Abstract
Caractériser thymiques régler progéniteurs est important de comprendre les étapes de pré-thymiques du développement des cellules T, essentiels pour élaborer des stratégies pour le remplacement des cellules T chez les patients lymphopéniques. Nous avons étudié thymique régler progéniteurs de murin jour embryonnaire 13 et 18 thymus par deux complémentaires in vitro et in vivo techniques, tous deux basés sur la méthode "goutte suspendue". Cette méthode a permis de coloniser irradiés lobes thymiques foetaux avec E13 et / ou E18 progéniteurs CD45 thymiques distingués par marqueurs allotypiques et suivants de leur progéniture ainsi. La colonisation par des populations mixtes permet d'analyser les différences cellulaires autonomes dans les propriétés biologiques des progéniteurs tandis colonisation soit avec la population supprime possibles pressions sélectives compétitifs. Les lobes thymiques colonisés peuvent également être greffés chez des souris immunodéficientes bénéficiaires masculins permettant l'analyse de la descendance maturité des cellules T in vivo, tels que la dynamique des populations de til périphérique système immunitaire et la colonisation de différents tissus et organes. Des cultures d'organes thymiques foetaux révélé que progéniteurs E13 développées rapidement dans tous maturité cellules CD3 + et ont donné lieu à la sous-ensemble de cellules T γδ canonique, connu sous le nom de cellules T épithéliales dendritiques. En comparaison, les progéniteurs E18 ont un retard de différenciation et ont été incapables de générer des cellules dendritiques T épithéliale. La surveillance de sang périphérique de CD3 thymus greffé - / - souris en outre montré que les progéniteurs E18 thymique décantation génèrent, avec le temps, un plus grand nombre de cellules T matures que leurs homologues E13, une caractéristique qui n'a pas pu être apprécié dans le thymus du fœtus à court terme des cultures d'organes.
Introduction
Lymphocytes T, portant le αβ ou le récepteur de lymphocytes T γδ de (TcR), se différencient dans un organe spécialisé, le thymus. Le thymus entièrement développé est divisé en deux régions distinctes: le cortex, où progéniteurs thymiques se développent et où thymocytes qui réarrangent productive les β TCR et gènes de la chaîne α sont sauvés de la mort programmée (un processus connu sous le nom sélection positive); et la moelle, où sélectionné thymocytes trop forte réactivité aux auto-ligands sont supprimés (sélection négative) 1,2. Le thymus est originaire de la couche endodermique de la troisième poche pharyngienne qui est ensuite entouré par trois cellules mésenchymateuses. Il est colonisée par les progéniteurs hématopoïétiques à partir de jour embryonnaire E12 et, par la suite, le recrutement continue T est requis pour le développement des cellules normales 4. Immigrés thymiques évoluent par étapes de développement successives, orchestrée par un programme strictement réglementé, initié et maintained par l'activation de la voie de signalisation Notch dans les thymocytes lors de l'interaction avec son ligand, comme delta 4, exprimé sur les cellules épithéliales thymiques (CET) 5.
le développement de Thymocyte commence au CD4 dite - CD8 - Double Negative (DN) étapes. Thymocytes DN peuvent être subdivisés selon l'expression de CD25 et CD44 dans DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) et DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) et CD117 (c-kit) subdivise le compartiment DN1 en 5 sous-ensembles où DN1A et b correspondent aux progéniteurs thymiques précoces (ETP). Thymocytes réorganiser les δ, β et α chaînes de TCR au stade DN et subissent pré-TcR sélection (stades DN3-DN4). Ils ont en outre en commun pour le CD4 + CD8 + double positif (DP) compartiment où la chaîne α TcR réorganise avant sele positif et négatifction. A ce stade, la plupart des thymocytes sont éliminés et seulement un faible pourcentage (3-5%) atteignent la CD4 + ou CD8 + T matures compartiment cellulaire.
