Abstract
흉선 정착 전구 세포를 특성화하는 lymphopenic 환자에서 T 세포의 교체를위한 전략을 고안하는 것이 필수적, T 세포의 발달 단계 전 흉선을 이해하는 것이 중요하다. 우리는 체외에서 보완이에 의해 쥐의 배아 일 13, 18 thymi에서 전구 세포를 정착 흉선을 공부하고 생체 기술에 모두 "매달려 드롭"방법에 따라. 이 방법은 E13 및 / 또는 E18 그들의 자손 다음 따라서 CD45 allotypic 마커에 의해 구별 흉선 조상을 조사 태아 흉선 로브를 식민지화 허용했다. 인구 중 하나와 식민지가 가능한 경쟁력있는 선택적 압력을 제거하는 동안 혼합 인구 식민는 전구 세포의 생물학적 특성 세포 자치 차이를 분석하는 허용한다. 식민 흉선 로브는 또한 t의 인구 역학 생체 내 성숙 된 T 세포의 자손의 수 분석 면역 결핍받는 수컷 마우스에 이식 할 수있다그는 면역 체계와 다른 조직과 장기의 식민지를 주변. 태아 흉선 기관 배양 E13 전구 세포 모두에 빠른 속도로 개발 CD3 + 세포를 성숙 것으로 나타났다 및 수지상 상피 T 세포로 알려진 표준 γδ T 세포 하위 집합에 상승했다. 이에 비해, E18 전구 세포는 분화가 지연 및 수지상 상피 성 T 세포를 생성 할 수 없었다. - / - 흉선 이식 CD3의 말초 혈액의 모니터링 마우스는 더 E18의 흉선 정착 전구 세포는, 시간에 따라, 단기적 태아 흉선에서 감상 할 수없는 기능을 자신의 E13에 비해 성숙한 T 세포의 큰 번호를 생성하는 것으로 나타났다 기관 배양.
Introduction
T 림프구는 αβ 또는 γδ T 세포 수용체 (TCR)를 담지, 전문 기관에서 흉선 차별화. 완전히 개발 흉선은 두 가지 영역으로 구성되어 생산적 TCR의 β와 α 체인 유전자를 재 배열 흉선 세포가 프로그램의 죽음 (긍정적 인 선택으로 알려져있는 과정)에서 구출되는 흉선 조상 개발 피질, 그리고; 자기 리간드에 너무 강한 반응성과 흉선 세포를 선택한 수질은 (음 선택) 1, 2 삭제됩니다. 흉선 나중에 간엽 세포 (3)에 의해 둘러싸여 제 인두 파우치 내배엽 층에서 유래. 그것은 그 후, 연속 채용 정상 T 세포의 발달을 위해 요구되는 4 배아 일 E12과, 기점 조혈 전구 세포 식민지된다. 흉선 이민자들은 긴밀하게 규제 프로그램, 시작과 마이에 의해 조율 된, 연속적인 발달 단계를 통해 진화4처럼 그 리간드와의 상호 작용에 따라 흉선 세포의 노치 신호 전달 경로의 활성화, 델타에 의해 ntained, 흉선 상피 세포 (TEC는)에 표현 된 5.
흉선 세포 개발은 소위 CD4 시작 - CD8 - 더블 네거티브 (DN) 단계. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) 및 DN4 (CD25 - CD44 -) - DN의 흉선 세포는 더 DN1 (CD44 + CD25)에 CD25 및 CD44의 발현에 따라 세분화 될 수있다. CD24 (HSA)와 CD117 (C-kit)은 더 DN1a와 b는 초기 흉선 전구 세포 (ETP)에 해당하는 5 부분 집합에 DN1 함을 세분화. 흉선 세포는 DN 단계에서 TCR δ, β와 α 사슬을 재 배열 및 사전 TCR 선택 (DN3-DN4 단계)를 거쳐. TCR (α) 체인은 긍정과 부정 실리 이전에 재 배열 CD4 + CD8 + 더블 긍정적 인 (DP) 구획에 그들은 더 통과ction의. 이 단계에서 가장 흉선이 제거되고, 단지 작은 백분율 (3~5%)는 CD4 + 또는 CD8 + 도달가 T 세포를 격실 성숙.
