Summary
Den nuværende protokol detaljer en fremgangsmåde til måling af aktiviteten af funktionelt homologe afubiquitinerende enzymer. Specialiserede sonder kovalent modificere enzymet og give mulighed for detektion. Denne metode har potentiale til at identificere nye terapeutiske mål.
Abstract
Ubiquitin-proteasom systemet er for nylig blevet impliceret i forskellige patologier, herunder neurodegenerative sygdomme og cancer. I lyset af dette, teknikker til at studere den regulerende mekanisme af denne ordning er afgørende for at belyse de cellulære og molekylære processer i de førnævnte sygdomme. Brugen af hæmagglutinin afledt ubiquitin sonder er skitseret i dette dokument fungerer som et værdifuldt redskab for studiet af dette system. Dette papir beskriver en metode, der gør det muligt for brugeren at udføre assays, der giver en direkte visualisering af afubiquitinerende enzymaktivitet. Afubiquitinerende enzymer styrer proteasomalaktivitet nedbrydning og del funktionel homologi ved deres aktive steder, hvilket giver brugeren mulighed for at undersøge aktiviteten af flere enzymer i en assay. Lysater opnås gennem forsigtig mekanisk cellesprængning og inkuberet med aktiv stedrettet prober. Funktionelle enzymer er kodet med sonderne mens inaktive enzymer forbliver ubundet. Ved kørselning dette assay, at brugeren får oplysninger om både aktiviteten og potentielle ekspression af multiple afubiquitinerende enzymer på en hurtig og nem måde. Den nuværende metode er signifikant mere effektiv end anvendelse af individuelle antistoffer for de forudsagte hundrede afubiquitinerende enzymer i den humane celle.
Introduction
Ubiquitin-proteasom systemet (UPS) tjener som en af de store nedbrydningsveje i den mammale celle. Substrater vej til nedbrydning i proteasomet er kovalent mærket med polymerer af ubiquitin (Ub) 1. Før den målrettede substrat kommer ind i proteasom for nedbrydning, skal de poly-ubiquitin mærket fjernes. En klasse af enzymer kaldet afubiquitinerende enzymer (DUBs) er ansvarlig for fjernelse og genanvendelse af ubiquitin molekyler 2. Det er blevet forudsagt ud fra det humane genom, at der er næsten hundrede DUBs arbejder i cellen 3. Med sådan et stort antal DUBs kontrollerer Ub-medierede cellulære processer, studere disse enzymer er en udfordring, da mRNA teknikker ikke giver oplysninger om aktivitet og western blotting giver kun oplysninger om ekspressionsniveauer.
Anvendelsen af influenza hæmagglutinin (HA) mærkede, Ub-afledte aktive stedrettet prober muliggør en covalent modification af de funktionelle DUBs og derfor giver en direkte visualisering af aktiviteten af disse enzymer på en Western blot 4. Proberne har en C-terminal thiol reaktiv gruppe, der fungerer som et selvmord substrat for det aktive sted cysteinrest 5. Med disse prober, er det muligt at studere aktiviteten og potentielle ekspression af mange DUBs under både patologiske og fysiologiske tilstande af cellen.
Ændringer i DUB aktivitet, er blevet impliceret i en række patologiske tilstande, såsom Parkinsons, Alzheimers, anæmi og forskellige kræftformer 6-10. Denne teknik giver et stærkt værktøj til studiet af sygdom. I det foreliggende papir, viser vi anvendelsen af denne teknik i HeLa og M17-celler, der er blevet lyseret anvendelse af glasperler. Desuden har vi skitsere, hvordan at bruge denne metode i muse rygmarv vævsprøver. Oplysningerne fra denne teknik kan anvendes som et udgangspunkt for at identificereterapeutiske mål samt fastlæggelse modeller til undersøgelse af forskellige sygdomstilstande. Den sande nytte af denne teknik ligger i dens evne til at give oplysninger om flere DUBs i en enkelt analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysis Buffer Fremstilling
- Opløs sucrose i deioniseret (DI) vand for at lave en 2 M stamopløsning. Foretage en 2 M opløsning af saccharose ved anvendelse af en vakuum drevet 0,22 um polyvinylidenfluorid (PVDF) filter.
