Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em> In Vivo</em> En<em> In Vitro</em> Testen
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Karakteriseren thymus regelen voorlopercellen van belang te begrijpen van de pre-thymus stadia van T cel ontwikkeling essentieel strategieën voor T-cel vervanging lymfopenische patiënten ontwikkelen. We bestudeerden thymus afwikkeling progenitoren murine embryonale dag 13 en 18 thymi twee complementaire in vitro en in vivo technieken, beide gebaseerd op de "opknoping drop" methode. Deze methode toegestaan koloniseren bestraalde foetale thymus lobben met E13 en / of E18 thymus voorlopers onderscheiden door CD45 allotypische markers en dus na hun nageslacht. Kolonisatie met gemengde bevolking maakt het analyseren cel autonome verschillen in de biologische eigenschappen van de voorouders, terwijl kolonisatie met ofwel bevolking verwijdert mogelijk concurrerende selectieve druk. De gekoloniseerde thymus lobben kan ook geënt in mannelijke immunodeficiënte ontvangende muizen waardoor de analyse van het rijpe T cel nakomelingen in vivo, zoals populatiedynamica van tHij perifere immuunsysteem en kolonisatie van verschillende weefsels en organen. Foetale thymus orgaankweken gebleken dat E13 voorlopers snel ontwikkeld in alle volwassen CD3 + cellen en leidde tot de canonieke γδ T cel subsets, zogenaamde dendritische epitheliale T cellen. Ter vergelijking, E18 voorlopers een vertraagde differentiatie en konden dendritische epitheliale T cellen te genereren. De controle van perifeer bloed-thymus geënte CD3 – / – muizen voorts gebleken dat E18 thymus regelen voorlopers genereren, tijd, grotere aantallen mature T cellen dan hun tegenhangers E13, een eigenschap die niet konden worden gewaardeerd in de foetale thymus korte termijn orgaankweken.
Introduction
T-lymfocyten, met het αβ of γδ T-celreceptor (TCR), differentiëren in een gespecialiseerd orgaan, de thymus. De volledig ontwikkelde thymus is georganiseerd in twee verschillende gebieden: de cortex, waar de thymus voorouders ontwikkelen en waar de thymocytes dat productief herschikken de TcR β en α-keten genen worden gered van de dood geprogrammeerd (een proces dat bekend staat als positieve selectie); en het merg, waar de geselecteerde thymocyten met te sterke reactiviteit op self-liganden worden verwijderd (negatieve selectie) 1,2. De thymus is afkomstig van de endodermale laag van het derde faryngeale zak die later wordt omgeven door mesenchymale cellen 3. Het wordt gekoloniseerd door hematopoëtische voorlopercellen vanaf embryonale dag E12 en daarna continu rekrutering vereist voor normale T-cel ontwikkeling 4. Thymus immigranten evolueren door opeenvolgende ontwikkelingsstadia, georkestreerd door een strak gereguleerde programma, geïnitieerd en maintained door de activering van het Notch signaling pathway op thymocyten na interactie met zijn ligand, zoals delta 4, uitgedrukt op thymus epitheelcellen (TEC) 5.
Thymocyt ontwikkeling begint bij de zogenaamde CD4 – CD8 – dubbele ontkenning (DN) stadia. DN thymocyten kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de expressie van CD25 en CD44 in DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) en DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) en CD117 (c-Kit) verdeelt verder de DN1 compartiment in 5 subgroepen, waar DN1a en b overeen met het begin van de thymus voorlopercellen (ETP). Thymocyten herschikken de TcR δ, β en α-ketens in de DN podium en ondergaan vooraf TcR selectie (DN3-DN4 stages). Ze verdere doorvoer naar de CD4 + CD8 + dubbele positieve (DP) compartiment waar de TcR α-keten herschikt voorafgaand aan positieve en negatieve Selectie. In dit stadium meeste thymocyten worden geëlimineerd en slechts een klein percentage (3-5%) bereikt de CD4 + of CD8 + rijpe T cel compartiment.
De lymfoïde differentiatie pad vordert door de stadia van HSC dat multipotente voorlopercellen (MPP) en lymfoïde primer multipotente voorlopercellen (LMPP) dat de erytrocyten en megakaryocyt potentiële 6 verloren genereren. LMPP wordt fenotypisch gedefinieerd door de afwezigheid van gedifferentieerde bloedcellen markers (lineage negatief, Lin -), de expressie van c-Kit (CD117), Sca-1 en Flt3 / flk2 (CD135) en de afwezigheid van detecteerbare niveaus van interleukine ( IL) -7 receptor α-keten (IL-7rα of CD127). LMPPs verder te differentiëren in gewone lymfoïde voorlopers (CLP) 7, dat door die fase de capaciteit om myeloïde cellen te genereren hebben verloren. CLP behouden lymfocyten (B- en T-cel), NK cellen, DC en aangeboren lymfoïde cellen (ILC) potentieel en verschillen van LMPP door de expressie van CD127 en de afwezigheid van hoge niveaus van Sca-1.
Hoewel de aard van de thymus afwikkeling voorlopers (TSP) is uitvoerig besproken 8, onlangs duidelijk geworden dat TSP verandering fenotype, differentiatiepotentieel en functie, tijdens de ontwikkeling 9. We voerden in vitro en in vivo assays voor het TSP, geïsoleerd door FACS celsortering van ofwel E13 (eerste golf) of E18 (tweede golf) te karakteriseren. Foetale thymus orgel culturen (FTOC) met bestraalde thymus lobben gekoloniseerd door gelijke aantallen van E13 en E18 voorouders, dragen verschillende allotypische markers, mogen na hun nakomelingen in een soortgelijke ontwikkeling milieu en onthulde cel intrinsieke eigenschappen, verschillende tussen beide soorten voorouders. Thymus lobben gekoloniseerd door ofwel E13 of E18 TSP toegestaan ontwikkeling zonder selectie als gevolg van concurrentie tussen beide voorouders. In vivo transplantatie van de gekoloniseerde thymus lobben toonde verder aan dat ook thij volwassen nakomelingen van E13 en E18 TSP hebben verschillende biologische eigenschappen in vivo. TSP uit de eerste golf snel genereren van T-cellen, maar aanleiding geven tot lage aantallen αβ en γδ T-cellen. Onder de laatste detecteerden we Vγ5Vδ1 dendritische epitheliale T-cellen (DETC), dat een invariant TcR, migreren naar de opperhuid waar ze uitoefenen van een functie in wondgenezing en worden alleen geproduceerd tijdens de embryonale ontwikkeling 10. Daarentegen TSP van de tweede fase langer duren om grote aantallen TcR + T-cellen te genereren en niet kunnen DETC genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Twee belangrijke testen kunnen worden gebruikt om T-celdifferentiatie ex vivo te analyseren. De laatst gerapporteerde de co-cultuur van hematopoiëtische progenitors met BM stromale cellen, OP9, de uiting van de liganden van Noth1, delta zoals 1 of 4 12. Het 2-D test is gemakkelijk uit te voeren zeer efficiënte en gevoelige, waardoor analyse op de single cell niveau. Echter geen ondersteuning T cel ontwikkeling dan het stadium van DP noch de vorming van γδ DETC 13, die beide vereisen di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door het Instituut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'lymfopoiese'), de Revive Future Investment Program en "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
