Summary
Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.
Abstract
ubikitin-proteazom sistemi son nörodejeneratif hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere çeşitli patolojilerde rol oynar. Bunun ışığında, bu sistemin düzenleyici mekanizmasını incelemek için teknikler yukarıda belirtilen hastalıkların hücresel ve moleküler süreçleri açıklık için gereklidir. Bu yazıda belirtilen hemagglutinin türetilmiş ubikitin sondasının kullanımı bu sistemin çalışması için değerli bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yazıda enzim aktivitesini deubiquitinating doğrudan görselleştirme vermek tahlilleri yapmasını sağlayan bir yöntem ayrıntıları. Deubiquitinating enzimler proteozomal bozulmasını kontrol ve kullanıcı bir deneyde birden enzimlerin aktivitesini araştırmak için izin verir aktif siteler, fonksiyonel benzerlik paylaşıyoruz. Lizatlar yumuşak mekanik hücre bozulması yoluyla elde edilen ve aktif site yönelimli probları ile inkübe edilir. Inaktif enzimler ilişkisiz kalırken Fonksiyonel enzimler probları ile etiketlenmiş. Run byNing bu deney, kullanım etkinliği ve hızlı ve kolay bir şekilde birden fazla deubiquitinating enzimlerin potansiyel ekspresyon hem de ilgili bilgileri alır. Mevcut yöntem, insan hücresinde tahmin yüz deubiquitinating enzimler için tek tek antikorlar kullanılarak önemli ölçüde daha etkilidir.
Introduction
ubikitin-proteazom sistemi (UPS) memeli hücresinde ana degradasyon yollarının biri olarak hizmet eder. Proteazomdan bozulmaya gitmekte Dayanaklar kovalent ubikuitin (Ub) 1 polimerleri ile etiketlenmiş. Hedef alt-tabaka bozulması için proteazomu girer önce, poli-ubikitin etiketi çıkarılmalıdır. Enzimler (DUBS) deubiquitinating olarak bilinen bir enzimler sınıfı ubikitin moleküllerinin 2 çıkarılması ve geri dönüşüm için sorumludur. Bu hücrede 3 çalışan yaklaşık yüz seslendirmeler olduğu İnsan genomunun tahmin edilmiştir. Ub-aracılı hücresel süreçleri kontrol DUBS bu kadar büyük bir sayı ile, bu enzimleri okuyan, yalnızca ifade seviyeleri hakkında bilgi verir mRNA teknikleri aktivite ve batı blot hakkında bilgi vermeyin çünkü bir meydan okuma sunuyor.
grip hemaglutinin (HA) kullanımı kovalent mod sağlayan aktif bölge yönlendirilmiş sondalar Ub türetilmiş, etiketliFonksiyonel takar ve bu yüzden de US-PS bir Batı lekesi 4, bu enzimlerin aktivitesinin doğrudan görselleştirme verir. Problar, aktif alan sistein kalıntısı 5 için bir intihar alt-tabaka olarak hizmet eden bir C-terminali tiol reaktif grup var. Bu problar ile, hücrenin her iki patolojik ve fizyolojik halleri altında birçok DUBS aktivitesini ve potansiyel ifade incelemek mümkündür.
DUB aktivitesindeki değişiklikler, Parkinson, Alzheimer, anemi ve çeşitli kanserler gibi patolojik koşullar 6-10 aralığında implike edilmiştir. Bu teknik, hastalığın çalışma için güçlü bir araç sunar. Bu yazıda, biz cam boncuklar kullanılarak lize edilmiş HeLa ve M17 hücrelerinde bu tekniğin uygulanmasını gösterir. Ayrıca, fare omurilik doku örneklerinde bu yöntemi kullanmak nasıl özetlemektedir. Bu tekniği ile elde edilen bilgiler, tanımlanması için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilirterapötik hedefler ve farklı hastalık durumlarının çalışma için oluşturulması modelleri. Bu tekniğin gerçek yardımcı tek bir deneyde çok dubs bilgi sağlama yeteneğinde yatmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lizis Tampon hazırlanması
- Bir 2 M stok çözelti yapmak için deiyonize (Di) su içinde sükroz eritin. 0.22 um poliviniliden florit (PVDF), filtre çalıştırılan bir vakum kullanılarak sükroz 2M çözelti süzülür.