- Opløs dithiothreitol (DTT) i DI vand for at lave en 500 mM stamopløsning og opbevares under anaerobe forhold. Magnesiumchlorid (MgCl2) opløses i DI vand for at lave en 100 mM stamopløsning. Adenosintriphosphat (ATP) dinatrium-hydrat opløses i DI vand for at lave en 50 mM stamopløsning.
- Udgør en Tris-opløsning ved pH 7,4 ved at opløse Trizma hydrochlorid i DI vand og justere pH ved anvendelse af natriumhydroxid (NaOH).
- Kombiner portioner af stamopløsningerne i DI vand for at lave en lysis buffer med en saccharose koncentration på 250 mM, en DTT-koncentration på 1 mM, MgCl2 en koncentration på 5 mM, en ATP-koncentration på 1 mM og en Tris-koncentration på 50 mM . For eksempel blande 535,3 pi tris, 500 pi MgCl2, 1,25 ml saccharose, 20 pi DTT, 200 pi ATP og 7,4947 ml Dl-vand til at gøre 10 ml lysisbuffer. Dette kan anvendes i ca. 20 eksperimenter.
2. dyrkning af celler til eksperimentet
- Foretag medier ved alikvotere 30 ml DMEM + 10% føtalt bovint serum (FBS) i en 50 ml konisk rør.
- Overføre frosne M17 eller HeLa-celler fra lagring i flydende nitrogen til et lille bægerglas med lunkent vand.
- Overføre cellerne til 50 ml konisk rør. Første, tilføje nogle medier til hætteglasset celle. Derefter overføre de resuspenderede celler i 5 sek af optøning.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 450 xg i 5 min til opnåelse af en cellepellet. Der tilsættes 20 ml medier i en T75 kolbe.
- Fjern mediet fra cellerne ved hjælp af sugning. Der tilsættes 5 ml frisk medium til cellepelleten og resuspender.
- Overfør 5 ml cellesuspension til 20 ml medium i T75-kolbe, og der inkuberes ved 37 ° C. ChAnge medierne hver 3. dag.
3. Cell Høst
- Fjern medier via sugning, og pas på ikke at røre cellerne.
- Vask cellerne med 5 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Fjern PBS under anvendelse af sugning.
- Tilsæt 3 ml trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til T75 kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Tilsæt 6 ml frisk medium til kolben og cellerne resuspenderes.
- Overfør suspensionen til et 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 290 x g i 5 minutter.
- Supernatanten fjernes, og der tilsættes 5 ml PBS. Bank let på bunden af røret til at bryde op pillen. Centrifuger ved 290 x g i 5 min.
- Gentag trin 3.6 tre gange.
- Fjern PBS og cellerne resuspenderes i 1 ml frisk PBS. Overførsel til Eppendorf-rør (1,5 ml). Spin ved 290 xg i 5 min.
4. Cell Lysis
- Måle den omtrentlige mængde af pelleten under anvendelse af en pipette end afveje glasperler i en masse: volumen-forhold på 1: 1. Tilføj dobbelte af volumen af pelleten i lysepuffer.
Bemærk: Tilsæt buffer, før du tilføjer glasperler. - Lyserer cellerne i Eppendorf-rør ved den maksimale omrøring i 30 minutter ved 4 ° C ved hvirvelbehandling i et kølerum.
- Centrifuge kortvarigt ved 200 xg i 30 sek at bilægge perlerne. Opsaml supernatanten.
- Tilsæt samme mængde glasperler som før til supernatanten.
- Vortex igen ved maksimal omrøring i 30 minutter ved 4 ° C.
