Karakterisering af tymisk Bundfældning Progenitorer i Mouse Embryo Brug<em> In vivo</em> Og<em> In vitro</em> Analyser
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Karakterisering thymiske afregning stamfædre er vigtigt at forstå de præ-thymus stadier af T-celle udvikling, vigtigt at udtænke strategier for T-celle udskiftning i lymphopenic patienter. Vi studerede thymiske afregning progenitorer fra murin embryonisk dag 13 og 18 Thymi af to komplementære in vitro og in vivo teknikker, begge baseret på den "hængende dråbe" metoden. Denne metode tillod kolonisere bestrålede føtale thymiske lapper med E13 og / eller E18 thymiske progenitorer udmærker sig ved CD45 allotypiske markører og dermed efter deres afkom. Kolonisering med blandede populationer tillader analysere celle autonome forskelle i biologiske egenskaber af stamceller mens kolonisering med enten befolkning fjerner eventuelle konkurrencemæssige selektive pres. De koloniserede thymus lapper kan også blive indpodet immundefekte mandlige recipientmus tillader analyse af T afkom den modne celle in vivo, såsom populationsdynamik af than perifere immunsystem og kolonisering af forskellige væv og organer. Føtale thymus organkulturer afslørede, at E13 progenitorer udviklede sig hurtigt til alle modne CD3 + celler og gav anledning til den kanoniske γδ T-celle delmængde, kendt som dendritiske epiteliale T-celler. Til sammenligning E18 progenitorer har en forsinket differentiering og var ude af stand til at generere dendritiske epitel-T-celler. Overvågningen af perifert blod fra thymus-transplanterede CD3 – / – mus viste desuden, at E18 thymiske bundfældning progenitorer generere med tiden større antal modne T-celler end deres modstykker E13, en funktion, der ikke kunne forstås på kort sigt føtal thymus organkulturer.
Introduction
T-lymfocytter, der bærer αβ eller γδ T-celle receptor (TCR), differentiere i et specialiseret organ, thymus. Det fuldt udviklede thymus er organiseret i to adskilte regioner: cortex, hvor thymus stamfædre udvikler, og hvor thymocytter der produktivt omarrangere TCR β og α-kæde gener er reddet fra programmeret død (en proces kendt som positiv selektion); og medulla, hvor udvalgte thymocytter med for stærk reaktivitet til selv-ligander slettes (negativ selektion) 1,2. Thymus stammer fra endodermal lag af den tredje svælg pose, der er senere omgivet af mesenkymale celler 3. Det er koloniseret af hæmatopoietiske progenitorer starter ved fosterdag E12 og kontinuerlig rekruttering kræves derefter for normal T-celle udvikling 4. Thymus indvandrere udvikle sig gennem successive udviklingsstadier, orkestreret af en tæt reguleret program, iværksættes og maintained af aktiveringen af Notch signalvejen på thymocytter ved interaktion med dets ligand, delta like 4, udtrykt på thymiske epitelceller (TECs) 5.
Thymocyt udvikling starter ved den såkaldte CD4 – CD8 – dobbelt negative (DN) etaper. DN thymocytter kan yderligere opdeles i overensstemmelse med ekspression af CD25 og CD44 i DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) og DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) og CD117 (c-Kit) yderligere opdeler DN1 rum i 5 undergrupper, hvor DN1a b svarer til tidlige thymiske progenitorer (ETP). Thymocytter omarrangere TCR δ, β og α-kæder på DN scenen og gennemgå pre-TcR udvælgelse (DN3-DN4 stadier). De har endvidere transit til CD4 + CD8 + dobbelt positive (DP) rum, hvor TcR α-kæden omarrangerer forud for positive og negative selektion. På dette stadium fleste thymocyter elimineres og kun en lille procentdel (3-5%) nå CD4 + eller CD8 + modne T-celle rum.
Den lymfoide differentieringsvej skrider gennem stadier af HSC'er der genererer multipotente progenitorer (MPP) og lymfoide-primet multipotente progenitorer (LMPP), der mistet erythrocyt og megakaryocyt potentiale 6. LMPP er fænotypisk defineret ved fravær af differentierede blodlegemer markører (afstamning negativ, Lin -), ekspressionen af c-kit (CD117), Sca-1 og Flt3 / flk2 (CD135) og fraværet af påviselige niveauer af interleukin ( IL) -7 receptor α-kæde (IL-7rα eller CD127). LMPPs yderligere differentiere til fælles lymfoide progenitorer (CLP) 7, at ved denne fase har mistet evnen til at generere myeloide celler. CLP bevarer lymfocyt (B- og T-celle), NK-celle, DC og medfødte lymfecelle (ILC) potentiale, og adskiller sig fra LMPP ved ekspression af CD127 og fraværet af høje niveauer af Sca-1.
Selv om arten af de thymiske afregning progenitorer (TSP) er blevet grundigt drøftet 8, blev det for nylig klart, at TSP ændring fænotype, differentiering potentiale og funktion i hele udvikling 9. Udførte vi in vitro og in vivo assays til at karakterisere TSP, isoleret ved FACS cellesortering fra enten E13 (første bølge) eller E18 (anden bølge). Føtale thymus organkulturer (FTOC) med bestrålede thymiske lapper koloniseret af lige mange E13 og E18 stamfædre, der bærer forskellige allotypiske markører, tilladt efter deres afkom i en lignende udviklingsmæssig miljø og afslørede celle iboende egenskaber, forskellige mellem de to typer af stamceller. Thymus lapper koloniseret af enten E13 eller E18 TSP tilladt udvikling uden selektion på grund af konkurrencen mellem de to stamfædre. In vivo transplantation af de koloniserede thymus lapper viste desuden, at også than modne afkom af E13 og E18 TSP har forskellige biologiske egenskaber in vivo. Tsps fra den første bølge hurtigt generere T-celler, men giver anledning til et lavt antal αβ og γδ T-celler. Blandt de sidstnævnte, vi har registreret Vγ5Vδ1 dendritiske epiteliale T-celler (DETC), der har en invariant TcR, migrere til overhuden, hvor de udøver en funktion i sårheling og er kun produceret i fosterudviklingen 10. I modsætning hertil TSP fra den anden bølge tage længere tid at generere høje antal af TcR + T-celler og er ude af stand til at generere DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
To vigtige assays kan anvendes til at analysere T-celle differentiering ex vivo. Den mest nylig rapporteret er co-dyrkning af hæmatopoietiske progenitorer med BM stromaceller, OP9, der udtrykker ligander af Noth1, delta som 1 eller 4 12. Denne 2-D-assayet er let at udføre, meget effektiv og følsom, hvilket tillader analyse på enkelt celle niveau. Det hverken understøtter dog T celle udvikling ud over det stadium af DP eller frembringelsen af γδ DETC 13, som begge kræver direkte int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet af Pasteur Instituttet, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'lymfopoiese «), den REVIVE Future Investment Program og" La Ligue contre le Cancer ".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