- Anaerobik koşullar altında, bir 500 mM stok çözeltisi ve depolayın DI su içinde ditiyotreitol (DTT) içinde çözülür. 100 mM'lik bir stok çözelti yapmak için DI su içinde magnezyum klorür (MgCI2) içinde çözülür. 50 mM stok çözelti yapmak için DI su içinde adenosin trifosfat (ATP), disodyum hidrat içinde çözülür.
- DI su içinde Trizma hidroklorür eritilmesi ve sodyum hidroksit (NaOH) ile pH ayarlanarak pH 7.4'te bir Tris çözelti hazırlayın.
- 250 mM, 1 mM, 5 mM MgCl2 konsantrasyonu, 1 mM ATP konsantrasyonu ve 50 mM Tris konsantrasyonunun bir DTT konsantrasyonu bir sükroz konsantrasyonuna sahip bir parçalama tamponu yapmak DI su içinde stok çözeltileri bölümlerini birleştirmek . Örneğin, Tris, 50 535.3 ul karıştırınMgCl2 0 ul, 1.25 ml sükroz, DTT 20 ul ATP 200 ul ve Dİ su içinde 7,4947 mi liziz tamponu içinde 10 ml yapmak için. Bu, yaklaşık 20 deneyleri için de kullanılabilir.
Deney 2. Kültürleme Hücreler
- DMEM +% 10, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), konik bir tüp içinde 30 ml aliko haline getirilmesi Ortamın.
- Ilık su ile küçük bir behere sıvı azot depolama dondurulmuş M17 veya HeLa hücreleri aktarın.
- 50 ml konik tüp hücreleri aktarın. İlk olarak, hücre flakon bazı medya ekleyebilirsiniz. Daha sonra eritme 5 saniye içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler aktarın.
- Hücre topağı elde etmek için 5 dakika boyunca 450 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. T75 balona medya 20 ml ekleyin.
- Emme kullanarak hücrelerden ortamı çıkarın. Hücre topağı ve tekrar süspansiyon taze ortam 5 ml.
- T75 şişesi içinde ortam, 20 ml 5 ml hücre süspansiyonu aktarın ve 37 ° C'de inkübe edin. ChHer 3 günde bir ortam ange.
3. Hücre Hasat
- Hücreleri dokunmamaya dikkat ederek, emme yoluyla ortamı çıkarın.
- Fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) hücreleri yıkayın. Emme kullanarak PBS çıkarın.
- T75 şişeye tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ilave edilir ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Balona taze medya 6 ml ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon.
- 5 dakika 290 × g 15 ml konik tüp ve santrifüj süspansiyon aktarın.
- Süpernatantı ve PBS 5 ml ekleyin. Yavaşça pelet kırmaya tüpün alt dokunun. 5 dakika boyunca 290 x g'de santrifüjleyin.
- Adımı yineleyin 3.6 üç kez.
- PBS çıkarın ve taze PBS 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Eppendorf tüp (1.5 mi) aktarın. 5 dakika boyunca 290 xg'de Spin.
4. Hücre Liziz
- Bir pipet An kullanarak pelet yaklaşık hacmini ölçmek1 hacim oranı: Bir kütle cam boncuk tarttın d 1. Liziz tamponu içerisinde pelet iki hacim.
Not: cam boncuk eklemeden önce tampon ekleyin. - Lyse soğuk bir odada vorteks ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca en fazla çalkalama ile Eppendorf tüpü içinde hücreleri.
- 200 xg 30 saniye Santrifüj kısaca boncuk yerleşmek için. Süpernatant toplayın.
- Süpernatana daha önce olduğu gibi cam boncuklar aynı hacimde ekleyin.
- Bir kez daha fazla çalkalama ile 4 ° C'de 30 dakika vorteksleyin.
- 200 xg 30 saniye Santrifüj kısaca cam boncuk yerleşmek için. Süpernatant toplayın.
- 5 dakika boyunca 5030 x g'de santrifüj çekirdekleri, membranlar ve kesintisiz hücreleri çıkarmak için. Hücre lizatı olan süpernatant, toplayın.
5. Doku Homojenizasyon
- Lizis tamponu fare omurilik dokusu 9 çözeltisi: 1 hacmini: Bir kütle olun.
Not: Bu yöntem, farklı bir dizi uygulanabilirent doku örnekleri. - Kalan hiçbir topakları olmadığından emin olmak için 30 saniye boyunca homojenleştirici üzerindeki seviye 2 bir ayarı kullanarak doku homojenize.
