Summary
Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.
Abstract
De ubiquitine-proteasoom-systeem is onlangs betrokken bij diverse pathologieën waaronder neurodegeneratieve ziekten en kanker. Gezien deze technieken voor het bestuderen van reguleringsmechanisme van dit systeem zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire en moleculaire processen van bovengenoemde ziekten. Het gebruik van hemagglutinine afkomstig ubiquitine probes die in dit document dient als een waardevol hulpmiddel voor de studie van dit systeem. Deze paper Gegevens een methode die de gebruiker in staat stelt om te testen die een directe visualisatie van ubiquitinerings enzymactiviteit te voeren. Ubiquitinerings enzymen regelen proteasomale afbraak en functionele homologie delen hun actieve plaatsen, waarmee de gebruiker de activiteit van verschillende enzymen in een assay te onderzoeken. Lysaten worden verkregen door middel van zachte mechanische celdisruptie en geïncubeerd met actieve plaatsgerichte probes. Functionele enzymen worden gelabeld met de sondes tijdens inactieve enzymen ongebonden blijven. Door running deze test krijgt de gebruiker informatie over zowel de activiteit en mogelijke expressie van meerdere ubiquitinerings enzymen op een snelle en gemakkelijke wijze. De huidige methode is significant efficiënter dan het gebruik van afzonderlijke antilichamen voor de voorspelde honderd ubiquitinerings enzymen in de menselijke cel.
Introduction
De ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) dient als een van de belangrijkste afbraakroutes in de zoogdiercel. Substraten gebonden voor de afbraak in het proteasoom covalent gelabeld met polymeren van ubiquitine (Ub) 1. Voor het beoogde substraat komt het proteasoom voor afbraak, moet de poly-ubiquitine tag verwijderd. Een klasse van enzymen bekend als ubiquitinerings enzymen (Dubs) is verantwoordelijk voor de verwijdering en recycling van ubiquitine moleculen 2. Volgens schattingen van het menselijk genoom dat er bijna honderd Kopieën die in de cel 3. Met een dergelijk groot aantal nasynchroniseert regelen Ub-gemedieerde cellulaire processen bestuderen van deze enzymen een uitdaging omdat mRNA technieken geen informatie over de activiteit en Western blotting geven geeft alleen informatie over expressieniveaus.
Het gebruik van influenza hemagglutinine (HA) tag, Ub-afgeleide actieve plaatsgerichte probes maakt een covalente modcatie van de functionele nasynchroniseert en derhalve geeft een directe visualisatie van de activiteit van deze enzymen op een western blot 4. De probes hebben een C-eindstandige thiol reactieve groep die dient als zelfmoord substraat voor de actieve plaats cysteïnerest 5. Met deze sondes is het mogelijk om de activiteit en mogelijke expressie van vele nasynchroniseert studeren bij zowel fysiologische en pathologische toestanden van de cel.
Veranderingen in DUB activiteit zijn betrokken bij een aantal pathologische aandoeningen zoals Parkinson, Alzheimer, anemie en diverse kankers 6-10. Deze techniek verschaft een krachtig hulpmiddel voor de studie van ziekten. In het onderhavige document tonen wij de toepassing van deze techniek in HeLa en M17-cellen die werden gelyseerd middels glasparels. Daarnaast hebben we schetsen hoe deze methode in de muis ruggenmerg weefselmonsters gebruiken. De resultaten van deze techniek informatie kan worden gebruikt als uitgangspunt voor het identificerentherapeutische doelen alsmede vaststelling modellen voor de studie van verschillende aandoeningen. De werkelijke bruikbaarheid van deze techniek ligt in het vermogen om informatie op meerdere Kopieën voorzien in een enkele assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysis Buffer Voorbereiding
- Los sucrose in gedeïoniseerd (DI) water met een 2 M voorraadoplossing te maken. Filtreer een 2 M oplossing van sucrose met behulp van een vacuüm aangedreven 0,22 urn polyvinylideenfluoride (PVDF) filter.
