिकाओं स्थानांतरण।
- 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण। सबसे पहले, सेल शीशी के लिए कुछ मीडिया जोड़ें। तब विगलन के 5 सेकंड के भीतर resuspended कोशिकाओं को हस्तांतरण।
- एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 450 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। एक T75 फ्लास्क में मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
- सक्शन का उपयोग कोशिकाओं से मीडिया निकालें। सेल गोली और resuspend करने के लिए नए सिरे से मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- T75 फ्लास्क में मीडिया के 20 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर सेल निलंबन स्थानांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। चौधरी केहर 3 दिन मीडिया Ange।
3. सेल कटाई
- कोशिकाओं को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा चूषण के माध्यम से मीडिया निकालें।
- फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धो लें। सक्शन का उपयोग कर पीबीएस निकालें।
- T75 फ्लास्क को ट्रिप्सिन-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- कुप्पी ताजा मीडिया के 6 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं resuspend।
- 5 मिनट के लिए 290 × छ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र निलंबन स्थानांतरण।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे गोली को तोड़ने के लिए ट्यूब के नीचे नल। 5 मिनट के लिए 290 XG पर अपकेंद्रित्र।
- दोहराएँ कदम 3.6 तीन बार।
- पीबीएस निकालें और ताजा पीबीएस के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। Eppendorf ट्यूब (1.5 मिलीग्राम) के लिए स्थानांतरण। 5 मिनट के लिए 290 XG पर स्पिन।
4. सेल
- एक पिपेट एक का उपयोग कर गोली की अनुमानित मात्रा को मापने1 की मात्रा अनुपात: एक मास में कांच के मोती वज़न घ 1। Lysis बफर में गोली की दो बार की मात्रा में शामिल करें।
नोट: कांच के मोती जोड़ने से पहले बफर जोड़ें। - Lyse एक ठंडे कमरे में vortexing से 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अधिकतम आंदोलन पर Eppendorf ट्यूब में कोशिकाओं।
- 200 XG 30 के लिए सेकंड पर अपकेंद्रित्र संक्षेप में मोती व्यवस्थित करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
- सतह पर तैरनेवाला के रूप में करने से पहले कांच के मोती के समान मात्रा में शामिल करें।
- एक बार फिर से अधिकतम आंदोलन में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए भंवर।
- 200 XG 30 के लिए सेकंड पर अपकेंद्रित्र संक्षेप में कांच के मोती व्यवस्थित करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
- 5 मिनट के लिए 5030 XG पर अपकेंद्रित्र नाभिक, झिल्ली और अटूट कोशिकाओं को हटाने के लिए। सेल lysate है जो सतह पर तैरनेवाला, ले लीजिए।
5. ऊतक homogenization
- Lysis बफर करने के लिए माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के 9 समाधान: 1 की मात्रा: एक जन बनाओ।
नोट: इस विधि भिन्न होते हैं की एक किस्म के लिए लागू हैईएनटी ऊतकों के नमूनों। - शेष कोई हिस्सा रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए 30 सेकंड के लिए homogenizer पर स्तर 2 की सेटिंग का उपयोग ऊतक homogenize।
- नाभिक, झिल्ली और अटूट कोशिकाओं को हटाने के लिए 3 मिनट के लिए 5030 XG पर स्पिन।
- Lysate है जो सतह पर तैरनेवाला, ले लीजिए।
6. नमूना derivatization
- पियर्स बीसीए प्रोटीन परख किट प्रोटोकॉल द्वारा निर्दिष्ट के रूप में एक वर्णमिति 96 अच्छी तरह से थाली रीडर का उपयोग ऊतक lysate के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली विश्लेषण में एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रदर्शन करते हैं।
- De-ionized (डीआई) पानी का उपयोग 50 μl के लिए कुल प्रोटीन की 20 माइक्रोग्राम के लिए इसी एक विभाज्य लाओ।
- समाधान के लिए हा-UB-विनाइल sulfone (एस) के 1.35 माइक्रोन के 2 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। इस अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण में जांच के लिए 50 एनएम के लिए lysate के 20 माइक्रोग्राम परिणाम है। यह कार्यात्मक बताती है की टैगिंग सुनिश्चित करने के लिए बड़े दाढ़ अधिक है।
