Summary
El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.
Abstract
El sistema ubiquitina-proteasoma ha sido recientemente implicada en diversas patologías que incluyen enfermedades neurodegenerativas y cáncer. A la luz de esto, las técnicas para estudiar el mecanismo de regulación de este sistema son esenciales para elucidar los procesos celulares y moleculares de las enfermedades mencionadas anteriormente. El uso de hemaglutinina derivado sondas ubiquitina descritos en este documento sirve como una valiosa herramienta para el estudio de este sistema. Este documento detalla un método que permite al usuario realizar ensayos que dan una visualización directa de deubiquitinating actividad de la enzima. Enzimas deubiquitinating control de la degradación proteasomal y comparten homología funcional a sus sitios activos, que permite al usuario investigar la actividad de múltiples enzimas en un ensayo. Los lisados se obtienen a través suave ruptura celular mecánica y se incubaron con sitio activo sondas dirigidas. Enzimas funcionales etiquetados con las sondas mientras enzimas inactivas permanecen sin unir. Por plazoNing este ensayo, el usuario obtiene información tanto sobre la actividad y la expresión potencial de múltiples enzimas deubiquitinating de una manera rápida y fácil. El método actual es significativamente más eficiente que el uso de anticuerpos individuales para los predichos cien enzimas deubiquitinating en la célula humana.
Introduction
El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) sirve como una de las principales vías de degradación en la célula de mamífero. Sustratos con destino a la degradación en el proteasoma etiquetados de forma covalente con polímeros de ubiquitina (Ub) 1. Antes de que el sustrato elegido como diana entra en el proteasoma para la degradación, la etiqueta de poli-ubiquitina debe ser eliminado. Una clase de enzimas conocidas como deubiquitinating enzimas (DUBs) es responsable de la eliminación y el reciclaje de moléculas de ubiquitina 2. Se ha predicho desde el genoma humano que hay cerca de un centenar DUBs que trabajan en la celda 3. Con un gran número de DUBs que controlan los procesos celulares mediados por Ub tal, el estudio de estas enzimas presenta un desafío ya que las técnicas de ARNm no dan información sobre la actividad y el Western Blot sólo da información sobre los niveles de expresión.
El uso de la hemaglutinina de la gripe (HA) etiquetada, Ub derivada de sitio dirigido sondas activas permite un mod covalenteficación de los DUBs funcionales y por lo tanto da una visualización directa de la actividad de estas enzimas en un Western blot 4. Las sondas tienen un grupo reactivo tiol C-terminal que sirve como un sustrato suicida para la cisteína residuo sitio activo 5. Con estas sondas, es posible estudiar la actividad y la expresión potencial de muchos DUBs bajo las dos estados patológicos y fisiológicos de la célula.
Cambios en la actividad DUB han sido implicados en una amplia gama de condiciones patológicas tales como Parkinson, Alzheimer, anemia y diversos tipos de cáncer 6-10. Esta técnica proporciona una poderosa herramienta para el estudio de la enfermedad. En el presente trabajo, se muestra la aplicación de esta técnica en las células HeLa y M17 que han sido lisadas usando perlas de vidrio. Además, se describe cómo utilizar este método en muestras de tejido de la médula espinal de ratón. La información obtenida de esta técnica se puede utilizar como punto de partida para la identificación dedianas terapéuticas así como el establecimiento de modelos para el estudio de diferentes condiciones de la enfermedad. La verdadera utilidad de esta técnica radica en su capacidad para proporcionar información sobre múltiples DUBs en un único ensayo.
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Protocol
1. Lisis Preparación Buffer
- Disolver la sacarosa en agua desionizada (DI) agua para hacer una solución stock de 2 M. Filtrar una solución de sacarosa 2 M usando un vacío impulsado 0,22 micras de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de filtro.
- Disolver ditiotreitol (DTT) en agua DI para hacer una solución madre 500 mM y almacenar en condiciones anaeróbicas. Disolver el cloruro de magnesio (MgCl2) en agua DI para hacer una solución madre 100 mM. Disolver el trifosfato de adenosina (ATP) hidrato disódico en agua DI para hacer una solución madre 50 mM.
- Hacer una solución de Tris a pH 7,4 mediante la disolución de clorhidrato de Trizma en agua DI y ajustando el pH usando hidróxido de sodio (NaOH).
- Combinar porciones de las soluciones madre en agua DI para hacer un tampón de lisis con una concentración de sacarosa de 250 mM, una concentración de DTT de 1 mM, una concentración de MgCl 2 de 5 mM, una concentración de ATP de 1 mM y una concentración de Tris de 50 mM . Por ejemplo, mezclar 535,3 l de tris, 500 l de MgCl2, 1,25 ml de sacarosa, 20 l de la TDT, 200 l de ATP y 7,4947 ml de agua DI para hacer 10 ml de tampón de lisis. Esto se puede utilizar durante aproximadamente 20 experimentos.