La voie de différenciation lymphoïde progresse à travers les étapes de la CSH qui génèrent des progéniteurs multipotentes (MPP) et les progéniteurs lymphoïdes multipotentes amorcée (PPSP) qui ont perdu des érythrocytes et le potentiel 6 mégacaryocytes. PPSP sont phénotypiquement définie par l'absence de marqueurs de cellules sanguines différenciées (lignée négative, Lin -), l'expression de c-Kit (CD117), Sca-1 et Flt3 / flk2 (CD135) et l'absence de taux détectables de l'interleukine ( IL) -7 récepteur α chaîne (IL-7rα ou CD127). LMPPs différencient en précurseurs communs lymphoïdes (CLP) 7 qui à ce stade ont perdu la capacité de générer des cellules myéloïdes. CLP conserver lymphocytes (cellules B et T), cellules NK, DC et la cellule lymphoïde innée (CIT) de potentiel, et diffèrent de PPSP par l'expression de CD127 et l'absence de niveaux élevés de Sca-1.
Bien que la nature des thymiques régler progéniteurs (TSP) a été largement débattue 8, il est récemment devenu clair que TSP changement phénotype, le potentiel et la fonction de différenciation, tout au long du développement 9. Nous avons effectué in vitro et in vivo pour caractériser la TSP, isolé par la cellule de tri FACS soit E13 (première vague) ou E18 (deuxième vague). Cultures thymiques foetaux d'organes (FTOC) avec lobes thymiques irradiés colonisés par un nombre égal de E13 et E18 progéniteurs, portant différents marqueurs de allotypiques, admis suivant leur progéniture dans un environnement de développement similaire et révélées propriétés intrinsèques cellulaires, différents entre les deux types de progéniteurs. Lobes thymiques colonisés par E13 ou E18 soit TSP permis le développement sans sélection en raison de la concurrence entre les deux progéniteurs. In vivo transplantation des lobes thymiques colonisés en outre montré que aussi til descendance mature de E13 et E18 TSP ont différentes propriétés biologiques in vivo. FST de la première vague de générer rapidement des cellules T, mais donnent lieu à un faible nombre de cellules T αβ et γδ. Parmi ces derniers, nous avons détecté des cellules dendritiques Vγ5Vδ1 épithéliales T (DETC), qui ont un TcR invariant, migrent vers l'épiderme où ils exercent une fonction dans la cicatrisation des plaies et ne sont produites pendant le développement embryonnaire 10. En revanche, TSP de la deuxième vague de prendre plus de temps pour générer des nombres élevés de cellules TcR + T et sont incapables de générer DETC.
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Protocol
Déclaration éthique: toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Charte Ethique Institut Pasteur, approuvé par le ministère français de l'Agriculture, et les lignes directrices de l'UE. Un manipulateur avec une formation sur la chirurgie petit rongeur, certifié par le ministère français de l'Agriculture, effectue toutes les interventions chirurgicales.
NOTE: Voir en annexe le tableau 1 montrant la procédure du plan en 5 étapes.
1. La sélection des embryons
- Utilisez 36 femelles C57BL / 6 CD45.2, 12 femelles CD45.1, 12 C57BL / 6 Les mâles CD45.1 et 12 C57BL / 6 mâles CD45.2. Traverser les femelles avec soit le génotype mâle va produire des embryons CD45.1 / 2 et CD45.1 utilisés comme une source de TSP ou CD45.2 utilisé comme une source de bénéficiaires lobes thymiques. Maison tous les mâles individuellement.
- Pour obtenir des embryons pour E18 TSP isolement, placez 2 femelles dans une cage avec un mâle CD45.1 à 18 heures, 21 jours avant l'expérience de greffage. Vérifier la présence d'un bouchon vaginal le lendemain, avant midi. Sepaévaluer les femelles branchés.
- Pour obtenir des embryons E14 à être colonisée par TSP, répétez la procédure ci-dessus (1.2), en utilisant les mâles CD45.2, 17 jours avant l'expérience de greffage.
- Pour obtenir des embryons pour isoler E13 TSP, répétez la procédure ci-dessus (1.2), en utilisant les mâles C57BL / 6 CD45.1, 16 jours avant l'expérience de greffage.
2. Dissection du embryons Sous une Horizontal Hotte à flux laminaire
REMARQUE: Deux jours avant l'expérience de greffage.