- मैं95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए Laemmli का नमूना बफर में नमूना ncubate। एक 52 μl प्रतिक्रिया मात्रा उपयोग 2x नमूना बफर के 26 μl, 4x नमूना बफर के 13 μl या 6x नमूना बफर के 8.87 μl के लिए।
- जेल लोड करने से पहले बर्फ पर शांत।
7. वेस्टर्न ब्लाट
- तैयार नमूना के 40 μl के साथ एक 12 अच्छी तरह से 4-20% Tris-ग्लाइसिन जेल लोड
- आयन सामने नीचे तक पहुँचता है जब तक 95 वी में जेल चला।
- एक polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली पर जेल की एक रात में स्थानांतरण बाहर ले।
- Amido काला दाग में झिल्ली सेते हैं और प्रत्येक लेन में प्रोटीन की मात्रा दिखा एक छवि प्राप्त करने के लिए membane स्कैन।
- झिल्ली Destain और ब्लॉक करने के लिए 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% दूध में सेते हैं।
- 1 के एक एकाग्रता में प्राथमिक विरोधी हा एंटीबॉडी में झिल्ली सेते हैं: या तो रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर या कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए पीबीएस में 10,000 5 में% दूध।
- एफ 3 washes के प्रदर्शन करनाया 0.1% बीच 20 साबुन के साथ पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक।
- 1 की एकाग्रता में एक माउस हॉर्सरैडिश peroxidase में झिल्ली सेते हैं: पीबीएस में 10,000 5 में% दूध कम से कम 2 घंटे के लिए।
- 0.1% बीच 20 साबुन के साथ पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 washes के प्रदर्शन करना।
- पीबीएस में 5 मिनट के लिए 1 धोने प्रदर्शन करते हैं।
- 10 मिनट के लिए एक chemiluminescent पता लगाने अभिकर्मक में झिल्ली सेते हैं और एक chemiluminescent डिटेक्टर का उपयोग का पता लगाने। डिटेक्टर पर सेटिंग स्वत: जोखिम का प्रयोग करें।
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Representative Results
संवर्धित M17 और HELA कोशिकाओं प्रोटोकॉल (3. सेल संचयन) में विस्तृत विधि और माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को प्राप्त किया गया था का उपयोग कर काटा गया। सेल गोली / रीढ़ की हड्डी के ऊतकों अभिकर्मक तैयारी खंड में वर्णित lysis बफर के साथ एक ट्यूब में रखा गया था। सेल छर्रों homogenizer (चित्रा 1 बी) का उपयोग homogenized गया कांच के मोती (चित्रा 1 ए) और माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के नमूनों का उपयोग कर lysed रहे थे। सेल या homogenization के बाद, नमूना तो कांच के मोती और / या अटूट झिल्ली और अंगों (चित्रा 2) को हटाने के लिए 5030 XG पर centrifuged किया गया था। इन दोनों पद्धतियों के enzymatic गतिविधि को संरक्षित करने के लिए सेल के यांत्रिक साधन हैं। कोशिकाओं के प्रोटीन एकाग्रता तो बीसीए पद्धति का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। कुल प्रोटीन की 20 माइक्रोग्राम 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3) पर 1 घंटे के लिए 1.35 माइक्रोन जांच के 2 μl के साथ incubated किया गया था। नमूने तो 4x Laemmli में incubated रहे थे95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना बफर प्रतिक्रिया बुझाने के लिए। तैयार नमूनों एक 4-20% Tris-ग्लाइसिन जेल पर भरी हुई है और आयन सामने नीचे पहुंच गया जब तक 95 वी पर चलाए जा रहे थे। प्रोटीन एक PVDF झिल्ली पर रात भर स्थानांतरित कर दिया गया। प्रोटीन लोड हो रहा है amido काला दाग (चित्रा 4) का उपयोग कर जाँच की थी। इस पर नियंत्रण के कदम गतिविधि में मतभेद वास्तविक सेलुलर प्रक्रियाओं और नहीं असमान प्रोटीन लोडिंग के कारण कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है। समान प्रोटीन की मात्रा पहला प्रयोग (चित्रा -4 ए) में इस्तेमाल किया गया। दूसरे प्रयोग में, असमान प्रोटीन की मात्रा अलग सेल लाइनों (चित्रा 4 बी) की गतिविधि प्रोफाइल में होने की उम्मीद है मतभेद के कारण भरी हुई थी। यह एक सिस्टीन अवरोध करनेवाला है और पश्चिमी धब्बा पर एक कम संकेत