Abstract
אפיון אבות הרתי יישוב חשוב להבין השלבים טרום-הרתי של פיתוח תאי T, חיוני לתכנן אסטרטגיות להחלפת תאי T בחולי lymphopenic. למדנו הרתי יישוב אבות מיום עכברי עוברי 13 ו -18 thymi ידי שני משלימים במבחנה ובטכניקות vivo, שני מבוססים על השיטה "טיפה תלויה". שיטה זו אפשרה התיישבות אונות הרתי עובריות מוקרנת עם E13 ו / או E18 אבות הרתי המאופיין בסמני CD45 allotypic וכך הבאים צאצאיהם. התיישבות עם אוכלוסיות מעורבות מאפשרת ניתוח הבדלים אוטונומיים תא בנכסים ביולוגיים של האבות בעוד התישבות גם עם אוכלוסייה מסירה לחצים סלקטיביים תחרותיים אפשריים. יכולות גם להיות מורכבים אונות הרתי יישבו בעכברי immunodeficient זכר נמען מאפשרים הניתוח של צאצאי תא T הבוגרים in vivo, כגון דינמיקת אוכלוסייה של tהוא היקפי מערכת וקולוניזציה של רקמות ואיברים שונים חיסוניות. תרבויות איבר הרתי עוברית גילו כי אבות E13 התפתחו במהירות לכל בוגרים CD3 + תאים והולידו את קבוצת המשנה של תאי T γδ הקנונים, המכונה תאי T אפיתל הדנדריטים. לשם השוואה, יש לי אבות E18 בידול מושהה ולא הצליחו לייצר תאי T אפיתל הדנדריטים. הניטור של דם ההיקפי של CD3-מורכבים התימוס - / - עכברים הראה עוד, כי אבות הרתי E18 יישוב ליצור, עם זמן, מספר גדול יותר של תאים הבוגרים T מאשר עמיתיהם E13, תכונה שלא ניתן הייתה להערכה בהרתי העוברי לטווח הקצר תרבויות איברים.
Introduction
לימפוציטים מסוג T, הנושא את αβ או γδ קולט תא T (TCR), להבדיל באיבר מיוחד, התימוס. התימוס מפותח מאורגן בשני אזורים נפרדים: הקליפה, שבו אבות הרתי לפתח ובי thymocytes שפרודוקטיבית לסדר מחדש את β TCR וגני שרשרת α הם הצילו ממוות מתוכנת (תהליך המכונה סלקציה חיובית); והלשד, שבו נבחר thymocytes עם תגובתיות חזקה מדי לligands העצמי נמחקים (סלקציה שלילית) 1,2. התימוס מקור שכבת endodermal של כיס בלוע השלישי שהוא מוקף מאוחר יותר על ידי תאי mesenchymal 3. הוא יישב על ידי אבות hematopoietic מתחילים ביום עוברי E12 ו, לאחר מכן, גיוס רציף נדרש לפיתוח תא T הרגיל 4. עולים הרתי להתפתח דרך שלבי התפתחות רצופים, בניצוחו של תכנית בחוזקה מוסדרת, יזם ומאיntained על ידי ההפעלה של מסלול האיתות של Notch על thymocytes על אינטראקציה עם ליגנד, דלתא כמו 4, הביע בתאי אפיתל הרתי (Tecs) 5.
פיתוח Thymocyte מתחיל בCD4 שנקרא - CD8 - שלילי כפול שלבים (DN). thymocytes DN ניתן מחולק חלוקה נוסף על פי הביטוי של CD25 וCD44 לDN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) וDN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) וCD117 (c-kit) subdivides נוסף תא DN1 ל -5 תת בי DN1a וב מתאים לאבות המוקדמים הרתי (ETP). Thymocytes לסדר מחדש את רשתות δ, β α וTCR בשלב DN ולעבור בחירה מראש TCR (שלבי DN3-DN4). הם עוד מעבר לCD4 + CD8 + התא החיובי כפול (DP) שבו שרשרת α TCR מארגנת מחדש לפני Sele גודל חיובי והשליליסיפורת. בשלב זה רוב thymocytes בוטלו ורק אחוז קטן (3-5%) להגיע + CD4 או CD8 + T תא בוגר תא.
