Summary
Dettagli Il protocollo attuale un metodo per misurare l'attività degli enzimi funzionalmente omologo deubiquitinating. Sonde specializzate covalentemente modificano l'enzima e consentono il rilevamento. Questo metodo ha il potenziale di identificare nuovi bersagli terapeutici.
Abstract
Il sistema ubiquitina-proteasoma è stato recentemente coinvolto in diverse patologie, tra cui le malattie neurodegenerative e il cancro. Alla luce di questo, tecniche per studiare il meccanismo di regolazione di questo sistema sono essenziali per chiarire i processi cellulari e molecolari delle malattie summenzionate. L'uso di emoagglutinina derivante sonde ubiquitina delineate nel presente documento è uno strumento prezioso per lo studio di questo sistema. Dettagli Questo documento un metodo che consente all'utente di eseguire saggi che danno una visualizzazione diretta della deubiquitinating attività enzimatica. Enzimi Deubiquitinating controllano la degradazione del proteasoma e condividono un'omologia funzionale ai loro siti attivi, che permette all'utente di indagare l'attività di diversi enzimi in un test. Lisati sono ottenuti attraverso dolce rottura delle cellule meccanico e incubate con sito attivo sonde dirette. Enzimi funzionali sono contrassegnati con le sonde mentre enzimi inattivi rimangono non legato. Di corsaning questo test, l'utente ottiene informazioni sia l'attività e potenziale espressione di molteplici enzimi deubiquitinating in modo facile e veloce. Il metodo attuale è molto più efficiente rispetto all'utilizzo anticorpi individuali per i predetti cento enzimi deubiquitinating nella cellula umana.
Introduction
Il sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) serve come una delle principali vie di degradazione in cellule di mammifero. Substrati legati per la degradazione nel proteasoma sono covalentemente contrassegnati con polimeri di ubiquitina (Ub) 1. Prima che il substrato bersaglio entra proteasoma per la degradazione, l'etichetta poli-ubiquitina deve essere rimosso. Una classe di enzimi noti come deubiquitinating enzimi (dubs) è responsabile per la rimozione e il riciclaggio delle molecole di ubiquitina 2. E 'stato previsto dal genoma umano che ci sono quasi un centinaio dubs che lavorano nella cella 3. Con un gran numero di dubs che controllano processi cellulari Ub-mediate tale, lo studio di questi enzimi rappresenta una sfida in quanto le tecniche di mRNA non danno informazioni sull'attività e western blotting dà solo informazioni sui livelli di espressione.
L'uso di emoagglutinina influenzale (HA) tagged, Ub-derived sito diretto sonde attive permette una covalente modification dei dubs funzionali e quindi dà una visualizzazione diretta delle attività di questi enzimi in un Western Blot 4. Le sonde hanno un gruppo tiolo reattivo C-terminale che funge da substrato suicida per il sito attivo residuo di cisteina 5. Con queste sonde, è possibile studiare l'attività e potenziale espressione di molti DUBS sotto le due stati patologici e fisiologici della cellula.
Le variazioni di attività DUB sono stati implicati in una serie di condizioni patologiche come il Parkinson, l'Alzheimer, anemia e vari tipi di cancro 6-10. Questa tecnica fornisce un potente strumento per lo studio della malattia. In questo lavoro, mostriamo l'applicazione di questa tecnica in cellule HeLa e M17 che sono state lisate usando perline di vetro. Inoltre, si delineano come utilizzare questo metodo in campioni di tessuto del midollo spinale del mouse. Le informazioni ottenute da questa tecnica può essere usato come punto di partenza per l'identificazionebersagli terapeutici così come i modelli che stabiliscono per lo studio delle diverse condizioni di malattia. La vera utilità di questa tecnica risiede nella sua capacità di fornire informazioni su più dubs in un singolo dosaggio.