- Sacrifice des femelles gravides par dislocation cervicale ou par administration progressive du CO 2 gazeux pendant au moins 5 min, dans une enceinte fermée saturation. Veiller à la mort par arrêt définitif des mouvements de cardio-respiratoires. Mouillez l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Faire une incision longitudinale dans la peau à l'abdomen de la ligne médiane et l'ouvrir en tirant la peau de l'autre. Ouvrir le péritoine avec des pinces et des ciseaux, sans toucher le tube digestif. Sortez le uter bifidenous et le séparer du vagin avec les ciseaux.
- Placez l'utérus dans un plat de 90 x 15 mm de Pétri contenant 40-50 ml DPBS et couper transversalement entre la caduque de chaque embryon.
- Avec la paire de ciseaux fins de pointe et une pince fine retirer la membrane musculaire de l'utérus, sortez les embryons en coupant entre le placenta et le sac jaune, et de supprimer l'amnios, qui est retenue les embryons.
- Placez les embryons dans une boîte de Pétri de 90 x 15 mm contenant HBSS + 1% de sérum de veau foetal (FCS). Pour les embryons âgés de plus de E15, retirez les têtes avec une paire de ciseaux avant toute nouvelle dissection.
3. Isolement du Thymus
- Sous la loupe binoculaire, placer l'embryon, se trouvant en position couchée (vue ventrale), sur une literie de gaze humide.
- Insérez une pince longitudinalement le long du cartilage du sternum, pincer et ouvrir la grille thoracique. Avec pince courbe, tirez la paroi thoracique de côté pour visualiser le thymic lobes de chaque côté de la trachée.
- Tenez soigneusement chaque lobe en pinçant dessous avec une pince fine et les placer dans une boîte de Pétri contenant 1 ml de HBSS + 1% de FCS. Isoler les lobes et enlevez tissu conjonctif environnant avec deux seringues de 1 ml + 26 G ⅜ "aiguilles, sans endommager la capsule.
- Laver les lobes dans 3 ml de HBSS + 1% de FCS pour éliminer les cellules sanguines.
REMARQUE: Avant E15, lobes thymiques sont situés de chaque côté de la trachée et fusible plus tard dans le milieu pour constituer un organe bi-lobaire.
4. suspensions cellulaires
- Démêler les lobes sous la loupe binoculaire, avec deux aiguilles 26 G montés sur seringues de 1 ml, dans HBSS + 1% de FCS. On filtre la suspension de cellules à travers une maille de nylon.
5. coloration avec des anticorps et des cellules fluorescentes tri
NOTE: Tous les anticorps sont préalablement titrés pour obtenir la définition optimale des populations (le titration peut varier avec le lot d'anticorps).
- Incuber les thymocytes (E13 ou E18) pour 15-30 minutes à 4 ° C avec 100 ul d'un cocktail d'anticorps biotinylés pour colorer les cellules positives de la lignée (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- Pour laver l'excès d'anticorps ralentissent les tubes avec 4 ml de HBSS + 1% de FCS à 280 g pendant 7 min, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans HBSS frais + 1% de FCS. Répétez la centrifugation.
- Incuber les cellules marquées à la biotine E18 avec les microbilles de streptavidine pendant 15 minutes à 4 ° C et laver les cellules deux fois dans du HBSS à 1% de FCS. Re-suspendre les cellules dans 2 ml de HBSS + 1% de FCS. La plupart des thymocytes E13 sont lignée négative et ne nécessitent donc pas MACS enrichissement avant le tri de cellules.
- Faire passer les cellules sur la colonne de LS, selon les instructions du fabricant. Lorsque toute la suspension de cellules est entré dans la colonne d'ajouter 2 ml de HBSS + 1% de FCS. Récupérer le4 ml de l'écoulement à travers la colonne et centrifuger les cellules pendant 7 minutes à 280 x g.
- Re-suspendre le culot E18 soit appauvri ou thymocytes totaux E13 dans 50 pi de l'anticorps mélange TSP (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 et streptavidine Pacific Blue ) et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
- Laver les cellules avec 4 ml de HBSS + 1% de FCS et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de HBSS + 1% de FCS avec de l'iodure de propidium.