- Çekirdekleri, membranlar ve kırılmamış hücreleri çıkarmak için 3 dakika 5,030 xg'de aşağı doğru döndürün.
- Lizat olan süpernatant, toplayın.
6. Numune Türevlendirme
- Pierce BCA Protein Assay Kit protokolü tarafından belirtildiği gibi kolorimetrik 96 oyuklu bir plaka okuyucusu kullanılarak doku lizat proteini konsantrasyonunu belirlemek için bir 96 oyuklu plaka analizinde bisinkoninik asit (BCA) uygulayın.
- Deiyonize (Di) su kullanılarak 50 ul toplam proteinin 20 ug tekabül eden bir kısım getirin.
- Çözeltiye HA-UB-vinil sülfon (VS) 1.35 uM 2 ul ilave edin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir. Bu, son reaksiyon karışımı içinde prob 50 nM lizat 20 ug ile sonuçlanır. Bu fonksiyonel DUBS etiketleme sağlamak için büyük molar fazladır.
- Ben95 ° C'de 5 dakika için Laemmli numune tamponu içinde örnek ncubate. 52 ul reaksiyon hacmi kullanımı 2x numune tamponu 26 ul, 4x numune tamponu 13 ul veya 6x numune tamponu 8.87 ul için.
- Jel yüklemeden önce buz üzerinde soğutun.
7. Western Blot
- Hazırlanan numune 40 ul ile 12 oyuklu% 4-20 tris-glisin jel yük
- Iyon ön dibe ulaşana kadar 95 V jel çalıştırın.
- Bir polivinilidendiflorid (PVDF) membran üzerine jel bir gecede transferi gerçekleştirin.
- Amido siyah leke membran inkübe ve her kulvarda protein miktarını gösteren bir görüntü elde etmek için membane tarayın.
- Membran destain ve bloke etmek için 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 süt ile inkübe edilir.
- 1 bir konsantrasyonda birincil bir anti-HA antikoru membran inkübe: ya da gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat süre ile, PBS içinde 10.000,% 5 süt.
- F 3 yıkar gerçekleştirinya da% 0.1 Tween-20 deterjanı ile PBS içinde her biri 5 dakika.
- 1 bir konsantrasyonda, bir fare yaban turbu peroksidazı membran inkübe: PBS içinde 10.000,% 5 süt en az 2 saat karıştırıldı.
- % 0.1 Tween-20 deterjan ile, PBS içinde 5 dakika için her 3 yıkama yapın.
- PBS içinde 5 dakika için 1 yıkama yapın.
- 10 dakika boyunca, bir kemilüminesan tespit reajanı membran inkübe ve kemilüminesan bir detektörü kullanarak bulunması. Dedektör ayarı otomatik pozlama kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültürlenmiş M17 ve HeLa hücreleri protokolü (3. Hücre Hasat) 'de ayrıntılı bir yöntem ve fare omurilik dokusu elde edildi kullanılarak hasat edilmiştir. Hücre peleti / omurilik dokusu reaktifi Hazırlama bölümünde açıklanan lizis tamponu ile bir tüp içine yerleştirilmiştir. Hücre topakları, bir homojenleştirici (Şekil 1B) kullanılarak homojenize edildi cam boncuk (Şekil 1A) ve fare omurilik dokusu numuneleri kullanılarak parçalanmıştır. Liziz veya homojenleştirmeden sonra, numune daha sonra, cam boncuklar ve / veya kesintisiz membranlar ve organeller (Şekil 2) çıkarmak için 5030 x g'de santrifüjlenmiştir. Bu yöntemlerin her ikisi de enzimatik aktivitesini korumak için liziz mekanik araçlar bulunmaktadır. hücrelerinin protein konsantrasyonu, daha sonra, BCA yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Toplam proteinin 20 ug, 37 ° C'de (Şekil 3) de 1 saat süre ile 1.35 uM prob 2 ul ile inkübe edildi. Numuneler daha sonra 4 x Laemmli inkübe edildi95 ° C 'de örnek tamponu, reaksiyonun sönmesi için. Hazırlanan numuneler, bir% 4-20 tris-glisin jeli üzerine yüklenmiş ve iyon ön alt ulaşıncaya kadar 95 V çalıştırılmıştır. Proteinler bir PVDF zarı üzerine gece boyunca transfer edilmiştir. Protein