- Los dithiothreitol (DTT) in DI water om een 500 mM voorraad oplossing en op te slaan onder anaerobe omstandigheden te maken. Los magnesiumchloride (MgCl2) in DI water om een 100 mM voorraad oplossing te maken. Los adenosine trifosfaat (ATP) dinatrium hydrateren in DI water om een 50 mM voorraad oplossing te maken.
- Maak een Tris bij pH 7,4 door het oplossen Trizma hydrochloride in DI-water en de pH met behulp van natriumhydroxide (NaOH).
- Combineer gedeelten van de voorraadoplossingen in DI water om een lysis buffer maken met een sucrose concentratie van 250 mM, een DTT-concentratie van 1 mM, een MgCl2-concentratie van 5 mM, de ATP-concentratie van 1 mM en een Tris concentratie van 50 mM . Bijvoorbeeld, meng 535,3 pl tris, 500 pl MgCl2, 1,25 ml sucrose, 20 pl DTT, 200 pl ATP en 7,4947 ml DI water tot 10 ml lysisbuffer maken. Dit kan voor ongeveer 20 experimenten.
2. Kweken van cellen voor Experiment
- Voeg media door aliquoting 30 ml DMEM + 10% foetaal runderserum (FBS) in een 50 ml conische buis.
- Transfer bevroren M17 of HeLa-cellen uit vloeibare stikstof opslag een kleine beker met lauw water.
- Breng de cellen om de 50 ml conische buis. Voeg eerst sommige media aan de cel flacon. Daarna brengt de geresuspendeerde cellen binnen 5 seconden na het ontdooien.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 450 xg gedurende 5 minuten een celpellet te verkrijgen. Voeg 20 ml medium in een T75 kolf.
- Verwijder de media uit de cellen met behulp van zuigkracht. Voeg 5 ml vers medium aan de cellen en resuspendeer pellet.
- Breng de 5 ml celsuspensie aan de 20 ml van media in de T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C. Change de media om de 3 dagen.
3. Cell Oogsten
- Verwijder de media via zuigkracht, zorg dat u de cellen niet aan te raken.
- Was de cellen met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder PBS gebruikt afzuiging.
- Voeg 3 ml trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bij de T75 kolf en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 min.
- Voeg 6 ml van verse media om de kolf en resuspendeer de cellen.
- Breng de suspensie aan een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en voeg 5 ml PBS. Tik voorzichtig de bodem van de buis te breken van de pellet. Centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten.
- Herhaal stap 3.6 drie keer.
- Verwijder PBS en resuspendeer de cellen in 1 ml verse PBS. Transfer naar Eppendorf tube (1,5 ml). Spin bij 290 xg gedurende 5 minuten.
4. Cel Lysis
- Meet het volume van de pellet benadering met een pipet eend afwegen glazen kralen in een massa: volume verhouding van 1: 1. Voeg tweemaal het volume van de pellet in lysis buffer.
Opmerking: Voeg de buffer voor het toevoegen van de glasparels. - Lyse van de cellen in de Eppendorf buis bij de maximale schudden gedurende 30 minuten bij 4 ° C door vortexen in een koude kamer.
- Centrifugeer kort bij 200 xg gedurende 30 seconden om de kralen te regelen. Verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Voeg een gelijk volume glaskorrels als voorheen aan het supernatant.
- Vortex opnieuw maximaal schudden gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Centrifugeer kort bij 200 xg gedurende 30 seconden aan de glazen kralen af te wikkelen. Verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Centrifugeer bij 5030 xg gedurende 5 minuten aan de kernen, membranen en ongebroken cellen te verwijderen. Verzamel de bovenstaande vloeistof, die het cellysaat.
5. Tissue Homogenisering
- Maak een massa: volume van 1: 9 oplossing van de muis ruggenmerg weefsel lysisbuffer.