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Protocol
1. Lysis Buffer Preparazione
- Sciogliere il saccarosio in acqua deionizzata (DI) acqua per fare una soluzione stock 2 M. Filtrare una soluzione 2 M di saccarosio con un aspirapolvere azionato 0,22 micron fluoruro di polivinilidene (PVDF) filtro.
- Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 500 mm e conservare in condizioni anaerobiche. Sciogliere il cloruro di magnesio (MgCl 2) in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 100 mm. Sciogliere adenosina trifosfato (ATP) disodio idrato in acqua deionizzata per fare una soluzione stock di 50 mm.
- Portare una soluzione Tris a pH 7,4 sciogliendo Trizma cloridrato in acqua deionizzata e regolazione del pH usando idrossido di sodio (NaOH).
- Combinare porzioni delle soluzioni madre in acqua deionizzata per fare un tampone di lisi con una concentrazione di saccarosio di 250 mM, una concentrazione di 1 mM DTT, una concentrazione MgCl 2 di 5 mM, una concentrazione di ATP di 1 mM e una concentrazione di 50 mM Tris . Ad esempio, miscelare 535,3 ml di Tris, 500 ml di MgCl 2, 1,25 ml di saccarosio, 20 l di DTT, 200 ml di ATP e 7,4947 ml di acqua deionizzata per fare 10 ml di tampone di lisi. Questo può essere usato per circa 20 esperimenti.
2. Le cellule in coltura per l'esperimento
- Rendere i media aliquotandolo 30 ml di DMEM + 10% di siero fetale bovino (FBS) in un tubo da 50 ml.
- Trasferire le cellule HeLa M17 o congelati dallo stoccaggio di azoto liquido a una piccola bicchiere con acqua tiepida.
- Trasferire le cellule per provetta conica da 50 ml. In primo luogo, aggiungere alcuni media per la fiala cella. Poi il trasferimento delle cellule risospese entro 5 secondi di scongelamento.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 450 xg per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule. Aggiungere 20 ml di media in un pallone T75.
- Rimuovere il supporto da parte delle cellule con aspirazione. Aggiungere 5 ml di mezzi freschi per il pellet e risospendere.
- Trasferire la sospensione 5 ml di cellule ai 20 ml di media nel pallone T75 e incubare a 37 ° C. Change media ogni 3 giorni.
3. La raccolta delle cellule
- Rimuovere il supporto tramite aspirazione, facendo attenzione a non toccare le cellule.
- Lavare le cellule con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS). Rimuovere PBS con aspirazione.
- Aggiungere 3 ml di tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) al pallone T75 e incubare a 37 ° C per 3 min.
- Aggiungere 6 ml di mezzi freschi al pallone e risospendere le cellule.
- Trasferire la sospensione in un tubo da 15 ml e centrifugare a 290 xg per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di PBS. Battere delicatamente la parte inferiore del tubo per rompere il pellet. Centrifugare a 290 xg per 5 min.
- Ripetere il punto 3.6 a tre volte.
- Rimuovere PBS e risospendere le cellule in 1 ml di PBS fresco. Trasferire al tubo Eppendorf (1,5 ml). Spin a 290 g per 5 min.
4. cellulare Lysis
- Misurare il volume approssimativo del pellet usando una pipetta und pesare perline di vetro in una massa: rapporto in volume di 1: 1. Aggiungere il doppio del volume del pellet in tampone di lisi.
Nota: Aggiungere il buffer prima di aggiungere le perle di vetro. - Lisare le cellule nel tubo Eppendorf alla massima agitazione per 30 minuti a 4 ° C vortexando in una camera fredda.
- Brevemente Centrifugare a 200 xg per 30 secondi per risolvere le perline. Raccogliere il surnatante.
- Aggiungere lo stesso volume di perline di vetro come prima nel surnatante.
- Vortex nuovamente alla massima agitazione per 30 minuti a 4 ° C.
- Brevemente Centrifugare a 200 xg per 30 secondi per risolvere le perle di vetro. Raccogliere il surnatante.