yükleme amido siyah leke (Şekil 4) kullanılarak kontrol edildi. Bu kontrol adımı aktivitesindeki bir farklılık, gerçek hücresel süreçleri olup eşit olmayan bir protein yükleme nedeniyle olmasını sağlar. Eşit protein miktarlarının İlk deneyde (Şekil 4A) kullanılmıştır. İkinci bir deneyde, eşit olmayan protein miktarlarının farklı hücre hatları (Şekil 4B) aktivitesi profilleri beklenen farklılıkları nedeniyle yüklendi. Bu sistein inhibitörüdür ve western blot üzerinde azaltılmış bir sinyale yol açacaktır N -ethylmaleimide (NEM) ile kuluçkalanmıştır M17 hücre lizatları bir aktivite profili saptanmasını sağlamak için yapıldı. Zarlar, anti-HA primer antikor içinde kuluçkalanmıştır, bir fare Horseradish peroksidaz ve kemilüminesan görüntüleme (Şekil 5) kullanılarak tespit edildi. Membranın (Şekil 5A, C), her bir şeritte bir profilde probları sonuçlarını kullanarak DUBS başarıyla etiketleme. Farklı molekül ağırlıklarında bantların yoğunluğu DUB enzimin aktivitesi seviyesine karşılık gelir. örneğin UCHL1 benzer proteinler, HeLa ve M17 hücreleri (Şekil 5) karşılaştırıldığında, hücre hatları arasında farklı DUBS aktivitesi seviyelerindeki farklılıklar belirgin hale gelir. yüklenen protein miktarını gösteren amido siyah leke, farklı olarak, bu sondalar ile reaksiyona giren aktif proteinin miktarını gösterir, çünkü jel kemilüminesan görselleştirme kritiktir. moleküler ağırlık standartları ışık görüntüsü (Şekil 5B), çeşitli DUBS belirlenmesi için kılavuz olarak hizmet etmektedir. prob kütle DUB karakterize etmek için sonuçların analizi sırasında protein boyutuna eklenmesi gerekir doğru moleküler ağırlıklarında s.
Şekil 1:. Hücreler ve doku için Lizis yöntemler Resim (B) politron liziz karşılık (A) cam boncuklar kullanılarak hücre lizizi göstermektedir.
Şekil 2:. (A) liziz ve santrifüjlemeden sonra altta yerleşik cam boncuklar ve kesintisiz membranlar ve organeller gösteren hücre ve doku hücre lizatının santrifüje ürünleri. Içinde homojenizasyon ve santrifüj sonrasında alt (B) 'de kesintisiz membranlar ve organeller gösteren doku lizatındaki.
700 "/>
Şekil 3:.. DUBS etiketleme için Mekanizması aktif bölge sistein kalıntısı ve HA-Ub-VS fonksiyonel grup arasında kovalent bağı gösteren bir şematik bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: membranların Amido siyah lekeler HA-Ub-vinilsulfon (VS) ile etiketlenmiş N -ethylmaleimide (NEM) ile inkübe lizatları üzerinde yapılan amido siyah boyama gösteren Zarlar ve batılı bir leke üzerinde çalışır.. (A), HeLa - - soldan sağa doğru aşağıdaki örnekler bulunmaktadır NEM HeLa + NEM; (B) Sayın Standartları, M17 -. NEM, M17 + NEM tiklayiniz LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya k.
Şekil 5: Western blotlar Sonuçlar, anti-HA için tarama ile belirlenen çeşitli DUBS aktivitesi seviyesini gösteren Zarlar.. (A), HeLa - - soldan sağa doğru aşağıdaki örnekler bulunmaktadır NEM HeLa + NEM; (B) Mr Standartları; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ubikuitinasyon temel hücresel aktivite olduğundan, düzenleyici mekanizmaların anlaşılması hastalık ve patoloji süreçlerini ortaya çıkarılması için anahtar olabilir. HA kullanımı Burada rapor Ub türetilmiş aktif bölgeye yönelik sondalar Ub-aracılı protein parçalanmasını eğitimi için kolay, ama çok geçerli bir yöntem sağlar etiketledi. Bu yöntem daha hızlı ve daha az pahalı ayrı DUBS her biri eğitim fazladır.