2. Las células de cultivo para el Experimento
- Hacer alícuotas de los medios de comunicación por 30 ml de DMEM + 10% tubo cónico de suero bovino fetal (FBS) en un 50 ml.
- Traslado células M17 o HeLa congelados de almacenamiento de nitrógeno líquido a un vaso pequeño con agua tibia.
- Transferencia de las células para el tubo cónico de 50 ml. En primer lugar, añadir algunos medios de comunicación para el vial de células. A continuación, traslado a las células resuspendidas en 5 seg de descongelación.
- Centrifugar la suspensión celular a 450 xg durante 5 minutos para obtener un sedimento celular. Añadir 20 ml de medio en un matraz T75.
- Retire el papel de las células por medio de succión. Añadir 5 ml de medio fresco al sedimento celular y resuspender.
- Transferir la suspensión 5 ml de células a las 20 ml de medio en el matraz T75 y se incuba a 37 ° C. Change los medios de comunicación cada 3 días.
3. La recolección de la célula
- Retire los medios de comunicación a través de succión, con cuidado de no tocar las células.
- Lavar las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retire PBS utilizando succión.
- Añadir 3 ml de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al matraz T75 e incubar a 37 ° C durante 3 min.
- Añadir 6 ml de medio fresco al matraz y resuspender las células.
- Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 290 xg durante 5 minutos.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 5 ml de PBS. Golpee suavemente la parte inferior del tubo para romper la pastilla. Centrifugar a 290 xg durante 5 min.
- Repita el paso 3.6 de tres veces.
- Retirar PBS y resuspender las células en 1 ml de PBS fresco. Traslado al tubo Eppendorf (1,5 ml). Girar a 290 xg durante 5 min.
4. Lisis Celular
- Medir el volumen aproximado de la pastilla usando una pipeta unad pesar cuentas de vidrio en una masa: relación en volumen de 1: 1. Añadir dos veces el volumen del sedimento en tampón de lisis.
Nota: Añadir el búfer antes de añadir las perlas de vidrio. - Lisar las células en el tubo de Eppendorf a la máxima agitación durante 30 min a 4 ° C por agitación en una habitación fría.
- Brevemente Centrifugar a 200 xg durante 30 segundos para resolver las cuentas. Recoger el sobrenadante.
- Añadir el mismo volumen de perlas de vidrio como antes para el sobrenadante.
- Vortex una vez más a la máxima agitación durante 30 min a 4 ° C.
- Brevemente Centrifugar a 200 xg durante 30 segundos para resolver las perlas de vidrio. Recoger el sobrenadante.
- Centrifugar a 5030 xg durante 5 min para eliminar los núcleos, membranas y las células intactas. Recoger el sobrenadante, que es el lisado celular.
La homogeneización 5. Tejido
- Hacer una masa: volumen de 1: 9 solución de tejido de la médula espinal de ratón a tampón de lisis.
Nota: Este método es aplicable a una variedad de diferirmuestras de tejido ENT. - Homogeneizar el tejido usando un ajuste de nivel 2 en el homogeneizador durante 30 segundos para asegurar que no hay trozos restantes.
- Haga girar hacia abajo a 5030 xg durante 3 minutos para eliminar los núcleos, membranas y células intactas.
- Recoger el sobrenadante, que es el lisado.
La derivación 6. Muestra
- Realizar un ácido bicinconínico (BCA) en un análisis de placa de 96 pocillos para determinar la concentración de proteína del lisado de tejido usando un lector de placas de 96 pocillos colorimétrico según lo especificado por el protocolo del kit de ensayo de proteínas Pierce BCA.
- Llevar una alícuota correspondiente a 20 g de proteína total a 50 l usando (DI) de agua desionizada.
- Añadir 2 l de 1,35 M de HA-Ub-Vinil sulfona (VS) a la solución y se incuba durante 1 hora a 37 ° C. Esto da como resultado 20 g de lisado a 50 nM de sonda en la mezcla de reacción final. Esto está en gran exceso molar para asegurar el etiquetado de DUBs funcionales.
- YOncubate la muestra en tampón de muestra de Laemmli durante 5 minutos a 95 ° C. Para un 52 l reacción uso volumen 26 l de tampón de muestra 2x, 13 l de tampón de muestra 4x o 8,87 l de tampón de muestra 6x.
- Enfriar en hielo antes de cargar el gel.
7. Western Blot
- Cargar un 12 pocillos 4-20% de gel-tris glicina con 40 l de la muestra preparada
- Ejecute el gel a 95 V hasta que el frente de iones alcanza el fondo.
- Llevar a cabo una transferencia durante la noche del gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
- Incubar la membrana en la mancha negro amido y escanear el membane para obtener una imagen que muestra la cantidad de proteína en cada carril.