림프 분화 경로는 다 능성 전구 세포 (MPP) 및 적혈구와 거핵 세포 6 잠재력을 잃어 림프-준비하는 다 능성 전구 세포 (LMPP)를 생성 조혈 모세포의 단계를 통해 진행한다. , 형 c-Kit (CD117)의 발현, 무서-1 및 FLT3 / Flk2 (CD135) 및 인터루킨의 검출 가능한 수준의 부재 (- LMPP는 표현형 (리니지 부정적인 린) 분화 혈액 세포 마커의 부재에 의해 정의 된 IL) -7 체인 α 수용체 (IL-7rα 또는 CD127). LMPPs 더욱 그 단계에서 골수 세포를 생성하는 능력을 상실했다고 공통 림프구 전구 세포 (CLP) 7로 분화. CLP는 림프구 (B와 T 세포), NK 세포, DC 및 선천성 림프 세포 (ILC)의 잠재력을 유지하고, CD1의 발현에 의해 LMPP 다를27 무서-1의 높은 수준의 부재.
흉선 정착 선조 (TSP)의 특성은 광범위 8 논의되었지만, 최근에 개발 된 것은 분명 9 TSP 걸쳐 변화 표현형 분화 잠재력과 기능은. 우리는 E13 (제 1 파) 또는 E18 (초 파) 중 하나에서 정렬 외과 세포에 의해 격리 TSP를 특성화하기 위해 생체 외 및 생체 내 분석을 수행. 동일 E13 및 E18 전구 세포의 수, 다른 allotypic 마커가 부착 된 식민지 유사한 개발 환경에서 그들의 자손 다음 허용 조상의 두 가지 유형의 사이에 다른 세포 고유 특성을 밝혀 조사 흉선 로브와 태아 흉선 기관 배양 (FTOC). E13 또는 E18 TSP 중 하나의 식민지 흉선 로브 인해 두 전구 세포 사이의 경쟁으로 선택하지 않고 개발을 허용했다. 식민지 흉선 로브의 생체 내 이식 더 보여 주었다 또한 T그는 E13의 성숙 자손과 E18 TSP는 생체 내에서 서로 다른 생물학적 특성을 갖는다. 제 웨이브에서 TSP를 빠르게 T 세포를 생성하고 있지만, αβ γδ T 세포의 낮은 숫자 일으킨다. 후자 중 우리는 불변 TCR, 그들은 상처 치유의 기능을 발휘하고 만 배아 발달 10시에 발생하는 표피로 마이그레이션이 Vγ5Vδ1 수지상 상피 T 세포 (DETC)를 발견했습니다. 대조적으로, TSP는 제 웨이브에서 TCR + T 세포의 높은 번호를 생성하는 시간이 오래 걸릴 DETC를 생성 할 수 없습니다.
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Protocol
윤리 문 : 모든 실험은 프랑스 농업 장관의 승인을 파스퇴르 연구소 윤리 헌장에 따라 수행하고, 유럽 연합 (EU) 지침에 있었다. 농업의 프랑스 교육부의 인증을 작은 설치류 수술에 대한 교육과 조작은 모든 수술 개입을 수행한다.
주 : 5 단계 계획 순서를 나타내는 부록 표 1 참조.
태아의 1. 선택
- 36 C57BL / 6 CD45.2의 여성, 12 여성의 CD45.1 12 C57BL / 6 CD45.1 남성 12 C57BL / 6 CD45.2 남성을 사용합니다. 남성 유전자형 중 하나와 여성을 횡단하는 것은 배아 CD45.1 / 2 및 CD45.1받는 사람 흉선 로브의 소스로 사용 TSP 또는 CD45.2의 소스로 사용 생성합니다. 하우스 개별적으로 모든 남성.
- , E18 TSP 격리를위한 배아를 얻기 이십일일 이식 실험 전에 오후 6시에서 한 남성 CD45.1와 케이지 2 여성을 배치합니다. 정오 전에, 다음날 질 플러그의 존재를 확인합니다. SEPA연결 여성을 평가.
- E14 배아를 얻기 위해하는 것은 TSP 식민지 될 17 일 이식 실험 전에 남성의 CD45.2를 사용하여, (1.2) 위의 절차를 반복합니다.
- E13 TSP를 분리 배아를 얻기 위해 16 일 래프팅 실험 전에, 수컷 C57BL / 6 CD45.1를 사용하여, (1.2) 상기 절차를 반복한다.
수평 층류 후드에서 태아의 해부 (2)
참고 : 이식 실험 전에 두 일.