करने के लिए ले जाना चाहिए जो एन -ethylmaleimide (NEM), के साथ incubated M17 सेल lysates के लिए एक गतिविधि प्रोफाइल का पता लगाने सुनिश्चित करने के लिए किया गया था। झिल्ली विरोधी हा प्राथमिक एंटीबॉडी में incubated रहे थे, एक माउस जorseradish peroxidase और फिर chemiluminescent इमेजिंग (चित्रा 5) का उपयोग कर पता लगाया है। झिल्ली (चित्रा 5 ए, सी) की प्रत्येक गली में एक प्रोफाइल में जांच के परिणामों का उपयोग कर बताती के सफल टैगिंग। अलग आणविक भार में बैंड की तीव्रता डब एंजाइम की गतिविधि के स्तर से मेल खाती है। ऐसे UCHL1 के रूप में इसी तरह के प्रोटीन HeLa और M17 कोशिकाओं (चित्रा 5) में तुलना कर रहे हैं जब सेल लाइनों भर में विभिन्न बताती है की गतिविधि के स्तर में मतभेद स्पष्ट हो गया है। भरी हुई प्रोटीन की मात्रा से पता चलता है जो amido काले दाग, के विपरीत, यह जांच के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है कि सक्रिय प्रोटीन की मात्रा से पता चलता है, क्योंकि जेल की chemiluminescent दृश्य महत्वपूर्ण है। आणविक भार मानकों के प्रकाश छवि (चित्रा 5 ब) विभिन्न बताती है की पहचान करने के लिए गाइड के रूप में कार्य करता है। जांच के लिए बड़े पैमाने पर डब चिह्नित करने के लिए परिणामों के विश्लेषण के दौरान प्रोटीन के आकार के लिए जोड़ा जा करने की जरूरत है सही आणविक भार में एस।
चित्रा 1:। कोशिकाओं और ऊतकों के लिए Lysis तरीके चित्र (बी) में Polytron सेल बनाम (ए) में कांच के मोती का उपयोग सेल दिखा।
चित्रा 2:। (ए) में सेल और centrifugation के बाद नीचे बसे कांच के मोती और अटूट झिल्ली और अंगों दिखा कोशिकाओं और ऊतकों सेल lysate के केन्द्रापसारण उत्पाद। में homogenization और centrifugation के बाद नीचे (बी) पर अटूट झिल्ली और अंगों दिखा ऊतक lysate।
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चित्रा 3:।। बताती है की टैगिंग के लिए तंत्र सक्रिय साइट सिस्टीन अवशेषों और हा-UB-वी.एस. के कार्य समूह के बीच सहसंयोजक उठाना दिखा एक योजनाबद्ध इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: झिल्ली की amido काला दाग हा-UB-VinylSulfone (एस) के साथ टैग एन -ethylmaleimide (NEM) के साथ incubated lysates पर किया amido काला धुंधला, दिखा झिल्ली और एक पश्चिमी धब्बा पर चलाते हैं।। (ए) HeLa - - बाएं से दाएं रूप में इस प्रकार के नमूने हैं nem, HeLa + NEM; (बी) श्री मानक, M17 -। Nem, M17 + NEM CLIC करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां कश्मीर।
चित्रा 5: पश्चिमी blots परिणामों विरोधी हा के लिए जांच कर रही द्वारा निर्धारित विभिन्न बताती है की गतिविधि के स्तर दिखा झिल्ली।। (ए) HeLa - - बाएं से दाएं रूप में इस प्रकार के नमूने हैं nem, HeLa + NEM; (बी) श्री मानकों; (सी) M17 -। Nem, M17 + NEM इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
Ubiquitination एक मौलिक सेलुलर गतिविधि है, विनियामक तंत्र को समझने की बीमारी और विकृति की प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। हा का उपयोग यहां बताया UB-व्युत्पन्न सक्रिय साइट निर्देशित जांच UB-मध्यस्थता प्रोटीन गिरावट के अध्ययन के लिए एक आसान है, लेकिन अत्यधिक लागू तरीका प्रदान करता है टैग किया। इस विधि तेज और कम खर्चीला व्यक्तिगत रूप से बताती है की हर एक अध्ययन से है।
कांच के मोती का उपयोग कर - इस विधि में, कोशिकाओं के lysis यांत्रिक साधनों के माध्यम से हासिल की है। सेल की इस कोमल विधि एक चयापचय इंट्रासेल्युलर तस्वीर को बरकरार रखता है। हालांकि, इस सेल पद्धति की एक बड़ी खामी के बारे में 60-70% की अपनी कम क्षमता है। यह कोशिकाओं का एक बहुत lysates प्रयोगों के लिए पर्याप्त केंद्रित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं इसका मतलब है। 