Cam boncuklar kullanılarak - Bu yöntemde, hücre lizizi mekanik araçlar ile elde edilir. Lizis Bu nazik yöntem metabolik hücre içi bir resim korur. Bununla birlikte, bu parçalama yöntemi önemli bir dezavantajı, yaklaşık% 60-70 arasında, düşük verimliliktir. Bu hücrelerin bir sürü lisatlan deneyler için yeterince konsantre sağlamak için gerekli olan demektir. 80 ile T75 balonlarına -% 90 akıcı hücre tabakaları konsantre edilmiş bir lizat üretmek için kullanılır. Ayrıca, deney trypsinization aşaması kritiktirbağlı hücrelerin en çözeltisi içinde süspansiyon haline getirilmiş olması gerekir, çünkü. Kültürdeki hücrelerin önemli bir kısmı, 50 ml tüp aktarmadan önce yüzen emin olmak için bir mikroskop altında balon kontrol edin. Düzgün yapışmış olan hücrelerin trypsinize Başarısızlık küçük bir pelet ve daha düşük bir konsantrasyonda uzatma az lizat ile sonuçlanacaktır. Kullanımda olmayan Lizatlar kullanımdan önce -20 ° C'de 24 saat aktarılır ve buz üzerinde kullanım günü çözülmüş, -80 ° C'de saklanmalıdır. Bu lizat eşit çözülme sağlar ve hızlı çözülme ile ilgili enzimlere hasarı azaltır.
Bir Dounce ya politron homojenleştirici ya cam boncuklar 11 yerine kullanılabilir dokular için bu yöntemi uygulamak için. Elde edilen lizat hemen problar ile etiketlenen veya -80 ° C'de kullanılmak üzere saklanabilir. Dounce ya politron ardından lizat elde etmek için kullanılıyorsa, cam boncuklar kullanılmamalıdır. Bu lizat toplam protein konsantrasyonunda bir azalmaya neden olur. Birlternatively, birincil hücre kültürü yöntemleri kullanılarak, katı doku örnekleri, ilk kültürlenmiş ve daha sonra, cam boncuklar ile lize olabilir.
Bu yöntemin önemli bir sınırlama kullanıcı enzimlerinin aktivitesini görüntülemenizi sağlar olsa bile, bireysel DUBS ifadesi desenleri hakkında doğru bilgi vermez olmasıdır. Bu yöntem, enzim olmayan yapısal homolojiye fonksiyonel homoloji kullanır. Bu nedenle, tek tek antikorlar ile başka deneyler aktivitesi azalma aktif sitesine veya enzim gerçek bir kaybına kusurları bir sonucu olup olmadığını açıklar yapılması gerekecektir. Ayrıca, bu protokolde kullanılan parçalama yöntemi hücrelerin çekirdekleri açık sonu yok. Çekirdeğindeki seslendirmeler hastalık süreçleri hakkında ayrıntılı kritik bilgiler verebilir.
Bununla birlikte, bu yöntem, herhangi bir başka bir kaynaktan elde edilemez bilgi sağlama yeteneği açısından benzersizdir. Hem RNA metods ve bireysel antikorların kullanımı enzimler hakkında işlevsel bilgi vermemektedir. Gelecekte, potansiyel immünohistokimyasal (IHC) ile boyanarak, bu yöntemin uygulanması için vardır. İHK boyama sadece enzimlerin etkinliği hakkında bilgi vermek olmaz, ancak çeşitli seslendirmeler aktif olduğu da dokuda konuma içgörüler sağlayacaktır. Ayrıca, bu yöntem, böyle bir Colla ve diğerleri tarafından detaylı olarak bir hücre içi bölme tekniği ile bağlanabilir. 2012 zara bağlı organeller 12 takar aktivitesini incelemek. Bu moleküler biyoloji nispeten yeni bir tekniktir, ancak uygulamalar genişletmek için büyük bir potansiyel vardır. Aktif bölge yönlendirilmiş moleküler problar kullanılarak birçok hastalığın etyolojisi aydınlatılması için tuşunu basılı tutun olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz kullanılan fare omurilik doku örnekleri sağlamak için Minnesota Üniversitesi Lee laboratuvarını teşekkür etmek istiyorum. Bu eser MB Randy Tıraş Makinesi Kanser Araştırma ve Toplum Fonu tarafından ve Minnesota Yumurtalık Kanseri Birliği (MOCA) MB'ye göre, Savunma Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) MB OC093424 Bölümü tarafından desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