Opmerking: Deze methode is toepasbaar op een verscheidenheid verschient weefselmonsters. - Homogeniseer het weefsel met behulp van een instelling van niveau 2 van de homogenisator gedurende 30 seconden zodat er geen stukjes overgebleven.
- Spin neer op 5030 xg gedurende 3 minuten naar de kernen, membranen en ongebroken cellen te verwijderen.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof, die het lysaat.
6. Sample Derivatisering
- Voer een bicinchoninezuur (BCA) in een 96-putjesplaat analyse om de eiwitconcentratie van het lysaat weefsel met behulp van een colorimetrische 96 putjes plaatlezer aanwijzingen van de Pierce BCA Protein Assay kit protocol te bepalen.
- Breng een hoeveelheid die overeenkomt met 20 ug totaal eiwit aan 50 gl behulp gedeïoniseerd (DI) water.
- Voeg 2 ul van 1,35 uM HA-Ub-vinyl sulfon (VS) aan de oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Dit resulteert 20 ug lysaat tot 50 nM probe in het uiteindelijke reactiemengsel. Dit is in grote molaire overmaat aan tagging van functionele dubs waarborgen.
- Ikncubate het monster in Laemmli monsterbuffer gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Voor een 52 ul reactie volume gebruik 26 ul 2x monsterbuffer, 13 ul van 4x sample buffer of 8,87 pi van 6x monsterbuffer.
- Afkoelen op ijs vóór het laden van de gel.
7. Western Blot
- Laad een 12-put 4-20% Tris-glycine gel met 40 ul van de voorbereide monster
- Laat de gel bij 95 V tot de ion achterkant bodem bereikt.
- Verricht een overnachting overdracht van de gel op een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan.
- Incubeer het membraan in de amido zwarte vlek en scan de membane een overzicht zien van de hoeveelheid eiwit in elke laan te verkrijgen.
- Destain het membraan en geïncubeerd in 5% melk in PBS gedurende 1 uur te blokkeren.
- Incubeer het membraan in de primaire anti-HA antilichaam bij een concentratie van 1: 10.000 in 5% melk in PBS of overnacht bij 4 ° C en gedurende 4 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Voer 3 wasbeurten fof 5 min elk in PBS met 0,1% Tween-20 detergent.
- Incubeer het membraan in een muis mierikswortel peroxidase bij een concentratie van 1: 10.000 in 5% melk in PBS gedurende ten minste 2 uur.
- Voer 3 wassingen gedurende 5 minuten elk in PBS met 0,1% Tween-20 detergent.
- Voer 1 wassen gedurende 5 min in PBS.
- Incubeer het membraan in een chemiluminescente detectie reagens voor 10 min en gedetecteerd met een chemiluminescente detectie. Gebruik de automatische belichting instellen op de detector.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gekweekte M17 en HeLa-cellen werden geoogst met behulp van de methode beschreven in het protocol (3 Cell Oogst) en de muis ruggenmerg weefsel werd verkregen. De celpellet / ruggenmerg werd in een buis met lysis buffer in het reagens bereiding beschreven. Celpellets werden gelyseerd middels glasparels (figuur 1A) en muis ruggenmerg weefselmonsters werden gehomogeniseerd met de homogenisator (Figuur 1B). Na lysis of homogeniseren werd het monster gecentrifugeerd bij 5030 xg om de glasparels en / of de onderbroken membranen en organellen (figuur 2) te verwijderen. Beide methoden zijn mechanische middelen lysis enzymatische activiteit behouden. De eiwitconcentratie van de cellen werd vervolgens bepaald met behulp van de BCA methode. 