- 포화 밀폐 된 챔버 내에서 적어도 5 분 동안 자궁 전위에 의해 또는 CO 2 가스의 진보적 인 투여에 의해 임신 한 여성을 희생. 심장 - 호흡 운동의 결정적인 체포에 의해 죽음을 확인합니다. 70 % 에탄올로 복부 젖은.
- 중간 선 복부의 피부에 세로 절개를 따로 따로 피부를 잡아 당겨 엽니 다. 소화 기관을 건드리지 않고 집게와 가위로 복막을 엽니 다. 이열 터의를 꺼냅니다우리는 가위로 질에서 분리합니다.
- 40 ~ 50 ml의 DPBS를 포함하는 90 X 15mm 페트리 접시에 자궁를 놓고 각 배아의 탈락 사이에 횡 방향으로 절단.
- 좋은 팁이 위의 쌍 미세 집게로, 자궁의 근육 막을 제거 태반과 난황 사이를 절단하여 배아를 꺼내와 배아를 유지하는 amnios을 제거합니다.
- 페트리 접시에 배아를 배치 HBSS + 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 90 X 15mm (FCS). E15보다 배아 나이가 들어 더 해부 전에 가위로 머리를 제거합니다.
흉선 3. 분리
- 양안 확대 렌즈에서 젖은 거즈 침대에 누운 위치 (복부보기)에 누워, 배아를 놓습니다.
- , 길이 방향으로 흉골의 연골을 따라 집게를 삽입 끼와 흉부 그리드를 엽니 다. 곡선 집게로, T를 시각화하기 위해 옆으로 흉부 벽을 당겨기관의 각 측면에 hymic 로브.
- 조심스럽게 미세 집게로 아래 곤란하여 각 로브를 개최하고 1 ml의 HBSS + 1 % FCS를 포함하는 페트리 접시에 배치합니다. 로브를 분리하고 캡슐에 손상을주지 않고, 두 1ml를 주사기 + 26 G ⅜ "바늘 주위의 결합 조직을 제거합니다.
- 혈액 세포를 제거하기 위해 HBSS + 1 % FCS 3 ㎖에 로브를 씻는다.
참고 : E15 전에, 흉선 로브는 양방향 엽성 기관을 구성하는 중간에 기관 나중에 퓨즈의 각 측면에 있습니다.
4. 세포 현탁액
- HBSS + 1 % FCS 1 ml를 주사기에 장착 된 두 개의 26 G 바늘로, 양안 확대 렌즈 아래 로브 떨어져 애타게. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터.
형광 항체와 세포 정렬 5. 염색
참고 : 모든 항체는 이전에 인구의 최적의 정의 (titrat를 얻기 위해 적정있다이온) 항체의 배치에 따라 달라질 수 있습니다.
- 혈통 양성 세포를 염색하는 비오틴 항체의 칵테일의 100 μL와 4 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 흉선 세포 (E13 또는 E18)을 품어 (항 CD19, 안티 GR1, 안티 Ter119, 안티 NK1.1 , 안티의 CD11c, 항 CD3, 안티 CD4, CD8 방지, 항 CD25).
- 항체가 7 분 동안 280 XG에 4 ml의 HBSS + 1 % FCS와 튜브를 스핀 다운의 거리를 초과 씻어, 상층 액을 제거하고 다시 중단 신선한 HBSS + 1 % FCS의 펠렛을. 원심 분리를 반복합니다.
- 4 ℃에서 15 분 동안 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 E18 비오틴 표지 세포를 품어 두 번 HBSS 1 % FCS에서 세포를 씻는다. 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS에 세포를 다시 일시. 대부분의 E13의 흉선 세포는 혈통 음 때문에 셀 정렬하기 전에 맥 농축이 필요하지 않습니다.
- 제조업체의 지시에 따라, LS 컬럼상에서 세포를 전달. 모든 세포 현탁액 입력하면 열은 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS를 추가한다. 복구칼럼 4 ml를 280 x g에서 7 분 동안 세포를 원심 분리를 통해 흐르게.
- 다시 중단 고갈 E18 또는 TSP 항체 믹스의 50 μL (항 CD117 APC, 안티 CD135 PE, 안티 CD127 PECy7, 항 CD24 FITC, 항 CD44 APCCy7과 스트렙 타비 딘 퍼시픽 블루 총 E13의 흉선 세포 중 하나의 펠렛을 )과 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
- 4 ㎖의 HBSS + 1 % FCS와 함께 세포를 씻어 1 ㎖의 HBSS에 요오드화 프로피 듐과 + 1 % FCS를 세포를 다시 일시.