- Centrifuge kortvarigt ved 200 xg i 30 sek at afvikle glasperler. Opsaml supernatanten.
- Centrifuger ved 5.030 xg i 5 minutter for at fjerne kerner, membraner og ubrudte celler. Opsaml supernatanten, hvilket er cellelysatet.
5. Tissue Homogenisering
- Foretag en masse: volumen på 1: 9 opløsning af muse rygmarvsvæv til lysisbuffer.
Bemærk: Denne metode kan anvendes på en bred vifte af forskelligent vævsprøver. - Homogenisere vævet med en indstilling af niveau 2 på homogenisator i 30 sek for at sikre, at der ikke er nogen klumper tilbage.
- Spin ned på 5.030 xg i 3 min for at fjerne kerner, membraner og ubrudte celler.
- Opsaml supernatanten, hvilket er lysatet.
6. Prøve Derivatisering
- Udfør en bicinchoninsyre (BCA) i en 96-brønds plade analyse for at bestemme proteinkoncentrationen af vævet lysat under anvendelse af en kolorimetrisk 96-brønds plade-læser som angivet af Pierce BCA Protein Assay kit protokol.
- Bringe en alikvot svarende til 20 ug totalt protein til 50 pi ved anvendelse af (DI) vand de-ioniseret.
- Tilsæt 2 pi 1,35 pM af HA-Ub-vinylsulfon (VS) til opløsningen og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Dette resulterer 20 ug lysat til 50 nM probe i den endelige reaktionsblanding. Dette er i stort moloverskud at sikre mærkning af funktionelle DUBs.
- Jegncubate prøven i Laemmlis prøvebuffer i 5 minutter ved 95 ° C. For en 52 pi reaktionsvolumen brug 26 pi 2x prøvebuffer, 13 pi 4x prøvepuffer eller 8,87 pi 6x prøvepuffer.
- Cool på is, inden du lægger gelen.
7. Western Blot
- Indlæse en 12-brønd 4-20% tris-glycin gel med 40 pi den forberedte prøve
- Køre gelen ved 95 V, indtil ion foran når bunden.
- Udføre en overnatning overførsel af gelen på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran.
- Inkuber membranen i amidosort pletten og scanne membane at opnå et billede, der viser mængden af protein i hver bane.
- Affarvning membranen og inkuberes i 5% mælk i PBS i 1 time for at blokere.
- Inkuber membranen i det primære anti-HA-antistof i en koncentration på 1: 10.000 i 5% mælk i PBS enten natten over ved 4 ° C eller i 4 timer ved stuetemperatur.
- Udfør 3 vaske feller 5 min hver i PBS med 0,1% Tween-20 detergent.
- Inkuber membranen i en muse peberrodsperoxidase i en koncentration på 1: 10.000 i 5% mælk i PBS i mindst 2 timer.
- Udfør 3 vaske i 5 min hver i PBS med 0,1% Tween-20 detergent.
- Udfør 1 vask i 5 minutter i PBS.