20 ug totaal eiwit werd geïncubeerd met 2 pi van 1,35 pM probe gedurende 1 uur bij 37 ° C (figuur 3). De monsters werden vervolgens geïncubeerd in 4 x Laemmlimonsterbuffer bij 95 ° C om de reactie te blussen. De bereide monsters werden op een 4-20% Tris-glycine-gel geladen en uitgevoerd bij 95 V tot de voorste ion bereikt de bodem. De eiwitten werden gedurende de nacht overgebracht op een PVDF-membraan. De eiwitbelading werd gecontroleerd met de amido zwarte vlek (Figuur 4). Deze besturing maatregel wordt bereikt dat de verschillen in activiteit het gevolg zijn van feitelijke cellulaire processen en niet ongelijk eiwitbelading. Gelijke hoeveelheden eiwit werden in het eerste experiment (Figuur 4A). In het tweede experiment werden ongelijke hoeveelheden eiwit door de verwachte verschillen in de activiteitsprofielen van de verschillende cellijnen (figuur 4B) geplaatst. Dit werd gedaan om de detectie van het werkingsprofiel van de M17 cellysaten geïncubeerd met N-ethylmaleïmide (NEM), een cysteine-remmer en zou moeten leiden tot een verminderde signaal op de Western blot waarborgen. De membranen werden geïncubeerd in anti-HA primair antilichaam een muis horseradish peroxidase en vervolgens gedetecteerd met chemiluminescent imaging (Figuur 5). Succesvolle tagging van de nasynchroniseert met de probes resulteert in een profiel in elke baan van het membraan (Figuur 5A, C). De intensiteit van de banden bij verschillende molecuulgewichten overeenkomt met het activiteitsniveau van de DUB enzym. De verschillen in activiteit van verschillende nasynchroniseert tussen cellijnen duidelijk worden wanneer soortgelijke eiwitten zoals UCHL1 worden vergeleken in de HeLa-cellen en M17 (Figuur 5). De chemiluminescente visualisatie van de gel is essentieel omdat anders de amido black vlek, waarbij de hoeveelheid eiwit beladen toont, geeft dit de hoeveelheid actieve proteïne dat reageerde met de probes. Het lichtbeeld van molecuulgewichtstandaarden (figuur 5B) dient als leidraad voor identificeren van de verschillende dubs. De massa van de probe moet de grootte van het eiwit worden toegevoegd tijdens de analyse van de resultaten aan de DUB karakteriseren s in het juiste molecuulgewicht.
Figuur 1:. Lysis Werkwijzen voor cellen en weefsels Afbeelding van cellysis met behulp glasparels (A) versus polytron lysis in (B).
Figuur 2: Centrifugeren Producten cellen en weefsel cellysaat met de vaste glazen kralen en ongebroken membranen en organellen onderin na lysis en centrifugeren in (A).. Tissue lysaat tonen de onderbroken membranen en organellen onderin na homogenisatie en centrifugatie in (B).
700 "/>
Figuur 3:.. Mechanisme voor tagging van Dubs Een schematische weergave van de covalente binding tussen de actieve site cysteïnerest en de functionele groep van de HA-Ub-VS Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Amido zwarte vlekken van de membranen Membranen met de amidozwart kleuring uitgevoerd op lysaten geïncubeerd met N ethylmaleïmide (NEM), gelabeld met HA-Ub-vinylsulfon (VS) en draaien op een western blot.. De monsters zijn de volgende van links naar rechts - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) De heer Standards, M17 -. NEM, M17 + NEM Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Western blots resultaten Membranen die de activiteit van de verschillende nasynchroniseert zoals bepaald door probing voor anti-HA.. De monsters zijn de volgende van links naar rechts - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) De heer Standards; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aangezien ubiquitinatie is een fundamenteel celactiviteit begrijpen van de regelmechanismen kan de sleutel opgraven de processen van ziekte en pathologie. Het gebruik van HA tag Ub-afgeleide actieve gerichte sondes hier gemeld biedt een eenvoudige, maar zeer toepasbare methode voor het bestuderen van Ub-gemedieerde afbraak van eiwitten. Deze werkwijze is sneller en goedkoper dan het bestuderen elk van de dubs afzonderlijk.