- 정렬의 TSP 린 - 200 μL 완전 배지 + 20 % FCS를 포함하는 1.5 ml의 튜브 상 (4 레이저와) 외과에서 CD44 + CD117 + CD24 낮은 CD127 + CD135 + 세포. 금융위원회와 SSC 채널 크기와 입도에 따라 게이트 먼저 세포. (요오드화 프로피 듐 염색) 죽은 세포, 게이트 밖으로 이중선을 제거 지수 저울에 형광 점수. 약 100 또는 600의 TSP는 하나 또는 하나 E13 E18 흉선, respectiv로부터 얻을 수있다엘리.
조상 6. 식민 E14의 흉선 로브 : 매달려 드롭 기술
- (30 회색 = 30 Gy를) CD45.2 배아에서 E14 흉선 로브, 문화 전 3 시간을 조사.
참고 : E14 또는 E15 흉선 로브가 성공적으로 T 세포 전구 세포의 수신자로 사용되어왔다. 이전 임신 일에서 흉선 로브가 제대로 개발하는 동안 아마도 상피 세포의 불완전한 발달로 인해 기관의 더 큰 크기로 조기 괴사에 나중에 임신 일 결과를받는 사람 흉선 로브를 사용. - 원심 분리기의 TSP 재 일시 세포 배양 배지 (10 % FCS와 OPTI-MEM 완전 배지, 페니실린 (50 유닛 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 2β 머 캅토 에탄올 (50 μM))를 정렬되도록 35 μL 500 TSP가 포함되어 있습니다.
- 60 잘 테라 사키 판의 다른 모든 잘 세포 현탁액의 35 μL 드롭 놓습니다.
주 :이 연속 우물에 배치하는 경우 35 μL 방울을 융합 할 수 있습니다. - 각 방울의 표면에 하나 조사 로브를 놓습니다. 테라 사키 판을 닫고 세포가 중력에 의해 드롭의 혀끝 극에 도달 할 수 있도록 거꾸로 판을 켭니다.
- 히트 부드럽게 반전 플레이트의 상부는 드롭의 혀끝의 가장자리로 밀어 로브를 강제로. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 반전 테라 사키 판을 품어. 받는 사람 성인 마우스 (8)의 신장 캡슐에서 식민지, 중 문화 E14의 FTOC 7 thymi, 또는 이식 후.
7. 태아 흉선 장기 문화
- 35mm 페트리 접시에 전체 매체의 3 ㎖를 놓습니다. 매체에 떠있는 isopore 멤브레인 필터를 놓습니다. 포셉 (한 막에 이하 8 로브)와 멤브레인의 가장자리에 재구성 로브를 놓습니다.
- 식 수용 2 ㎖를 포함, 커버없이, 35mm 요리와 함께, 90mm 페트리 접시 안에 흉선 로브를 포함하는 배양 접시를 놓습니다R, 최적의 습도를 보장합니다. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 십이일 품어.
무균 조건에서 신장 캡슐에서 8 이식
참고 : 신장 실질이 캡슐을 형성하는 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다. 서브 캡슐 지역은 피함으로써 이식의 개발을위한 적합한 환경 (예 흉선 로브, 췌장 또는 신생아의 마음)을 제공하는 림프 혈관에 특히 풍부하다. 이 오른쪽 신장보다 더 접근하기 때문에 이식은 일반적으로 왼쪽 신장에서 수행된다. CD3 - / - 생쥐 수컷 E15 전에 성 결정이 용이하지 않기 때문에 수신자가 이에 의한 Y 염색체에 링크 부 조직 적합성 항원 이식편 대 숙주 반응을 피하기로 하였다.
- 기구를 소독하고 수술에 따른 멸균 장갑을 착용하십시오. 케타민 10 ㎎ / ㎖ + 크 실라 1의 Mg 용액의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 /ml의 PBS 중에 희석 (10 g의 체중 당 50 내지 100 μL), 1 mL를 주사기를 사용. 인터 반사의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 수력 Optimune 젤 한 방울을 놓습니다.