מסלול בידול הלימפה מתקדם בשלבים של HSCs שיוצרים אבות multipotent (MPP) ואבות-דרוך הלימפה multipotent (LMPP) שאיבדו כדורית אדומה וmegakaryocyte פוטנציאל 6. LMPP מוגדר phenotypically בהעדר סמנים של תאי דם מובחנים (שושלת שלילית, לין -), הביטוי של c-kit (CD117), SCA-1 וFLT3 / Flk2 (CD135) והעדר הרמות לזיהוי של אינטרלוקין ( IL) -7 קולט α שרשרת (IL-7rα או CD127). LMPPs נוסף להבדיל לאבות משותפים הלימפה (CLP) 7 כי על ידי השלב שאיבדו את היכולת לייצר תאי מיאלואידית. CLP לשמור הלימפוציטים (B ותאי T), תא NK, DC ותא הלימפה המולדת פוטנציאלי (ILC), ושונה מLMPP על ידי הביטוי של CD127 והעדר הרמות גבוהות של SCA-1.
למרות שהטבע של אבות הרתי יישוב (TSP) כבר התווכח 8 בהרחבה, זה הפך לאחרונה ברור ששינוי TSP פנוטיפ, פוטנציאל התמיינות ותפקוד, בכל פיתוח 9. ביצענו במבחנה ובמבחני vivo לאפיין את כפית, מבודדת על ידי תא FACS מיון משני E13 (הגל הראשון) או E18 (גל שני). תרבויות עוברית הרתי איבר (FTOC) עם אונות הרתי מוקרנת יישבו על ידי מספר שווה של אבות E13 וE18, הנושאים סמני allotypic שונים, אפשרו הבא צאצאיהם בסביבת התפתחותית דומה וגילו מאפיינים פנימיים תא, שונים בין שני הסוגים של אבות. אונות הרתי יישבו גם על ידי E13 או E18 TSP אפשרו פיתוח ללא בחירה בשל תחרות בין שני האבות. השתלת vivo של האונות הרתי מתנחלות, הראתה עוד, כי גם לאיש לו צאצאים בוגרים של E13 וE18 TSP מאפיינים ביולוגיים שונים בגוף חי. TSPs מהגל הראשון במהירות לייצר תאי T אבל להצמיח מספרים נמוכים של αβ וγδ תאי T. בקרב האחרון זיהינו תאים דנדריטים Vγ5Vδ1 אפיתל T (DETC), שיש לי TCR משתנה, להגר לעור שבו הם מפעילים פונקציה בריפוי פצעים ומיוצרים רק במהלך התפתחות עוברית 10. לעומת זאת, כפית מהגל השני תיקח זמן רב יותר כדי ליצור מספרים גבוהים של תאי TCR + T ולא מצליחה ליצור DETC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל הניסויים בוצעו על פי המכון פסטר אתיקת האמנה, שאושרה על ידי משרד החקלאות הצרפתי, ולהנחיות של האיחוד האירופי. מניפולטור עם הכשרה בניתוח מכרסם קטן, מאושר על ידי משרד החקלאות הצרפתי, מבצע את כל ההתערבות כירורגית.
הערה: ראה בטבלה נספח 1 המציגה את הליך תכנית 5 שלבים.
1. בחירה של העוברים
- השתמש 36 נקבות / 6 CD45.2 C57BL, CD45.1 נקבות 12, 12 C57BL / 6 זכרים CD45.1 ו -12 C57BL / 6 זכרים CD45.2. חוצה את הנקבות עם או גנוטיפ הזכר לייצר עוברי CD45.1 / 2 וCD45.1 משמשים כמקור לכפית או CD45.2 משמש כמקור לאונות הרתי נמען. בית כל הגברים בנפרד.