- Inkuber membranen i et kemiluminescerende påvisningsreagens i 10 minutter og detektere ved hjælp af en kemiluminescensdetektor. Brug den automatiske eksponering indstilling på detektoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrkede M17 og HeLa-celler blev høstet ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i protokollen (3. Cell Høst) og muse rygmarv væv blev opnået. Cellepelleten / rygmarv væv blev anbragt i et rør med lysisbuffer beskrevet i afsnit reagenset præparat. Cellepellets blev lyseret under anvendelse af glasperler (figur 1A) og mus rygmarv vævsprøver blev homogeniseret ved anvendelse af homogenisatoren (figur 1B). Efter lyse eller homogenisering blev prøven derefter centrifugeret ved 5.030 xg for at fjerne glaskugler og / eller de ubrudte membraner og organeller (figur 2). Begge disse metoder er mekaniske midler til lysis at bevare enzymaktivitet. Proteinkoncentrationen af cellerne blev derefter bestemt under anvendelse af BCA-metoden. 20 ug totalt protein blev inkuberet med 2 pi 1,35 pM probe i 1 time ved 37 ° C (figur 3). Prøverne blev derefter inkuberet i 4x Laemmli størsteprøvepuffer ved 95 ° C for at standse reaktionen. De fremstillede prøver blev sat på en 4-20% tris-glycin gel og kørt ved 95 V, indtil ion fronten nåede bunden. Proteinerne blev overført natten over på en PVDF-membran. Proteinet loading blev kontrolleret under anvendelse af amidosort farvning (figur 4). Denne styring trin sikrer, at forskellene i aktivitet skyldes faktiske cellulære processer og ikke ulige protein belastning. Lige proteinmængder blev anvendt i det første eksperiment (figur 4A). I det andet eksperiment blev ulige proteinmængder læsset på grund af de forventede forskelle i aktivitet profiler af de forskellige cellelinier (figur 4B). Dette blev gjort for at sikre påvisning af en aktivitet profil for M17 cellelysater inkuberet med N -ethylmaleimide (NEM), som er en cystein-hæmmer og bør føre til et reduceret signal på western blot. Membranerne blev inkuberet i anti-HA-primært antistof, et muse horseradish peroxidase og derefter påvises under anvendelse af kemiluminescens billeddannelse (figur 5). Vellykket tagging af DUBs hjælp af sonder resulterer i en profil i hver bane af membranen (figur 5A, C). Intensiteten af båndene på forskellige molekylvægte svarer til aktivitetsniveauet i DUB enzymet. Forskellene i aktivitetsniveauer af forskellige DUBs tværs cellelinjer bliver indlysende, når lignende proteiner, såsom UCHL1 sammenlignes i HeLa og M17-celler (figur 5). Den kemiluminescerende visualisering af gelen er kritisk, fordi i modsætning til amidosort pletten, der viser mængden af protein indlæst, dette viser mængden af aktivt protein, der har reageret med proberne. Lyset billede af molekylvægtstandarderne (figur 5B) fungerer som guide til at identificere de forskellige DUBs. Massen af proben skal føjes til størrelsen af proteinet under analyse af resultaterne til at karakterisere DUB s ved de korrekte molekylvægte.
Figur 1:. Lysis Fremgangsmåder til celler og væv Billede, der viser cellelyse anvendelse af glasperler i (A) versus polytron lysis i (B).
Figur 2: Centrifugering Produkter fra celler og væv Cellelysat viser faste glasperler og ubrudte membraner og organeller i bunden efter lyse og centrifugering i (A).. Tissue lysat viser ubrudte membraner og organeller i bunden efter homogenisering og centrifugering i (B).
700 "/>
Figur 3:.. Mekanisme for øremærkning af DUBs En skematisk viser kovalente binding mellem det aktive site cysteinenhed og den funktionelle gruppe af HA-Ub-VS Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: amidosort pletter af membranerne Membraner viser amidsortfarvning udført på lysater inkuberet med N -ethylmaleimide (NEM), mærket med HA-Ub-vinylsulfon (VS) og kørt på en Western blot.. Prøverne er som følger fra venstre til højre - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Hr Standarder, M17 -. NEM, M17 + NEM venligst Click her for et større version af dette tal.
Figur 5: western blots resultater Membraner viser aktivitetsniveauet for de forskellige DUBs som bestemt ved sondering for Anti-HA.. Prøverne er som følger fra venstre til højre - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Hr standarder; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da ubiquitinering er en grundlæggende cellulær aktivitet, kunne forstå de reguleringsmekanismer være nøglen til unearthing processerne på sygdom og patologi. Brugen af HA mærkede Ub-afledte aktive stedrettet sonder rapporteret her giver en let, men yderst anvendelig metode til undersøgelse Ub-medieret proteinnedbrydning. Denne metode er hurtigere og billigere end at studere hver enkelt af de DUBs individuelt.