참고 :이 솔루션은 즉흥적 준비하고 주입하기 전에 실온에서 예열한다. 마취는 적어도 20 분 동안 지속됩니다. 마취의 정도는 모든 수술 따라 조절되어야한다. 마취는 매 20 분 투여 량의 절반 복강 내 주사에 의해 연장 될 수있다. - 수평 얇은 흐름 후드 아래, 우측에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올 및 10 % 요오드 용액으로 피부에 관한 수술 부위를 소독. 집게 부분으로 바로 뒷다리의 관절 위 2cm의 길이를 따라 마우스 머리. 수술 영역을 면도.
- 메스와 가위가 근육 조직을 절단 한 다음에, 첫 번째, 피부 조직의 절개 1.5 cm 길이를 확인합니다. 절개의 양쪽에 약간의 압력을가, 복강에서 신장을 강제 것이다.
- 촉촉한 신장을 유지하는면 버드와 식염수를 적용합니다. 당신이 장기 노출에 어려움이있는 경우, 신장이 부착 된 주변의 지방 세포 조직을 꺼내 평평한 집게를 사용합니다. 기관 아래에 배치 면봉에 의해 복막 캐비티 중 신장을 유지한다.
- 이 미세 집게로, (출혈을 방지하기 위해 실질에 손이 닿지 않도록) 캡슐에서 2~3mm의 구멍을. 전체 수술 중 지속적으로 적신 노출 신장 캡슐을 유지합니다.
- 연 캡슐의 벽을 유지함으로써, 신장 캡슐에서 조심스럽게 로브를 삽입하고 가장자리 극으로 캡슐에서 이식을 밀어 넣습니다. 신장 당 6 로브까지 놓습니다.
- 역 복강의 신장을 교체합니다. 근육 aponeuroses, 개별 외과 매듭 후 피부를 봉합. 10 % 포비돈 요오드 용액으로 상처 젖은. 가열 된 PA에 마우스를 놓습니다37 ° C에서 D.
- 심장, 호흡과 수염 운동, 자기가 볼 총 복구 움직임을 포함 할 때까지 점막 색상의 제어에 의해 마취에서 완전히 회복 될 때까지 이식 한 마우스를 조사.
참고 : 우리는 단지 수술 후 진통제 솔루션 (Buprenorphin, 0.1 ㎎ / ㎏) 내 근육 주사를 추천 2 일 수술 후 통증을 방지하기 위해 수술을 다음과 같습니다. - 완전히 회복 될 때까지 격리에서 운영하는 동물을 유지합니다. 확인하고 감염을 방지하기 위해 매일에게 상처의 바늘을 검사합니다. 이 절차에 따라 창상 감염을 관찰하지 마십시오.
참고 : CD3에서 말초 혈액 세포의 주간 분석 - / - 이식 생쥐 우리가 파생 인구가 CD45 allotypic 마커 및 T 세포 계보 특이 항체 (그림 3)를 사용하여 E13 또는 E18 전구 세포 하나에서 유래 흉선을 감지 할 수 있습니다.
유동 세포 계측법에 의한 TSP의 자손 9. 분석
- 항체 혼합물 CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 퍼시픽 블루, Vγ5 FITC, Vδ1 체육을 인식하는 항체를 포함하고 제 5 절에 설명 된대로 품어 개별 로브에서 얼룩 세포 현탁액.
- HBSS에 + 1 % FCS + 프로피 디움 요오드화물을 세포를 다시 중단하고 (그림 2의 결과를 참조) 사이토 흐름을 분석 할 수 있습니다.
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Representative Results
식민지화 선조의 가장 개발을 허용 내인성 흉선 세포의 흉선 로브를 고갈시키는 방법을 선택하기 위해, 우리는 방사선 조사 후 식민 흉선 로브에서 T 세포 재구성의 수준 또는 5 일 데 옥시 구아노 신 (D-GUA) 치료를 비교 하였다. 결과 배양 9 일째에 아무런 차이가 없을 때, 방사 로브 따라서 일 12시, 조사 후 T 세포의 발달을 얻었다 D-구아 처리보다 더 바람직하고, 또한 D-구아 처리보다 더 T 세포를 함유하는 것으로 나타 흉선 식민지 (그림 1). E13과 E18 TSP의 개발 가능성을 연구하기 위해, 우리는 E14는 전구 세포의 두 가지 유형의 동일한 수의 혼합물로 흉선 로브를 조사 식민지. 결과는 E13의 TSP는 달리 적은 흉선 세포와 E18 TSP 이하 DP하지만,을 야기 할 것으로 보여, E13 TSP는 DETC 및 CD3 +의 높은 주파수 세포 (그림 2) 성숙 생성합니다. 생체 냄비를 분석하려면- / - E13 및 E18 TSP의 ential은, 조상의 각 유형과 식민지 흉선 로브는 CD3의 신장 캡슐에서 이식 된받는 사람. 결과와 일치 FTOC, E13 E18 TSP 빠르게 전구 세포보다 T 세포 초래했다 그러나 순환 T 세포의 수가 현저히 낮은 (도 3)이었다 보여준다.