- כדי להשיג עובר לבידוד E18 TSP, מקום 2 נקבות בכלוב עם CD45.1 אחד גברים בשעה 6, 21 ימים לפני ניסוי ההשתלה. בדוק את הנוכחות של תוסף נרתיק למחרת, לפני הצהריים. SEPAלדרג את הנקבות מחוברות.
- כדי להשיג עוברי E14 שהתיישב בו כפית, לחזור על התהליך לעיל (1.2), באמצעות CD45.2 גברים, 17 ימים לפני ניסוי ההשתלה.
- כדי להשיג עוברים לבודד E13 TSP, לחזור על התהליך לעיל (1.2), תוך שימוש בזכרים C57BL / 6 CD45.1, 16 ימים לפני ניסוי ההשתלה.
2. Dissection של העוברים תחת אופקי זרימה למינרית הוד
הערה: יומיים לפני ניסוי ההשתלה.
- להקריב את הנשים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם או על ידי ממשל מתקדם של גז CO 2 בלפחות 5 דקות, בתא סגור להרוות. ודא מוות על ידי מעצר מוחלט של תנועות אירובית-נשימתי. להרטיב את הבטן עם אתנול 70%.
- לעשות חתך אורכי בעור בבטן קו האמצע ולפתוח אותו על ידי משיכת העור לגזרים. פתח את הצפק עם מלקחיים ומספריים בלי לגעת במערכת העיכול. משוך את uter bifidשלנו ולהפריד אותו מהנרתיק עם המספריים.
- מניחים את הרחם ב90 x 15 מ"מ צלחת פטרי המכילה 40-50 מיליליטר DPBS ולחתוך transversally בין decidua של כל עובר.
- עם זוג מספריים טיפ נאה ומלקחיים בסדר להסיר את קרום שריר הרחם, להוציא את העוברים על ידי חיתוך בין השליה וצק החלמון, ולהסיר את amnios, ששמירה על העוברים.
- מניחים את העוברים בצלחת פטרי 90 x 15 מ"מ המכיל HBSS + 1% בסרום עגל עוברי (FCS). לעוברים מבוגרים מE15, להסיר את הראשים עם זוג המספריים לפני כל נתיחה נוספת.
3. בידוד של קורנית
- תחת זכוכית המגדלת המשקפת, למקם את העובר, שוכב במצב שכיבה (צפה בגחון), על מצע גזה רטוב.
- הכנס אחד מלקחיים longitudinally לאורך הסחוס של עצם החזה, לצבוט ולפתוח את רשת בית החזה. עם מלקחיים מעוקלים, למשוך את קיר בית החזה בצד כדי להמחיש את tאונות hymic בכל צד של קנה הנשימה.
- להחזיק בזהירות כל אונה ידי צובט מתחת עם מלקחיים עדינים ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה FCS 1 מיליליטר HBSS + 1%. לבודד את האונות ולהסיר רקמת חיבור המקיפה עם שני מזרקים 1 מיליליטר + 26 G ⅜ "מחטים, מבלי לפגוע בכמוסה.
- שטוף את האונות ב 3 מיליליטר של FCS + 1% HBSS לחסל תאי דם.
הערה: לפני E15, אונות הרתי נמצאות בכל צד של קנה הנשימה והנתיך מאוחר יותר באמצע להוות איבר דו-אוֹנִי.
4. השעיות תא
- להפריד אונות תחת זכוכית המגדלת המשקפת, עם שתי 26 מחטי G רכובים על 1 מיליליטר מזרקים, בFCS + 1% HBSS. סנן את ההשעיה התא דרך רשת ניילון.
מכתים 5. עם נוגדנים ניאון ומיון תא
הערה: כל הנוגדנים טיטרציה בעבר להשיג הגדרה אופטימלית של האוכלוסיות (titratיון יכול להשתנות עם אצווה הנוגדן).