In deze werkwijze, wordt de lyse van de cellen bereikt door mechanische middelen - gebruikt glasparels. Deze zachte methode van lysis behoudt een metabolische intracellulaire beeld. Echter, een belangrijk nadeel van deze lysis methode is de lage efficiëntie van ongeveer 60-70%. Dit betekent veel cellen moeten zorgen lysaten worden voldoende geconcentreerd om experimenten. T75 kolven met 80-90% confluent cellagen te gebruiken om een geconcentreerde lysaat te produceren. Bovendien is de trypsine stap van het experiment kritischomdat de meeste van de gehechte cellen in oplossing worden gesuspendeerd. Controleer de kolf onder een microscoop te zorgen dat een aanzienlijk deel van de cellen in kweek zweven alvorens naar de 50 ml buis. Het niet goed trypsinize hechtende cellen zal resulteren in een kleinere pellet en bij uitbreiding minder lysaat bij een lagere concentratie. Lysaten die niet in gebruik worden bewaard bij -80 ° C, overgebracht naar -20 ° C 24 uur voor gebruik ontdooid op ijs en de dag van gebruik. Hierdoor kan het lysaat gelijkmatig ontdooien en vermindert de schade aan de enzymen van het snel ontdooien.
Om deze methode weefsels ofwel een Dounce of een Polytron homogenisator kan worden gebruikt in plaats van de glasparels 11 toepassen. Het verkregen lysaat kan worden gelabeld met de probes direct of opgeslagen voor gebruik bij -80 ° C. Indien de polytron dounce of wordt gebruikt om het lysaat te verkrijgen dan glaskralen niet gebruiken. Dit leidt tot een vermindering van de totale eiwitconcentratie van het lysaat. EENlternatively, gebruikmakend van primaire celcultuurmethoden vaste weefselmonsters kunnen worden gekweekt en vervolgens gelyseerd met glasparels.
Een belangrijke beperking van deze werkwijze is dat, hoewel het de gebruiker toestaat om de activiteit van de enzymen te visualiseren, het geen nauwkeurige informatie geven over de expressiepatronen van de individuele dubs. Deze methode maakt gebruik van functionele homologie in de enzymen structurele homologie. Daarom zal verdere experimenten met de afzonderlijke antilichamen moeten gebeuren te leggen of de activiteitsinkrimping is een gevolg van defecten in de actieve plaats of een werkelijk verlies van het enzym. Bovendien wordt de lyse methode die in dit protocol niet openbreken de kernen van de cellen. Dubs in de kern verder kunnen cruciale informatie over de ziekte van processen.
Echter deze werkwijze is uniek in zijn vermogen om informatie die niet kan worden verkregen uit een andere bron te verschaffen. Zowel RNA methods en het gebruik van afzonderlijke antilichamen geen functionele informatie over enzymen. In de toekomst, bestaat de mogelijkheid dat de toepassing van deze methode voor immunohistochemische (IHC) kleuring. IHC niet alleen informatie over de activiteit van de enzymen geven, maar het zal ook inzicht in de locatie in weefsel waar de verschillende Kopieën actief. Bovendien kan deze methode worden gekoppeld aan een subcellulaire fractionering technieken zoals die beschreven door Colla et al. In 2012 om de activiteit van de nasynchroniseert in membraan gebonden organellen 12 bestuderen. Hoewel dit een relatief nieuwe techniek in de moleculaire biologie, is er een enorm potentieel om de toepassingen uit te breiden. Met actieve plaatsgerichte moleculaire probes kan de sleutel tot het ophelderen van de etiologie van vele ziekten houden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag de Lee lab van de Universiteit van Minnesota bedanken voor het verstrekken van de muis ruggenmerg weefselmonsters die werden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Defensie Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 naar MB, door de Randy Shaver Cancer Research Fund en Gemeenschap MB en door de Minnesota eierstokkanker Alliance (MOCA) naar MB. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