그림 1 : T 세포 개발, 처리 구아노보다 식민지 흉선 로브 조사에서 더 효율적이다 E14 흉선 로브 (CD45.2) 있었다 중 30 Gy를 조사 또는 옥시 구아노 신 (D-GUA) 5 일 동안 처리 하였다.. 필터에 48 시간 동안 드롭 배양 매달려에, CD117 + 무서-1 CD45.1 / 2 배아에서 분리 + (LSK) E14 플로리다 세포 - 흉선 로브는 다음 1000 린과 식민지했다. 차이는 EN의 효율을 관찰되지 않았다흉선 로브의 두 그룹 사이의 dogenous 흉선 세포 고갈. CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 및 CD4에 대한 항체로 염색 흉선 세포를 개발하는 것은 외과로 하루 9, 12에서 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : E18 대조적으로, E13의 TSP 생성 Vγ5Vδ1 DETC CD45.2의 흉선 로브는 조사 및 CD45.1 배아에서 CD45.1 / 2 배아에서 500 E13 TSP 500 E18 TSP의 혼합 일대로 48 시간 동안 식민지가되었다. . 이러한 실험 조건에서, E13 및 E18 TSP는 세포 고유의 생물학적 차이를 반영 할 수있는 동일한 환경과 문화 후에 관찰 분화와 성숙 T 세포 하위 집합의 비율의 차이에 개발속성. 개인 로브에서 문화 흉선 12 날은 세포 계측법 항체, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1 CD45.1을 인식 염색 후 흐름에 의해 분석 하였다 후. (A) 각 패널 로브에서 회수 된 세포의 수를 나타낸다. (B) 프로파일 세포 계측법 대표 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : E13의 TSP보다 빠르게 개발 E18의 TSP CD45.2의 흉선 로브는 조사 500 E13 TSP 또는 CD45.1 배아에서 500 E18 TSP 48 시간 동안 식민지가되었다.. CD3는 - / - 마우스는 E13 또는 E18의 TSP 중 하나와 식민지 4 흉선 로브로 이식되었다. 말초 혈액 매주 간격으로 수집 할 일에 대한 FACS로 분석 하였다도 (CD45.1) CD3 + T 세포는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1 단계 | E18 배아 (일 -21)를 얻기 위해 마우스를 짝짓기; E14 배아 (일 -17)를 얻기 위해 마우스를 짝짓기; E13 배아를 얻기 위해 마우스를 짝짓기 (일 -16) | ||
| 단계 2A | 배아의 해부, 일 -2 | ||
| 2b 단계 | E14 흉선 로브의 조사, 일 -2 | ||
| 2c 단계 | , 염색을 준비하고, E13 및 E18에서 세포를 분류 흉선 로브, 일 -2 | ||
| 2d 단계 | 매달려 드롭 문화, 일 -2 | ||
| 3a 단계 | 태아 흉선 오르간 문화, 하루 0 | ||
| 3b 단계 | 신장 캡슐에서 이식, 0 일 | 4 단계 | FTOC : 유동 세포 계측법 분석, 12 일 |
| 5 단계 | 그라프 : T 세포 순환 유동 세포 계측법 분석 주간, 15 일, 22 일, 35 |
표 1. 5 단계 절차가 그래프트 된 마우스의 분석까지 상이한 마우스 균주에서 결합 실험의 실험 시간 테이블에 따랐다. 이식 7 주 된 쥐에서 수행됩니다. 일 0으로 이식의 시간을내어, 일 -21은 E18 배아를 얻기 위해 마우스의 결합, E14 배아를 얻기 위해 일 -17, E13 배아를 얻기 위해 일 -16, 일에 -2 E13 및 E18 TSP의 정렬입니다 , 조사 흉선 로브 앤 드롭 기술을 걸려.
| 항체 | 클론 번호 | 항체 | 클론 번호 | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | 테르 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK (136) | |
| CD117 | 2B8 | 중 CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | GR1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6.7 | SCA-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | (104) | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
표 2 : 항체와 클론 번호.