- דגירה thymocytes (E13 או E18) במשך 15-30 דקות ב 4 ° C עם של קוקטייל של נוגדני biotinylated להכתים תאים חיוביים שושלת 100 μl (אנטי-CD19, אנטי-Gr1, אנטי-Ter119, אנטי-NK1.1 , CD11c אנטי, אנטי-CD3, אנטי CD4, CD8 אנטי, אנטי CD25).
- לשטוף את העודף של נוגדני ספין למטה הצינורות עם FCS 4 מיליליטר HBSS + 1% ב 280 XG במשך 7 דקות, לחסל את supernatant והגלול בFCS + 1% הטריים HBSS מתלים-מחדש. חזור על צנטריפוגה.
- דגירה תאי שכותרתו ביוטין E18 עם microbeads streptavidin במהלך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשטוף את התאים פעמיים בFCS 1% HBSS. להשעות מחדש את התאים 2 מיליליטר HBSS + 1% FCS. רוב thymocytes E13 הוא שושלת שלילית ולכן לא צריך העשרת MACS לפני מיון תא.
- להעביר את התאים בעמודה LS, על פי הוראות היצרן. כאשר כל ההשעיה התא נכנסה לטור להוסיף FCS + 1% 2 מיליליטר HBSS. להתאושש4 מיליליטר של הטור לזרום דרך צנטריפוגות התאים ל7 דקות ב 280 x גרם.
- מחדש להשעות את גלולה של שני E18 המדולדל או thymocytes E13 כולל בμl 50 של תערובת נוגדני TSP (אנטי-CD117 APC, אנטי-CD135 PE, אנטי-CD127 PECy7, אנטי CD24 FITC, אנטי CD44 APCCy7 ואוקיינוס השקט הכחול streptavidin ) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף את התאים עם 4 מיליליטר HBSS + 1 FCS% ומחדש להשעות את התאים 1 מיליליטר HBSS FCS 1% + עם יודיד propidium.
- מיין לין TSPs - CD127 הנמוך CD44 + CD117 + CD24 + CD135 + תאים בFACS (עם 4 לייזרים) על 1.5 מיליליטר צינורות המכילים 200 μl FCS + 20% בינוניים מלא. השער ראשון התאים בהתאם לגודלם והגרעיניות בFSC וערוצי SSC. לחסל את התאים מתים (צביעה עם יודיד propidium), שער החוצה כפילויות ולהבקיע את הקרינה בקשקשי מעריכי. ניתן להשיג בסביבות 100 או 600 TSPs מE13 אחד או אחת התימוס E18, respectivאיליי.
6. הרתי אונות עם אבות ההתיישבות של E14: טכניקת גלילת תליה
- להקרין (30 אפורים = 30 Gy) אונות הרתי E14 מעוברי CD45.2, 3 שעות לפני התרבות.
הערה: אונות הרתי E14 או E15 שימשו בהצלחה כנמען של אבות תא T. שימוש באונות הרתי נמען של תוצאות ימי הריון מאוחר יותר בנימק מוקדם בשל הגודל גדול יותר של האיבר תוך אונות הרתי בימי הריון מוקדם יותר לפתח גרועה, ככל הנראה בשל פיתוח שלם של תאי האפיתל. - צנטריפוגה מסודרים TSPs מחדש להשעות את התאים במדיום התרבות (בינוני מלא OPTI-ממ עם FCS 10%, פניצילין (50 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ו2β-mercaptoethanol (50 מיקרומטר)) באופן ש-35 μl מכיל 500 TSP.
- מניחים ירידת 35 μl של השעיה תא כל גם אחרים של צלחת גם Terasaki 60.
הערה: 35 טיפות μl יכולות לאחות אם הם ממוקמים בבארות רציפות. - הנח אונה אחת מוקרנת על פני השטח של כל טיפה. סגור את צלחת Terasaki ולהפוך את הצלחת הפוכה לתת התאים להגיע לקוטב הפסגה של הירידה על ידי כוח הכבידה.