I denne fremgangsmåde bliver lysis af cellerne opnås via mekaniske midler - ved hjælp glasperlerne. Denne milde metode til lysis bevarer en metabolisk intracellulær billede. Imidlertid en stor ulempe ved denne lysis metode er dens lave virkningsgrad på ca. 60-70%. Det betyder en masse celler er nødvendige for at sikre lysater er koncentreret nok til eksperimenter. T75 kolber med 80-90% konfluente cellelag bør anvendes til at fremstille en koncentreret lysat. Endvidere trypsinisering trin af eksperimentet er kritiskfordi de fleste af de vedhæftede celler skal suspenderes i opløsning. Kontroller kolbe under et mikroskop for at sikre, at en væsentlig del af cellerne i kultur er flydende før overførsel til 50 ml rør. Manglende korrekt Trypsinisér adhærente celler vil resultere i en mindre pellet og dermed mindre lysat ved en lavere koncentration. Lysater, der ikke er i brug, bør opbevares ved -80 ° C, overført til -20 ° C i 24 timer før brug og optøet på is anvendelsesdagen. Dette tillader lysatet at optø jævnt og reducerer beskadigelse af enzymer fra hurtig optøning.
At anvende denne metode på væv enten en Dounce eller polytron homogenisator kan anvendes i stedet for glasperlerne 11. Den opnåede lysat kan mærkes med proberne straks eller opbevares til anvendelse ved -80 ° C. Hvis der anvendes dounce eller polytron at opnå lysatet så bør ikke anvendes glasperler. Dette fører til en reduktion i den totale proteinkoncentration af lysatet. Enlternatively, under anvendelse af primær cellekultur metoder de faste vævsprøver kunne dyrkes først og derefter lyseret med glasperler.
En væsentlig begrænsning ved denne metode er, at selv om det giver brugeren mulighed for at visualisere aktiviteten af enzymerne, betyder det ikke give nøjagtige oplysninger om ekspressionsmønstre for de enkelte DUBs. Denne metode anvender funktionel homologi i enzymerne ikke strukturel homologi. Derfor vil yderligere forsøg med de individuelle antistoffer skal gøres for at forklare, om reduktionen i aktivitet er en følge af mangler ved det aktive sted eller et faktisk tab af enzymet. Derudover betyder lysis metode anvendt i denne protokol ikke bryde åbne kernerne i cellerne. DUBs i kernen kunne give yderligere vigtige oplysninger om sygdomsprocesser.
Ikke desto mindre er denne metode er enestående i sin evne til at give oplysninger, som ikke kan fås fra enhver anden kilde. Både RNA methods og anvendelsen af individuelle antistoffer giver ikke funktionel information om enzymer. I fremtiden eksisterer potentialet for anvendelsen af denne metode til immunhistokemisk (IHC) farvning. IHC farvning vil ikke kun give oplysninger om aktiviteten af enzymerne, men det vil også give indblik i det sted i vævet, hvor de forskellige DUBs er aktive. Desuden kunne denne metode kobles med en subcellulær fraktionering teknik, såsom den, der er beskrevet af Colla et al. I 2012 for at studere aktiviteten af DUBs i membranbundne organeller 12. Selv om dette er en forholdsvis ny teknik i molekylær biologi, er der et stort potentiale for at udvide programmer. Ved hjælp af aktivt sted rettet molekylære prober måske nøglen til at belyse ætiologien af mange sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Lee lab fra University of Minnesota for at give musen rygmarven vævsprøver, der blev brugt. Dette arbejde blev støttet af det amerikanske forsvarsministerium i æggestokkene Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, som Randy Shaver Cancer Research og Fællesskabets fond til MB og af Minnesota kræft i æggestokkene Alliance (MOCA) til MB. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