- Centrifugare a 5.030 xg per 5 minuti per rimuovere i nuclei, membrane e cellule intatte. Raccogliere il supernatante, che è il lisato cellulare.
5. Tissue omogeneizzazione
- Fai una massa: volume di 1: 9 soluzione di tessuto del midollo spinale del mouse per tampone di lisi.
Nota: Questo metodo è applicabile ad una varietà di differirecampioni di tessuto Ent. - Omogeneizzare il tessuto utilizzando un'impostazione del livello 2 sulla omogeneizzatore per 30 sec per garantire che non vi siano blocchi rimanenti.
- Spin down a 5.030 xg per 3 min per rimuovere i nuclei, membrane e le cellule intatte.
- Raccogliere il supernatante, che è il lisato.
6. Campione Derivatizzazione
- Eseguire un acido bicinconinico (BCA) in un'analisi piastra a 96 pozzetti per determinare la concentrazione di proteine del lisato tissutale utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti colorimetrico come specificato dal protocollo del kit Protein Assay Pierce BCA.
- Portare una aliquota corrispondente a 20 mg di proteine totali di 50 microlitri utilizzando (DI) acqua deionizzata.
- Aggiungere 2 ml di 1,35 mM di HA-Ub-Vinyl sulfone (VS) alla soluzione e incubare per 1 ora a 37 ° C. Ciò provoca 20 ug di lisato 50 nM di sonda nella miscela di reazione finale. Questo è in forte eccesso molare per assicurare la codifica di dubs funzionali.
- IOncubate il campione in tampone campione di Laemmli per 5 minuti a 95 ° C. Per un 52 microlitri reazione volumi uso 26 ml di tampone 2x campione, 13 ml di tampone campione 4x o 8,87 ml di tampone campione 6x.
- Raffreddare in ghiaccio prima di caricare il gel.
7. Western Blot
- Caricare un 12-pozzetti 4-20% gel tris-glicina con 40 ml di campione preparato
- Attivare il gel a 95 V finché il fronte ione raggiunge il fondo.
- Effettuare un trasferimento notturno del gel su un polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana.
- Incubare la membrana nel ammidico macchia nera e scansire il membane per ottenere un'immagine che mostra la quantità di proteina in ogni corsia.
- Decolorare la membrana e incubare 5% di latte in PBS per 1 ora per bloccare.
- Incubare la membrana nella anticorpo anti-HA primario in una concentrazione di 1: 10.000 in 5% di latte in PBS o notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente.
- Effettuare 3 lavaggi fo 5 min ciascuna in PBS con 0,1% di Tween-20 detergente.
- Incubare la membrana in una perossidasi di rafano topo ad una concentrazione di 1: 10.000 in 5% di latte in PBS per almeno 2 ore.
- Effettuare 3 lavaggi per 5 minuti ciascuna in PBS con 0,1% Tween-20 detergente.
- Eseguire 1 lavaggio per 5 min in PBS.
- Incubare la membrana in un reagente di rilevamento chemiluminescente per 10 min e rilevare utilizzando un rivelatore a chemiluminescenza. Utilizzare l'impostazione sul rivelatore di esposizione automatica.