- הכה בעדינות בצד העליון של הצלחת ההפוכה כדי לאלץ את האונות להחליק לקצה הקודקוד של הירידה. דגירה את צלחת Terasaki ההפוכה בחממה humidified במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2. לאחר ההתיישבות, או תרבות thymi E14 ב -7 FTOC, או שתל תחת הקפסולה הכליות של עכבר בוגר נמען 8.
7. עוברי הרתי איברים תרבות
- מניחים 3 מיליליטר של מדיום שלם בצלחת פטרי 35 מ"מ. מניחים מסנן קרום isopore צף על המדיום. מניחים את האונות מחדש על הקצה של הקרום עם מלקחיים (לא יותר מ -8 אונות על קרום אחד).
- מניחים את צלחות פטרי המכילות את האונות הרתי בתוך צלחת פטרי 90 מ"מ, יחד עם מנה 35 מ"מ, ללא כיסוי, המכיל 2 מיליליטר של water, כדי להבטיח לחות אופטימלית. דגירה 12 ימים ב 37 ° C + 5% CO 2.
8. שתלי תחת הקפסולה הכליות בתנאים סטריליים
הערה: parenchyma הכליות מוקף רקמת חיבור יוצרת כמוסה. האזור תת-קופסית הוא עשיר במיוחד בדם וכלי הלימפה ובכך לספק סביבה מתאימה לפיתוח שתלים (למשל אונות הרתי, איי לבלב או לבבות שזה עתה נולד). שתלי נעשים בדרך כלל על הכליה השמאלית משום שהוא נגיש יותר מהכליה הימנית. CD3 - / - עכברי זכרים שמשו כמקבלים וכך למנוע שתל לעומת תגובת מארח בשל אנטיגנים histocompatibility קטין הצמודים לכרומוזום Y, כי קביעת מין לפני E15 היא לא לעשות בקלות.
- לעקר את המכשירים וללבוש כפפות סטריליות לאורך הניתוח. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של פתרון של קטמין 10 מ"ג / מיליליטר + 1 מ"ג Xylazine /מיליליטר מדולל PBS: (50 עד 100 μl לכל 10 גרם משקל גוף), תוך שימוש במזרק 1 מיליליטר. ודא הרדמה על ידי בדיקת חוסר רפלקסים interdigital. מניחים ירידה של ג'ל הידרו-Optimune על כל עין כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
הערה: הפתרון צריך להיות מוכן מראש, חימם בטמפרטורת חדר לפני ההזרקה. ההרדמה נמשכת לפחות 20 דקות. התואר של הרדמה צריך להיות מבוקר לאורך כל הניתוח. ההרדמה יכולה להיות ממושכת על ידי הזרקה תוך הצפק של מחצית מנה בכל 20 דקות. - מניחים את העכבר בצד הימני שלה, תחת זרימת lamina מכסה המנוע אופקי. לעקר את שדה הניתוח עם 70% אתנול ו -10% פתרון dermic יודיד. עם חלק מלקחיים שיער העכבר לאורך אורך 2 סנטימטר מעל המשותף של הרגל האחורית. לגלח את אזור הניתוח.
- עם אזמל, להפוך סנטימטר אורך חתך 1.5, הרקמה עורית הראשונה, ולאחר מכן עם מספריים לחתוך את רקמת השריר. החל לחץ קל לשני הצדדים של החתך, שיאלץ את הכליות מתוך חלל הבטן.
- החל מלוח עם כותנה-ניצן לשמור הכליות לחות. אם יש לך קשיים בחשיפת האיבר, להשתמש במלקחיים שטוחים לשלוף את רקמת adipocyte מסביב שלכליות מחוברת. לשמור על הכליות מתוך חלל retroperitoneal ידי ניצן כותנה ממוקם מתחת לאיבר.
- עם שני מלקחיים עדינים, לעשות חור 2-3 מ"מ בכמוסה (להימנע מלגעת parenchyma כדי למנוע דימום). במהלך ההליך הכירורגי כל לשמור על הקפסולה הכליות החשופה הטבולה ברציפות.