- Trier la FST Lin - CD44 + CD117 + CD24 + CD135 bas CD127 + cellules dans un FACS (avec 4 lasers) sur une tubes de 1,5 ml contenant 200 pi de milieu complet + 20% FCS. Première porte les cellules en fonction de leur taille et de granularité sur le FSC et les canaux de la SSC. Éliminer les cellules mortes (coloration avec l'iodure de propidium), porte sur doublets et marquer la fluorescence dans les échelles exponentielles. Environ 100 ou 600 FST peuvent être obtenus d'un E13 ou E18 un thymus, respectivEly.
6. La colonisation de E14 thymique lobes avec progéniteurs: Hanging Technique Goutte
- Irradier (30 Grays = 30 Gy) E14 lobes thymiques à partir d'embryons CD45.2, 3 h avant la culture.
NOTE: E14 ou E15 lobes thymiques ont été utilisés avec succès en tant que destinataire de progéniteurs de lymphocytes T. Utilisation bénéficiaires lobes thymiques de résultats ultérieurs jours de gestation dans la nécrose prématurée en raison de la grande taille de l'organe tout en lobes thymiques au antérieures jours de gestation développent mal, probablement en raison du développement incomplet des cellules épithéliales. - Centrifugeuse triés FST et remettre en suspension les cellules dans du milieu de culture (OPTI-MEM milieu complet avec 10% de FCS, de la pénicilline (50 unités / ml), streptomycine (50 ug / ml) et de 2β-mercaptoéthanol (50 uM)) de telle sorte que 35 ul contient 500 TSP.
- Déposer une goutte de 35 pi de suspension cellulaire tous les autres puits d'une plaque bien Terasaki 60.
REMARQUE: 35 ul gouttes peuvent fusionner si elles sont placées dans des puits adjacents. - Placer une lobe irradié sur la surface de chaque goutte. Fermez la plaque Terasaki et tourner la plaque à l'envers pour laisser les cellules atteignent le pôle apical de la goutte par gravité.
- Hit doucement le côté supérieur de la plaque inversée pour forcer les lobes de coulisser sur le bord apical de la goutte. Incuber la plaque Terasaki inversé dans un incubateur humidifié pendant 48 heures à 37 ° C + 5% CO 2. Après la colonisation, soit la culture E14 thymus dans FTOC 7, ou greffé sous la capsule du rein d'une souris adulte bénéficiaire 8.
7. fœtale thymique Organ Culture
- Placer 3 ml de milieu complet dans un plat de Pétri de 35 mm. Placer un filtre à membrane de isopore flottant sur le support. Placez les lobes reconstituées sur le bord de la membrane avec une pince (pas plus de huit lobes sur une seule membrane).
- Placez les boîtes de Pétri contenant les lobes thymiques dans un plat de 90 mm de Petri, avec une boîte de 35 mm, sans couvercle, contenant 2 ml de Water, à assurer une humidité optimale. Incuber 12 jours à 37 ° C + 5% CO 2.
8. Les greffes sous la capsule du rein dans des conditions stériles
NOTE: Le parenchyme rénal est entouré par du tissu conjonctif formant une capsule. La région sous-capsulaire est particulièrement riche en vaisseaux sanguins et lymphatiques, fournissant ainsi un environnement approprié pour le développement des greffes (par exemple, les lobes thymiques, des îlots pancréatiques ou des cœurs nouveau-nés). Les greffes sont habituellement effectuées sur le rein gauche, car il est plus accessible que le rein droit. CD3 - / - souris mâles ont été utilisés en tant que bénéficiaires évitant ainsi la réaction du greffon contre l'hôte due à des antigènes mineurs d'histocompatibilité liés au chromosome Y parce que la détermination du sexe avant E15 est pas fait facilement.