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Representative Results
Cellule HeLa M17 e coltivate sono state raccolte con il metodo descritto nel (cella di raccolta 3.) il protocollo e il tessuto del midollo spinale del mouse è stato ottenuto. Il / tessuto del midollo spinale pellet cellulare è stato posto in un tubo con il tampone di lisi descritto nella sezione di preparazione del reagente. Pellet cellulari sono stati lisati con perle di vetro (Figura 1A) e campioni di tessuto del midollo spinale di topo sono stati omogeneizzati usando l'omogeneizzatore (Figura 1B). Dopo lisi o omogeneizzazione, il campione è stato poi centrifugato a 5.030 xg per rimuovere le perline di vetro e / o le membrane e organelli ininterrotte (Figura 2). Entrambi questi metodi sono mezzi meccanici di lisi per preservare l'attività enzimatica. La concentrazione delle proteine delle cellule è stato quindi determinato con il metodo BCA. 20 mg di proteine totali è stata incubata con 2 ml di sonda 1,35 mM per 1 ora a 37 ° C (Figura 3). I campioni sono stati poi incubati in 4x Laemmli ditampone campione a 95 ° C per estinguere la reazione. I campioni preparati sono stati caricati su un gel tris-glicina 4-20% e funzionano a 95 V finché il fronte ione raggiunto il fondo. Le proteine sono state trasferite su una membrana overnight PVDF. Il caricamento proteina è stata verificata utilizzando la macchia nera amido (Figura 4). Questa fase di controllo assicura che le differenze nell'attività sono dovute a processi cellulari reali e non disuguale proteina carico. Quantità di proteina pari sono stati utilizzati nel primo esperimento (Figura 4A). Nel secondo esperimento, quantità di proteine ineguali sono stati caricati a causa delle differenze attese nei profili di attività delle diverse linee cellulari (Figura 4B). Questo è stato fatto per garantire il rilevamento di un profilo di attività per i lisati cellulari M17 incubati con N -ethylmaleimide (NEM), che è un inibitore della cisteina e dovrebbe portare ad un segnale ridotto sul western blot. Le membrane sono state incubate in anticorpo primario anti-HA, un mouse hperossidasi orseradish quindi rilevata utilizzando l'imaging chemiluminescenza (Figura 5). Codifica successo dei dubs utilizzando le sonde risultati in un profilo in ogni corsia della membrana (Figura 5A, C). L'intensità delle bande a diverso peso molecolare corrispondente al livello di attività dell'enzima DUB. Le differenze nei livelli di attività di varie DUBS attraverso linee cellulari diventano evidenti quando le proteine simili come UCHL1 sono confrontati nelle cellule HeLa e M17 (Figura 5). La visualizzazione chemiluminescente del gel è critico perché a differenza della macchia nera ammidico, che mostra la quantità di proteina caricata, questa mostra la quantità di proteina attiva che ha reagito con le sonde. L'immagine luce degli standard di peso molecolare (Figura 5B) funge da guida per identificare le varie dubs. La massa della sonda deve essere aggiunto alle dimensioni della proteina durante l'analisi dei risultati per caratterizzare la DUB s ai pesi molecolari corretti.
Immagine che mostra la lisi cellulare con perle di vetro in (A) rispetto Polytron lisi a (B) Lysis Metodi di cellule e tessuti: Figura 1..
Figura 2: centrifugazione Prodotti di cellule e tessuti lisati cellulari che mostrano le perline di vetro e stanziali membrane intatte e organelli in basso dopo lisi e centrifugazione in (A).. Tissue lisato mostrando le membrane intatte e organelli in basso dopo omogeneizzazione e centrifugazione in (B).
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Figura 3:.. Meccanismo per il tagging di dubs Uno schema che mostra il legame covalente tra la popolazione attiva residuo sito cisteina e il gruppo funzionale della HA-Ub-VS Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Amido macchie nere delle membrane membrane che mostrano la colorazione nera amido fatto su lisati incubati con N -ethylmaleimide (NEM), contrassegnati con HA-Ub-vinilsulfone (VS) ed eseguire su un Western Blot.. I campioni sono come segue da sinistra a destra - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) L'on Standards, M17 -. NEM, M17 + NEM prega CLICk qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Western Blot risultati Membrane mostrano i livelli di attività dei diversi dubs come determinato dal sondando per anti-HA.. I campioni sono come segue da sinistra a destra - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) L'on Standards; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dal momento che l'ubiquitinazione è un attività cellulare fondamentale, la comprensione dei meccanismi di regolamentazione potrebbe essere la chiave per dissotterrare i processi di malattia e patologia. L'uso di HA tagged sito diretto sonde attive Ub-derivati qui riportati fornisce un metodo semplice, ma altamente applicabile per studiare la degradazione delle proteine Ub-mediata. Questo metodo è più rapido e meno costoso di studiare ciascuno dei dubs singolarmente.