- הכנס בזהירות את האונות תחת הקפסולה הכליות, על ידי שמירה על הקיר של הקפסולה נפתחה והחלק את השתל מתחת לכמוסה לכיוון קוטב הקצה. הנח עד 6 אונות לכליות.
- החלף את הכליות בחלל רטרו הצפק. לתפור את aponeuroses השריר, אז עור עם קשרים מנתח בודדים. להרטיב את הפצע עם 10% פתרון povidone יודיד. מניחים את העכבר על הרשות הפלסטינית מחוממתד ב 37 מעלות צלזיוס.
- סקר העכבר המושתל עד להחלמה מלאה מן ההרדמה על ידי שליטה על תנועות לב, נשימה וזיף, צבעי רירית עד להחלמה מוחלטת נתפסה על ידי עצמי כלולה תנועות.
הערה: אנו ממליצים הזרקה של פתרון כאבים שרירים פנים (Buprenorphin, 0.1 מ"ג / קילוגרם) רק לאחר הניתוח ולאחר ניתוח 2 ימים כדי למנוע כאב שלאחר הניתוח. - שמור את החיה פעלה בבידוד עד התאושש לחלוטין. בדוק בכל יום אחר התפרים של הפצע כדי לוודא ולמנוע זיהום. מעולם לא נצפה זיהום פצע הבא בהליך זה.
הערה: ניתוח שבועי של תאי דם היקפיים מCD3 - / - עכברים מורכבים מאפשרים לנו לזהות את הרתי אוכלוסיות נובעות מקור משני אבות E13 או E18 באמצעות סמן CD45 allotypic ושושלת תא T נוגדנים ספציפיים (איור 3).
9. ניתוח של צאצאי TSP על ידי cytometry הזרימה
- השעיות תא כתם מאונות בודדות עם תערובת נוגדנים המכילה נוגדני הכרת CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 פסיפיק בלו, Vγ5 FITC, Vδ1 PE והדגירה כאמור בסעיף 5.
- להשעות מחדש את התאים בHBSS יודיד FCS + 1% + propidium ולנתח בcytometer זרימה (ראה תוצאות באיור 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבחור שיטה לרוקן אונות הרתי של thymocytes אנדוגני המאפשר הפיתוח הטוב ביותר של אבות התיישבות, השווינו את הרמות של הכינון מחדש של תאי T באונות הרתי יישבו לאחר הקרנה או deoxy-guanosine 5 ימים טיפול (ד-גואה). התוצאות מראות כי בעוד שאין הבדל ביום 9 של תרבות, אונות מוקרנים הכילו יותר תאי T מאלה שטופלו בד-גואה, ביום 12. לפיכך, קרינה היא יותר מתאימה מאשר טיפול ד-גואה להשיג פיתוח תא T אחרי קולוניזציה הרתי (איור 1). כדי לחקור את הפוטנציאל ההתפתחותי של E13 וE18 TSP, אנחנו יישבנו E14 מוקרן אונות הרתי בתערובת של מספר שווה של שני סוגים של אבות. התוצאות מראות כי E13 TSPs להצמיח פחות ופחות thymocytes DP מ E18 TSP אבל, בניגוד לכך, E13 TSP ליצור DETC ותדירות גבוהה יותר של CD3 + בוגר תאים (איור 2). כדי לנתח את הסיר בvivoential של E13 וE18 TSP, אונות הרתי יישבו עם כל סוג של אבות היו מורכבים תחת הקפסולה הכליות של CD3 - / - המקבלים. התוצאות מראות כי, עולה בקנה אחד עם FTOC, E13 TSP הוליד תאי T מהר יותר מאשר אבות E18 אבל מספר תאי T במחזור היה נמוך באופן משמעותי (איור 3).