- Destain la membrana y se incuban en 5% de leche en PBS durante 1 hr a bloquear.
- Incubar la membrana en el anticuerpo primario anti-HA a una concentración de 1: 10.000 en leche 5% en PBS, ya sea durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente.
- Realizar 3 lavados fo 5 min cada uno en PBS con 0,1% de Tween-20 detergente.
- Incubar la membrana en un ratón peroxidasa de rábano picante a una concentración de 1: 10.000 en leche 5% en PBS durante al menos 2 hr.
- Realizar 3 lavados de 5 minutos cada uno en PBS con 0,1% de Tween-20 detergente.
- Realizar 1 lavado durante 5 min en PBS.
- Incubar la membrana en un reactivo de detección quimioluminiscente durante 10 min y detectar usando un detector quimioluminiscente. Utilice el ajuste en el detector automático de exposición.
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Representative Results
Células M17 y HeLa cultivadas se recogieron usando el método detallado en la (recolección de células 3.) protocolo y el tejido médula espinal de ratón se obtuvo. El / tejido de la médula espinal sedimento de células se colocó en un tubo con el tampón de lisis descrito en la sección de preparación de reactivos. Los sedimentos celulares se lisaron usando perlas de vidrio (Figura 1A) y muestras de tejido de médula espinal de ratón se homogeneizó usando el homogeneizador (Figura 1B). Después de la lisis u homogeneización, la muestra se centrifugó a continuación, 5030 xg para eliminar las perlas de vidrio y / o las membranas y orgánulos intactos (Figura 2). Ambos de estos métodos son medios mecánicos de lisis para preservar la actividad enzimática. La concentración de proteína de las células se determinó a continuación, utilizando el método BCA. 20 g de proteína total se incubó con 2 l de sonda de 1,35 M durante 1 hora a 37 ° C (Figura 3). Las muestras se incubaron a continuación en Laemmli 4x detampón de muestra a 95 ° C para inactivar la reacción. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de tris-glicina al 4-20% y funcionan a 95 V hasta que el frente de iones alcanzó la parte inferior. Las proteínas se transfirieron durante la noche a una membrana de PVDF. La carga de proteínas se comprobó mediante la mancha negro amido (Figura 4). Esta etapa de control garantiza que las diferencias en la actividad se deben a procesos celulares reales y no desigual carga de proteína. Cantidades iguales de proteína se utilizaron en el primer experimento (Figura 4A). En el segundo experimento, las cantidades de proteína se cargaron desiguales debido a las diferencias esperadas en los perfiles de actividad de las diferentes líneas celulares (Figura 4B). Esto se hizo para asegurar la detección de un perfil de actividad de los lisados celulares M17 incubadas con N -ethylmaleimide (NEM), que es un inhibidor de la cisteína y debería conducir a una señal reducida en el western blot. Las membranas se incubaron en anticuerpo anti-HA primaria, un ratón hperoxidasa orseradish y luego detectado usando imágenes quimioluminiscente (Figura 5). Etiquetado con éxito los DUBs utilizando las sondas resultados en un perfil en cada carril de la membrana (Figura 5A, C). La intensidad de las bandas en diferentes pesos moleculares corresponde al nivel de actividad de la enzima DUB. Las diferencias en los niveles de actividad de varias DUBs a través de las líneas celulares se hacen evidentes cuando las proteínas similares tales como UCHL1 se comparan en las células HeLa y M17 (Figura 5). La visualización quimioluminiscente del gel es crítico porque a diferencia de la mancha negro amido, que muestra la cantidad de proteína cargada, esta muestra la cantidad de proteína activa que ha reaccionado con las sondas. La imagen de la luz de los estándares de peso molecular (Figura 5B) sirve como guía para la identificación de los distintos DUBs. Necesita La masa de la sonda que se añade al tamaño de la proteína durante el análisis de los resultados para caracterizar el DUB s en los pesos moleculares correctos.
Figura 1:. Métodos de lisis de las células y tejidos Imagen que muestra la lisis celular usando perlas de vidrio en (A) frente a la lisis politrón en (B).
Figura 2: Productos de centrifugación de las células y tejidos lisado celular, mostrando las perlas de vidrio y asentadas membranas intactas y orgánulos en la parte inferior después de la lisis y centrifugación en (A).. Lisado de tejido mostrando las membranas intactas y orgánulos en la parte inferior después de la homogeneización y centrifugación en (B).