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Discussion
두 가지 주요 분석은 T 세포의 생체 외 분화를 분석하는데 사용될 수있다. 가장 최근에보고 된 1 또는 4 내지 12 등 Noth1의 리간드, 델타 표현 BM 간질 세포 OP9 조혈 전구 세포의 공 배양된다.이 2-D 분석은에서 분석을 가능하게 고효율 민감한 수행하기 쉬운 단일 세포 수준. 그러나, 어느 쪽도 흉선 상피 세포와 직접 상호 작용을 필요로 둘 (DP)의 무대도 γδ DETC (13)의 생성, 이후 T 세포 개발을 지원합니다.
FTOCs 긴 T 세포 발달 3을 분석하는데 사용되어왔다. 이 분석의 주요 강도 모두의 발생이 T 세포 구획, 흉선 상피 세포와 흉선 세포의 효율적인 3-D 상호 작용에 의해 부여 된 특성을 성숙하게된다. 우리는 여기서 두 가지 방법으로 현재, 따라서 외생 적 조상으로 효율적인 식민지를 허용 내생 흉선 세포를 고갈하는 데 사용 테스트. 모두 이온화 조사 및 구아노 처리를 효율적으로 흉선 세포를 개발 고갈. 단, 조사 흉선 로브 또한 상피 구획의 성분에 영향을 미칠 수있는 그 D-구아 처리 시사 더 오랫동안 강력한 T 세포의 발달을 지속. 배아 흉선 로브는 "매달려 드롭"방법을 사용하여 외생 조상의 식민지가되었다. 경쟁에서 모두 인구 조사 로브의 식민지화는 다른 세포 자치 생물학적 특성을 검출 허용한다. TSP 서브 세트 하나만을 가진 콜로니는 비경쟁 환경에서 분화 능력을 보여준다.
이 방법의 단점은 OP9Dl 공동 배양 물 (14)에 비해서 T 세포로 발달 TSP의 주파수에서 낮은 효율이다. 그러나 우리는 가까운 기질 세포로 얻은 것과 효율적으로 개별 흉선 로브를 식민지화하는 단일 DN1 또는 DN2 세포를 수행했다. 10 배 reductioFL 또는 BM 조혈 전구 세포가 배양 등 OP9 델타 관찰되지 FTOC 사용될 때 N T 세포의 생산 효율에서 발견된다. 이 덜 효율적인 개발은 T 세포의 가능성이있는 모든 BM 또는 플로리다 세포가 흉선을 식민지화 할 수없는 제안합니다.
식민지 흉선 로브를 접목하는 것은 FTOC보다 thymi 개발에 더 나은 영양과 산소를 공급하고, 생체 내에서, TSP의 자손의 운명을 수행 할 수있는 가능성을 제공합니다. 이 두 결합 된 전략을 사용하여 우리는 분화와의 TSP의 자손의 기능적인 가능성의 단계를 설명 할 수있다. - / - CD3 때문에 성숙한 T 세포를 개발할 수없는 생쥐 CD45.2 (15), 우리는 CD45 allotypic 차이와 함께, 사용될 수있는 호스트로하고, 명백하게 자연 환경에서 새롭게 생성 된 T 세포를 따르
여기에 설명 된 실험 절차의 신규 한 측면은 재구성 된 FTOC의 조합생체 이식. 이 식별 및 조혈 전구 세포의 정의 된 부분 집합의 자손을 추적 허용했다. 제 1 및 제 2 파가 γδT 세포의 다른 서브 세트, αβT 세포의 다른 번호를 생성 및 분화의 상이한 반응 속도를 가지고에서 우리는 TSP 알았다.
배아 단계 : 일 0 플러그 검출에있어서, 18 시간 마우스의 교배 이후 고려된다. thymi의 해부는 좋은 차가운 빛 150 W, 쌍안 해부 현미경과 해부, 마취 및 이식 절차에 대한 연습이 필요합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
파스퇴르 연구소, INSERM, 직원은 국립 드 공들인 ANR (그랜트 'Lymphopoiesis'), REVIVE 미래를위한 투자 프로그램 및 "contre 르 암 라 리그"에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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