איור 1: פיתוח תא T הוא יותר יעיל במוקרן מאשר בdeoxyguanosine טופל, אונות הרתי יישבו אונות הרתי E14 (CD45.2) היו או מוקרנת עם 30 Gy או טופלו במשך 5 ימים עם deoxy-guanosine (ד-גואה).. אונות הרתי אז היו יישבו עם 1000 לין - CD117 + SCA-1 + תאים (LSK) E14 פלורידה המבודדים מCD45.1 / 2 עוברים, בתליית ירידה במשך 48 שעות ותרבותית על מסנן. לא נצפו הבדלים ביעילות של enדלדול thymocyte dogenous בין שתי הקבוצות של אונות הרתי. פיתוח thymocytes מוכתם עם נוגדנים נגד CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 וCD4 נותחו ביום 9 ו -12 על ידי FACS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בניגוד לE18, E13 TSPs ליצור Vγ5Vδ1 DETC אונות הרתי CD45.2 היו מוקרנים ויישבו במשך 48 שעות עם מחזור מעורב של 500 E13 כפית מCD45.1 / 2 עוברים וE18 500 TSP מעוברי CD45.1. . בתנאים אלה ניסיוניים, E13 וE18 TSP לפתח באותה הסביבה והבדלים בשיעור של תת בידול ותא T הבוגר נצפו לאחר התרבות רק יכולים לשקף הבדלים בביולוגיים פנימי תאמאפיינים. אחרי 12 ימים בthymocytes התרבות מאונות בודדות נותחו על ידי cytometry זרימה לאחר הצביעה עם נוגדני הכרת CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. פנלים () מראים את המספרים של תאים התאוששו בכל אונה. זרימת נציג cytometry פרופילים (B). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: E13 TSPs לפתח מהר יותר מאשר E18 TSPs אונות הרתי CD45.2 היו מוקרנים ויישבו לשעה 48 עם 500 E13 כפית או 500 E18 כפית מעוברי CD45.1.. CD3 - / - עכברים מורכבים עם 4 אונות הרתי יישבו גם עם E13 או E18 TSPs. דם היקפי נאסף במרווחים שבועיים ונותח על ידי FACS למטלותולא תאים (CD45.1) CD3 + T. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שלב 1 | הזדווגות עכברים להשיג עוברי E18 (יום -21); הזדווגות עכברים להשיג עוברי E14 (יום -17); הזדווגות עכברים להשיג עוברי E13 (יום -16) | ||
| שלב 2a | Dissection של העוברים, יום -2 | ||
| 2b צעד | הקרנה של אונות הרתי E14, יום -2 | ||
| 2c צעד | אונות הרתי הכנה, צביעה, ומיון תאים מE13 וE18, יום -2 | ||
| שלב 2 ד | תליית תרבות ירידה, יום -2 | ||
| 3a צעד | עוברי הרתי איברים תרבות, יום 0 | ||
| 3 ב צעד | שתל תחת הקפסולה הכליות, יום 0 | שלב 4 | FTOC: ניתוח תזרים cytometry, יום 12 |
| שלב 5 | שתל: זרימה שבועית cytometry הניתוח של מחזור תאי T, ימים 15, 22, 35 |
טבלת 1: הליך 5-הצעד המיושמת בניסוי הזמן-השולחן של הניסוי מההזדווגות של הזנים השונים עכבר עד הניתוח של העכברים המורכבים.. שתלי מבוצעים בעכברים ישנים 7 שבוע. לוקח את הזמן של השתלה כיום 0, יום -21 הוא ההזדווגות של עכברים כדי להשיג עוברי E18, יום -17 להשיג עוברי E14, היום -16 להשיג עוברי E13, וביום -2 המיון של E13 וE18 TSP , אונת הרתי הקרנה ותלויה טכניקת ירידה.
| נוגדן | מספר שיבוט | נוגדן | מספר שיבוט | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6.7 | SCA-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
מספרי נוגדנים ושיבוט: טבלה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שני מבחני עיקריים ניתן להשתמש כדי לנתח התמיינות תאי T vivo לשעבר. דיווח לאחרונה היא התרבות המשותפת של אבות hematopoietic עם תאי סטרומה בע"מ, OP9, המבטא את ligands של Noth1, דלתא כמו 1 או 4 12. Assay 2-D זה קל לביצוע, יעיל ורגיש מאוד, המאפשר ניתוח ב רמת התא הבודד. עם זאת, זה לא תומך בפיתוח תאי T מעבר לשלב של DP ולא הדור של γδ DETC 13, שניהם דורשים אינטראקציות ישירות עם אפיתל הרתי.