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Figura 3:.. Mecanismo para el etiquetado de DUBs Un esquema que muestra la unión covalente entre el activo residuo de cisteína del sitio y el grupo funcional de la HA-Ub-VS Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: amido manchas negras de las membranas Las membranas que muestran la tinción con negro amido hecho en lisados se incubaron con N -ethylmaleimide (NEM), etiquetados con HA-Ub-vinilsulfona (VS) y se ejecutan en un western blot.. Las muestras son como sigue de izquierda a derecha - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) El Sr. Normas, M17 -. NEM, M17 + NEM favor Click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Western blots resultados membranas que muestran los niveles de actividad de los diversos DUBs como se determina mediante el sondeo para Anti-HA.. Las muestras son como sigue de izquierda a derecha - (A) HeLa - NEM, HeLa + NEM; (B) Normas Mr; (C) M17 -. NEM, M17 + NEM Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Desde ubiquitinación es una actividad celular fundamental, la comprensión de los mecanismos de regulación podría ser la clave para sacar a la luz los procesos de la enfermedad y la patología. El uso de HA etiquetada sitio dirigido sondas activas derivadas de Ub aquí presentados proporcionan un método sencillo, pero muy aplicable para el estudio de la degradación de proteínas mediada por Ub. Este método es más rápido y menos costoso que el estudio de cada uno de los DUBs individualmente.
En este método, la lisis de las células se logra a través de medios mecánicos - el uso de las perlas de vidrio. Este método suave de lisis conserva una imagen intracelular metabólico. Sin embargo, un importante inconveniente de este método de lisis es su baja eficiencia de alrededor del 60-70%. Esto significa se requiere una gran cantidad de células para asegurar lisados se concentran lo suficiente para los experimentos. Matraces T75 con 80 - 90% capas de células confluentes se deben utilizar para producir un lisado concentrado. Además, la etapa de tripsinización del experimento es críticoporque la mayoría de las células unidas deben ser suspendidos en solución. Compruebe el matraz bajo un microscopio para asegurarse de que una porción significativa de las células en cultivo están flotando antes de transferir al tubo de 50 ml. Si no se trypsinize correctamente células adherentes se traducirá en un gránulo más pequeño y, por extensión, menos lisado a una concentración inferior. Los lisados que no están en uso deben almacenarse a -80 ° C, se transfirió a -20 ° C 24 hr antes de su uso y se descongelaron en hielo el día de uso. Esto permite que el lisado se descongele de manera uniforme y reduce el daño a las enzimas de descongelación rápida.
Para aplicar este método a los tejidos ya sea un Dounce o homogeneizador Polytron se pueden utilizar en lugar de las perlas de vidrio 11. El lisado obtenido puede ser etiquetado con las sondas de inmediato o almacenarse para su uso a -80 ° C. Si el Dounce o Polytron se utiliza para obtener el lisado a continuación, no se deben utilizar cuentas de vidrio. Esto conduce a una reducción en la concentración total de proteína del lisado. LAlternatively, utilizando métodos de cultivo de células primarias las muestras de tejido sólidas podría ser cultivaron primero y luego se lisaron con las perlas de vidrio.
Una limitación importante de este método es que a pesar de que permite al usuario visualizar la actividad de las enzimas, no da información precisa sobre los patrones de expresión de los DUBs individuales. Este método utiliza una homología funcional en las enzimas no homología estructural. Por lo tanto, otros experimentos con los anticuerpos individuales que tendrán que ser hecho para explicar si la reducción de la actividad es el resultado de defectos en el sitio activo o una pérdida real de la enzima. Además, el método de lisis utilizado en este protocolo no se rompe abierto los núcleos de las células. DUBs en el núcleo podrían proporcionar información más crítica sobre los procesos de enfermedad.
Sin embargo este método es único en su capacidad de proporcionar información que no puede obtenerse a partir de cualquier otra fuente. Ambos ARN methods y el uso de anticuerpos individuales no proporcionan información funcional acerca de enzimas. En el futuro, existe la posibilidad de la aplicación de este método para inmunohistoquímica (IHC) tinción. Tinción IHC no sólo dará información sobre la actividad de las enzimas, sino que también proporciona una visión de la ubicación en el tejido donde las diversas DUBs están activos. Además, este método podría ser acoplado con una técnica de fraccionamiento subcelular como el que se detalla por Colla et al. En 2012 para estudiar la actividad de los DUBs en la membrana orgánulos unidos 12. Aunque se trata de una técnica relativamente nueva en la biología molecular, hay un enorme potencial para ampliar las aplicaciones. El uso del sitio dirigido sondas moleculares activos podría ser la clave para esclarecer la etiología de muchas enfermedades.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al laboratorio de Lee, de la Universidad de Minnesota para proporcionar las muestras de tejido de la médula espinal de ratones que fueron utilizados. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Programa de Defensa de ovario de Investigaciones Oncológicas (OCRP) OC093424 a MB, por el Fondo de Investigación del Cáncer y la Comunidad Randy máquina de afeitar de MB y por el cáncer ovárico de Alianza Minnesota (MOCA) a MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar o preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
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