- Stériliser les instruments et porter des gants stériles long de la chirurgie. Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale d'une solution de kétamine à 10 mg / ml + 1 mg de xylazine /ml dilué dans du PBS (50 à 100 pl par 10 g de poids corporel), en utilisant une seringue de 1 ml. Vérifiez l'anesthésie en vérifiant l'absence de réflexes interdigitaux. Déposer une goutte de gel hydro-Optimune sur chaque œil pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
NOTE: La solution doit être préparée de manière inopinée et réchauffé à température ambiante avant l'injection. L'anesthésie dure au moins 20 min. Le degré de l'anesthésie doit être contrôlée tout au long de la chirurgie. L'anesthésie peut être prolongée par injection intra-péritonéale de la moitié de la dose toutes les 20 min. - Placez la souris sur son côté droit, sous une hotte à flux lamina horizontale. Stériliser le champ opératoire avec 70% d'éthanol et 10% d'une solution dermique iodure. Avec une partie de la pince à cheveux de la souris sur une longueur de 2 cm au-dessus de l'articulation de la patte postérieure. Rasez la zone chirurgicale.
- Avec un scalpel, faire un cm de longueur de la première, le tissu cutané incision 1,5, puis avec des ciseaux coupent le tissu musculaire. Appliquer une légère pression sur les deux côtés de l'incision, Ce qui forcera le rein hors de la cavité abdominale.
- Appliquer une solution saline avec un coton tige pour garder le rein humide. Si vous avez des difficultés à exposer l'orgue, utilisez une pince à plat pour retirer le tissu adipocytaire environnante à laquelle le rein est attaché. Maintenir le rein hors de la cavité rétropéritonéale par un coton-tige placée au-dessous de l'organe.
- Avec deux pinces fines, faire un trou de 2-3 mm dans la capsule (éviter de toucher le parenchyme pour prévenir les saignements). Pendant toute la procédure chirurgicale garder la capsule rénale exposée en permanence humide.
- Insérez soigneusement les lobes sous la capsule du rein, par le maintien de la paroi de la capsule ouverte et faites glisser la greffe sous la capsule vers le pôle de bord. Placez jusqu'à 6 lobes par les reins.
- Remplacer le rein dans la cavité rétro-péritonéale. Suturer les aponévroses musculaires, puis la peau avec des nœuds de chirurgien individuels. Mouiller la plaie avec 10% de solution de povidone iodure. Placez la souris sur un an chaufféed à 37 ° C.
- Enquête sur la souris transplanté jusqu'au rétablissement complet de l'anesthésie par le contrôle des cardiaques, respiratoires et moustaches mouvements, couleurs muqueuses jusqu'à la récupération totale vu par autonome mouvements.
NOTE: Nous vous recommandons injection d'une solution analgésique (buprénorphine, 0,1 mg / kg) intra musculaire juste après la chirurgie et les deux jours suivant la chirurgie pour prévenir la douleur post-opératoire. - Gardez l'animal opéré dans l'isolement jusqu'à guérison complète. Inspecter tous les deux jours les points de suture de la plaie pour vérifier et prévenir l'infection. Jamais observé infection de la plaie suivant cette procédure.
NOTE: Analyse hebdomadaire de cellules sanguines périphériques de la CD3 - / - souris greffées nous permettent de détecter l'thymique populations issues provenaient soit progéniteurs E13 ou E18 en utilisant le marqueur CD45 allotypique et la lignée de cellules T anticorps spécifiques (Figure 3).
9. Analyse de la descendance TSP par cytométrie en flux
- Suspensions cellulaires tache de lobes individuels avec un mélange d'anticorps contenant des anticorps reconnaissant CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE et incuber comme décrit dans la section 5.
- Re-suspendre les cellules dans HBSS + 1% FCS + iodure de propidium et d'analyser dans un cytomètre de flux (voir résultats de la figure 2).
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Representative Results
Afin de choisir une méthode d'épuiser lobes thymiques de thymocytes endogènes permettant le meilleur développement des progéniteurs colonisateurs, nous avons comparé les niveaux de T reconstitution cellulaire dans lobes thymiques colonisés après irradiation ou un désoxy-guanosine 5 jours (d-Gua) traitement. Les résultats montrent que bien qu'il n'y ait pas de différence au jour 9 de la culture, lobes irradiés contiennent plus de cellules T que ceux traités avec d-Gua, au jour 12. Ainsi, l'irradiation est plus approprié que d-Gua traitement pour obtenir le développement des cellules T après colonisation du thymus (Figure 1). Pour étudier le potentiel de développement de la E13 et E18 TSP, nous colonisés E14 irradié lobes thymiques avec un mélange à parts égales de deux types de progéniteurs. Les résultats montrent que E13 FST donner lieu à moins thymocytes DP et moins de E18 TSP, mais, en revanche, E13 TSP générer DETC et hautes fréquences de CD3 + cellules matures (figure 2). Pour analyser le pot in vivotiel des E13 et E18 TSP, lobes thymiques colonisés par chaque type de progéniteurs ont été greffés sous la capsule du rein de CD3 - / - bénéficiaires. Les résultats montrent que, conformément à la FTOC, E13 TSP a donné naissance à des cellules T plus rapidement que les progéniteurs E18 mais le nombre de cellules T circulantes était significativement plus faible (figure 3).