In questo metodo, la lisi delle cellule avviene tramite mezzi meccanici - utilizzando le perline di vetro. Questo metodo dolce di lisi conserva un'immagine intracellulare metabolica. Tuttavia, un grave inconveniente di questo metodo è la sua lisi bassa efficienza di circa il 60-70%. Questo significa un sacco di cellule devono garantire lisati sono concentrati abbastanza per esperimenti. Fiasche T75 con 80 - 90% strati di cellule confluenti dovrebbero essere utilizzati per produrre un lisato concentrato. Inoltre, la fase tripsinizzazione dell'esperimento è criticaperché la maggior parte delle cellule attaccate deve essere sospesa in soluzione. Controllare il matraccio al microscopio per assicurarsi che una parte significativa delle cellule in coltura sono galleggianti prima del trasferimento al tubo da 50 ml. La mancata trypsinize correttamente cellule aderenti si tradurrà in un pellet più piccole e per estensione meno lisato ad una concentrazione inferiore. Lisati che non sono in uso devono essere conservati a -80 ° C, trasferito a -20 ° C 24 ore prima dell'uso e scongelati su ghiaccio il giorno di utilizzo. Questo permette il lisato per scongelare uniformemente e riduce i danni agli enzimi di scongelamento rapido.
Per applicare questo metodo per tessuti o un Dounce o Polytron omogeneizzatore possono essere utilizzati al posto delle perle di vetro 11. Il lisato ottenuto può essere etichettato con le sonde immediatamente o conservato per l'uso a -80 ° C. Se il Dounce o Polytron viene utilizzato per ottenere il lisato quindi non devono essere utilizzati perle di vetro. Questo porta ad una riduzione della concentrazione di proteine totali del lisato. Lalternatively, utilizzando cellulari primarie metodi colturali i campioni di tessuto solido potrebbe essere colta e poi lisato con perle di vetro.
Una limitazione importante di questo metodo è che, anche se consente all'utente di visualizzare l'attività degli enzimi, non dà informazioni precise sui pattern di espressione dei singoli dubs. Questo metodo utilizza omologia funzionale nelle non enzimi omologia strutturale. Pertanto, ulteriori esperimenti con i singoli anticorpi dovranno essere fatto per spiegare se la riduzione dell'attività è il risultato di difetti nel sito attivo o una perdita reale di tale enzima. Inoltre, il metodo di lisi utilizzato in questo protocollo non si rompe per i nuclei delle cellule. Dubs nel nucleo potrebbero fornire informazioni maggiori critiche su processi di malattia.
Tuttavia questo metodo è unico nella sua capacità di fornire informazioni che non possono essere ottenute da qualsiasi altra fonte. Entrambi RNA methods e l'uso di anticorpi individuali non forniscono informazioni funzionali sugli enzimi. In futuro, esiste la possibilità che l'applicazione di questo metodo per immunoistochimica (IHC) colorazione. IHC colorazione non solo dare informazioni sulla attività degli enzimi, ma sarà anche fornire intuizioni nella posizione nel tessuto in cui i vari DUBS sono attivi. Inoltre, questo metodo potrebbe essere accoppiato con una tecnica di frazionamento subcellulare come quello descritto da Colla et al. Nel 2012 per studiare l'attività dei dubs a membrana organelli vincolati 12. Anche se questa è una tecnica relativamente nuova in biologia molecolare, vi è un enorme potenziale per espandere le applicazioni. Utilizzando sonde attive sito diretto molecolari potrebbe essere la chiave per chiarire l'eziologia di molte malattie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il laboratorio Lee dell'Università del Minnesota per fornire i campioni di tessuto del midollo spinale del mouse che sono stati utilizzati. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 a MB, con la Ricerca sul Cancro e Fondo comunitario Randy Shaver a MB e dal Minnesota Ovarian Cancer Alliance (MOCA) a MB. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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