FTOCs כבר מזמן משמש לניתוח התפתחות תאי T 3. הכוח העיקרי של assay זה מאפשר את הדור של כל תאים בוגרים של תאי T, רכוש שניתן על ידי אינטראקציות 3-D היעילה של thymocytes עם אפיתל הרתי. בדקנו כאן השתמשתי בשתי שיטות כיום לרוקן thymocytes אנדוגני ובכך מאפשר התישבות יעילה על ידי אבות אקסוגניים. שניהם טיפול קרינה מייננת וdeoxyguanosine יעילות מדולדל פיתוח thymocytes. עם זאת, אונות הרתי רק מוקרנת ספגו פיתוח תא T חזק לתקופות זמן ארוכות יותר מצביעים על כך שטיפול ד-גואה גם עשוי להשפיע על מרכיבי תא אפיתל. אונות הרתי עובריים היו יישבו על ידי אבות אקסוגניים בשיטה "הטיפה תלויה". קולוניזציה של אונות מוקרנת בשני האוכלוסיות בתחרות מאפשרת איתור מאפיינים ביולוגיים אוטונומיים תאים שונים. התיישבות עם רק אחד מתת TSP מגלה יכולת הבידול שלהם בסביבה לא תחרותית.
החסרון של שיטה זו הוא יעילות נמוכה יותר בתדירות של TSP שתתפתח לתאי T בהשוואה לשיתוף תרבויות OP9Dl 14. עם זאת שעשינו תאי DN1 או DN2 יחידים ליישב אונות הרתי בודדות עם יעילות קרובה יותר לזה שהושג עם תאי סטרומה. הרדוקציה פי עשרהn ביעילות של ייצור תאי T נמצא כאשר אבות hematopoietic פלורידה או BM משמשים לFTOC שלא נצפה בדלתא OP9 כמו תרבויות. פיתוח פחות יעיל זה מצביע על כך שלא כל BM או פלורידה התאים עם פוטנציאל תא T יכולים ליישב את התימוס.
השתלת אונות הרתי יישבו מציעה אספקה טובה יותר מזינה וחמצן לפיתוח thymi מאשר בFTOC, ואפשרות למעקב גורל הצאצאים של כפית, in vivo. שימוש בשתי אסטרטגיות משולבות אלה אנו יכולים לתאר את הצעדים של בידול ופוטנציאל תפקודי של הצאצאים של TSPs. בגלל CD3 - / - העכברים 15 CD45.2, שלא יכול לפתח תאי T בשלים, שמשו כמארחים, אנחנו יכולים יחד עם הבדלי allotypic CD45, באופן חד משמעי מעקב תאי T שנוצרו זה עתה בסביבתם הטבעית
היבטי הרומן של הליך הניסוי שתואר כאן הוא השילוב של FTOC מחדשעם השתלת in vivo. זה אפשר זיהוי ואיתור הצאצאים של תת מוגדר של אבות hematopoietic. מצאנו TSP שמהגלים הראשונים והשני ליצור תת שונים של תאי γδT, מספרים שונים של תאי αβT ויש לי קינטיקה שונה של בידול.
שלב של העוברים: היום 0 נחשב 18 שעות לאחר ההזדווגות של העכברים, על פי זיהוי התקע. ניתוחים של thymi דורשים W טוב קר אור 150, מיקרוסקופ לנתיחה משקפת וחלק באימון ולניתוחים, הרדמה ונהלי שתל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
נתמך על ידי המכון פסטר, INSERM, סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר ANR ('Lymphopoiesis' גרנט), להחיות עתיד תכנית השקעות ו" לה ליגת העל contre le הסרטן ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R.
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J.
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