Figure 1: le développement des cellules T est plus efficace dans irradié que dans désoxyguanosine traité, lobes thymiques colonisés E14 lobes thymiques (CD45.2) étaient soit irradié avec 30 Gy ou traitées pendant 5 jours avec désoxy-guanosine (d-Gua).. Lobes thymiques ont ensuite été colonisés par Lin 1000 - CD117 + Sca-1 + cellules (LSK) E14 FL isolées de CD45.1 / 2 embryons, en baisse de 48 h et cultivés sur un filtre pendaison. Aucune différence n'a été observée dans l'efficacité de la salleendogène épuisement des thymocytes entre les deux groupes de lobes thymiques. Développer thymocytes colorés avec des anticorps contre CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 et CD4 ont été analysés au jour 9 et 12 par FACS. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Contrairement à E18, E13 FST générer Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 lobes thymiques ont été irradiés et colonisés pendant 48 heures avec une cohorte mixte de 500 E13 TSP de CD45.1 / 2 embryons et 500 E18 TSP à partir d'embryons CD45.1. . Dans ces conditions expérimentales, E13 et E18 TSP se développent dans le même environnement et les différences dans le taux de différenciation et de cellules T matures sous-ensembles observés après la culture ne peut que refléter des différences dans la cellule biologique intrinsèquepropriétés. Après 12 jours de culture dans les thymocytes de lobes individuels ont été analysés par cytométrie de flux après coloration avec des anticorps reconnaissant CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) Les panels montrent le nombre de cellules récupérées dans chaque lobe. (B) de flux représentant des profils de cytométrie. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: E13 FST développer plus vite que E18 FST lobes CD45.2 thymiques ont été irradiés et colonisés pendant 48 heures avec 500 ou 500 E13 TSP TSP E18 à partir d'embryons CD45.1.. CD3 - / - souris ont été greffées avec 4 lobes thymiques colonisés par E13 ou E18 soit FST. Le sang périphérique a été recueilli à des intervalles hebdomadaires et analysé par FACS pour doni cellules (CD45.1) T CD3 +. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| étape 1 | L'accouplement des souris pour obtenir des embryons E18 (jour -21); accouplement des souris pour obtenir des embryons E14 (jour -17); accouplement des souris pour obtenir des embryons E13 (-16 jours) | ||
| étape 2a | La dissection des embryons, jour -2 | ||
| l'étape 2b | Irradiation de E14 lobes du thymus, jour -2 | ||
| étape 2c | Préparation, coloration, et le tri de cellules à partir de E13 et E18 lobes thymiques, jour -2 | ||
| étape 2d | Hanging culture de goutte, jour -2 | ||
| étape 3a | Fetal thymique Organ Culture, jour 0 | ||
| Étape 3b | Greffe sous la capsule du rein, jour 0 | étape 4 | FTOC: cytométrie en flux, jour 12 |
| l'étape 5 | Graft: débit hebdomadaire cytométrie analyse des lymphocytes T circulants, les jours 15, 22, 35 |
Tableau 1: La procédure suivie en 5 étapes dans l'expérience Time-tableau de l'expérience de l'accouplement des différentes souches de souris jusqu'à l'analyse des souris greffées.. Les greffes sont effectuées dans des souris âgées de 7 semaines. Prendre le temps de transplantation comme jour 0, jour -21 est l'accouplement de souris pour obtenir des embryons E18, jour -17 à obtenir des embryons E14, jour -16 à obtenir des embryons E13, jour et dans le tri de -2 E13 et E18 TSP , l'irradiation lobe thymique et la pendaison technique de la goutte.
| Anticorps | Nombre Clone | Anticorps | Nombre Clone | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53 à 6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tableau 2: les anticorps et les clones numéros.