80 के साथ T75 बोतल - 90% मिला हुआ सेल परतों एक केंद्रित lysate निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रयोग के trypsinization के कदम महत्वपूर्ण हैजुड़ी कोशिकाओं के सबसे समाधान में निलंबित किया जाना चाहिए। संस्कृति में कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण भाग 50 मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरित करने से पहले चल रहे हैं कि सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे कुप्पी की जाँच करें। ठीक से पक्षपाती कोशिकाओं trypsinize करने में विफलता के एक छोटे गोली में और एक कम एकाग्रता में विस्तार कम lysate से परिणाम होगा। उपयोग में नहीं हैं कि lysates उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस 24 घंटा के लिए हस्तांतरित किया और बर्फ पर उपयोग की दिन thawed, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। इस lysate समान रूप से पिघलना करने के लिए अनुमति देता है और तेजी से विगलन से एंजाइमों को नुकसान को कम कर देता है।
एक Dounce या Polytron homogenizer या तो कांच के मोती 11 के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है ऊतकों को इस पद्धति लागू करने के लिए। प्राप्त lysate तुरंत जांच के साथ टैग या -80 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है। Dounce या Polytron तो lysate प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो कांच के मोती नहीं किया जाना चाहिए। इस lysate के कुल प्रोटीन एकाग्रता में कमी आती है। एlternatively, प्राथमिक सेल संस्कृति तरीकों का उपयोग कर ठोस ऊतकों के नमूनों पहले सुसंस्कृत और फिर कांच के मोती के साथ lysed हो सकता है।
इस पद्धति का एक प्रमुख सीमा है कि यह उपयोगकर्ता एंजाइमों की गतिविधि कल्पना करने के लिए अनुमति देता है, भले ही यह व्यक्ति बताती है की अभिव्यक्ति के पैटर्न पर सही जानकारी नहीं दे करता है। इस विधि एंजाइमों नहीं संरचनात्मक अनुरूपता में कार्यात्मक अनुरूपता का उपयोग करता है। इसलिए, अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ आगे के प्रयोगों गतिविधि में कमी सक्रिय साइट या एंजाइम की एक वास्तविक नुकसान में दोष का परिणाम है कि क्या समझाने के लिए किया जा करने के लिए होगा। साथ ही, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सेल विधि कोशिकाओं के नाभिक खुला तोड़ नहीं है। नाभिक में बताती रोग प्रक्रियाओं के बारे में अधिक महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सके।
फिर भी इस विधि के किसी अन्य स्रोत से प्राप्त नहीं किया जा सकता है कि जानकारी प्रदान करने की क्षमता में अद्वितीय है। दोनों शाही सेना methoडी एस और व्यक्तिगत एंटीबॉडी के उपयोग के एंजाइमों के बारे में कार्यात्मक जानकारी प्रदान नहीं करते हैं। भविष्य में, संभावित immunohistochemical (आईएचसी) धुंधला करने के लिए इस विधि के आवेदन के लिए मौजूद है। आईएचसी धुंधला ही एंजाइमों की गतिविधि के बारे में जानकारी देने के लिए नहीं होगा, लेकिन विभिन्न बताती सक्रिय हैं, जहां यह भी ऊतक में पांच में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। इसके अलावा, इस विधि ऐसे Colla एट अल द्वारा विस्तृत रूप में एक subcellular विभाजन तकनीक के साथ मिलकर किया जा सकता है। 2012 में झिल्ली बाध्य organelles के 12 में बताती है की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए। इस आणविक जीव विज्ञान में एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है, आवेदनों का विस्तार करने के लिए एक विशाल क्षमता है। सक्रिय साइट निर्देशित आणविक जांच का प्रयोग कई बीमारियों के एटियलजि elucidating की कुंजी पकड़ सकता है।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम इस्तेमाल किया गया है कि माउस रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के नमूनों प्रदान करने के लिए मिनेसोटा विश्वविद्यालय के ली प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम MB करने के लिए रैंडी शेवर कैंसर रिसर्च और सामुदायिक कोष से और मिनेसोटा डिम्बग्रंथि के कैंसर गठबंधन (MOCA) MB करने के द्वारा, रक्षा डिम्बग्रंथि के कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (ओसीआरपी) MB करने के लिए OC093424 विभाग द्वारा समर्थित किया गया। funders के अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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