测量去泛素酶的活性细胞系和组织样品的方法
Summary
目前的协议细节，用于测量功能性同源去泛素酶的活性的方法。专门探针共价修饰的酶，并允许进行检测。这种方法保存，以确定新的治疗靶点的潜力。
Abstract
泛素 – 蛋白酶体系统最近已经牵连在各种病症，包括神经变性疾病和癌症。鉴于此，技术研究本系统的调控机制是必不可少的阐明上述疾病的细胞和分子过程。使用本文中概述血凝素衍生的泛素探针作为本系统的研究的宝贵工具。本文详述的方法，使用户能够执行检测，让去泛素酶活性的直接可视化。去泛素化酶控制蛋白酶体降解，并在它们的活性位点，其允许用户进行调查多种酶的活性在一个测定共享功能同源性。裂解液是通过温和的化学细胞破碎，并获得与培养活性部位定向探头。功能酶标记探针，同时不活跃的酶保持绑定。通过运行宁该测定中，用户获得上的活性和多个去泛素酶在一个快速和容易的方式潜在表达信息。当前的方法是显著比使用单个抗体对于预测百在人类细胞去泛素酶更有效。
Introduction
泛素 – 蛋白酶体系统（UPS），作为在哺乳动物细胞的主要降解途径之一。基板在蛋白酶体结合的降解共价标记的泛素（泛素）1的聚合物。前的目标衬底进入蛋白酶体进行降解，聚遍在蛋白标记必须被去除。一类称为酶去泛素（泛素化酶）的酶负责泛素分子2的去除和回收。据预测，从人类基因组中，有近百名在泛素化酶小区3工作。有了这样一个大量的泛素化酶泛素控制介导的细胞过程，研究这些酶是一种挑战，因为基因技术不给上的活动和免疫印迹信息，仅给出了表达水平的信息。
使用流感血凝素（HA）的标记，泛素衍生的活性部位定向探头允许的共价国防部官能泛素化酶并且因此ification给出了这些酶的活性对Western印迹4直接可视化。探针具有用作活性位点半胱氨酸残基5一自杀底物的C-末端硫醇反应性基团。用这些探针，能够研究细胞的两个病理和生理状态下许多泛素化酶的活性和潜在的表达。
变化DUB活性已牵涉多种病理状况，如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，贫血和多种癌症6-10。这种技术提供了一个强大的工具，疾病的研究。在本文中，我们将展示这项技术在HeLa和M17细胞已使用玻璃珠裂解的应用。此外，我们概述了如何使用此方法在小鼠脊髓组织样本。从这种技术获得的信息可以被用来作为一个起点，用于识别治疗目标以及用于不同疾病状况的研究建立的模型。这种技术的真正的实用在于它能够提供在多个泛素化酶信息在单个测定能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于泛素化是一个基本的细胞活性，了解监管机制可能是关键发掘疾病和病理过程。使用医管局标记这里报告泛素衍生的活性部位定向探头提供了一种简单，但非常适用的方法成为研究泛素介导的蛋白质降解。这种方法更快，更便宜不是单独研究泛素化酶中的每一个。
在该方法中，细胞的裂解是通过机械装置来实现 – 利用玻璃珠。这种温和的裂解方法保留代谢细胞内的画面?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢明尼苏达大学的李实验室提供了所用的小鼠脊髓组织样本。这项工作是由国防部卵巢癌研究计划（OCRP）OC093424以MB部的支持下，由兰迪剃须刀癌症研究和社区基金，以MB和明尼苏达卵巢癌联盟（MoCA），以MB。该资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿没有作用。
Materials
| PowerGen 125 ( Homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters .22µM | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life technologies | 11965-092 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Life technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4X, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoScientific | 23225 |
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