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Discussion
Deux principaux essais peuvent être utilisés pour analyser la différenciation des cellules T ex vivo. Le plus récemment rapporté est la co-culture de progéniteurs hématopoïétiques avec des cellules stromales BM, OP9, exprimant les ligands de Noth1, delta comme 1 ou 4 12. Cette analyse 2-D est facile à réaliser, très efficace et sensible, permettant une analyse à le niveau de la cellule unique. Toutefois, il ne soutient le développement des cellules T au-delà de la phase de DP ni la génération de γδ DETC 13, qui exigent à la fois des interactions directes avec l'épithélium thymique.
FTOCs ont longtemps été utilisés pour analyser le développement des cellules T 3. La grande force de ce test est de permettre la génération de tous les compartiments maturité de cellules T, une propriété accordée par les interactions efficaces 3-D de thymocytes avec l'épithélium thymique. Nous avons testé ici deux méthodes actuellement utilisées pour épuiser thymocytes endogènes permettant ainsi la colonisation efficace en progéniteurs exogènes. Les deux ionisants irradiation et désoxyguanosine détruit efficacement le développement de thymocytes. Cependant, seulement lobes thymiques irradiés ont subi un développement des cellules T robuste pour de longues périodes de temps ce qui suggère que le traitement d-Gua pourrait également affecter les composants du compartiment épithélial. Lobes thymiques embryonnaires ont été colonisés par des progéniteurs exogènes en utilisant la méthode du "goutte suspendue". La colonisation des lobes irradiés avec les deux populations en compétition permet de détecter différentes propriétés biologiques cellulaires autonomes. La colonisation par un seul des sous-ensembles TSP révèle leur capacité de différenciation dans un environnement non-compétitif.
L'inconvénient de cette méthode est un rendement plus faible de la fréquence de TSP qui se développent dans les lymphocytes T par rapport aux co-cultures OP9Dl 14. Cependant, nous avons fait des cellules DN1 DN2 simples ou à coloniser lobes thymiques individuels avec une efficacité proche de celle obtenue avec les cellules stromales. Un reductio dix foisn de l'efficacité de la production de cellules T est trouvé lorsque FL ou BM progéniteurs hématopoïétiques sont utilisés pour la FTOC qui est pas observée dans le delta de OP9 comme les cultures. Ce développement moins efficace suggère que toutes les cellules BM ou FL avec potentiel de cellule T peuvent coloniser le thymus.
Greffage lobes thymiques colonisés offre un approvisionnement mieux nutriments et l'oxygène pour thymus en développement que dans FTOC, et la possibilité de suivre le sort de la descendance de TSP, in vivo. L'utilisation de ces deux stratégies combinées nous pourrions décrire les étapes de différenciation et de potentiel fonctionnel de la progéniture de FST. Parce que CD3 - / - souris CD45.2 15, qui ne peuvent pas développer des cellules T matures, ont été utilisés comme des hôtes, nous pourrions, avec les différences allotypiques CD45, suivez sans ambiguïté les cellules T nouvellement générés dans leurs milieux naturels
Les nouveaux aspects de la procédure expérimentale décrite ici est la combinaison de FTOC reconstituéavec transplantation in vivo. Cela a permis l'identification et le traçage de la descendance des sous-ensembles définis de progéniteurs hématopoïétiques. Nous avons constaté que TSP partir des première et seconde ondes générer différents sous-ensembles de cellules γδT, des nombres différents de cellules αβT et ont différentes cinétiques de différenciation.
Stade de l'embryon: le jour 0 est considéré 18 h après l'accouplement de la souris, selon la détection de la prise. Dissections du thymus nécessite une bonne lumière froide 150 W, une dissection microscope binoculaire et un peu de pratique pour les dissections, l'anesthésie et les procédures de greffe.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Soutenu par l'Institut Pasteur, l'Inserm, l'Agence Nationale de Recherche (ANR Grant 'Lymphopoïèse'), le Programme d'investissement REVIVE avenir et «La Ligue contre le cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
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