Abstract
Karakteriseren thymus regelen voorlopercellen van belang te begrijpen van de pre-thymus stadia van T cel ontwikkeling essentieel strategieën voor T-cel vervanging lymfopenische patiënten ontwikkelen. We bestudeerden thymus afwikkeling progenitoren murine embryonale dag 13 en 18 thymi twee complementaire in vitro en in vivo technieken, beide gebaseerd op de "opknoping drop" methode. Deze methode toegestaan koloniseren bestraalde foetale thymus lobben met E13 en / of E18 thymus voorlopers onderscheiden door CD45 allotypische markers en dus na hun nageslacht. Kolonisatie met gemengde bevolking maakt het analyseren cel autonome verschillen in de biologische eigenschappen van de voorouders, terwijl kolonisatie met ofwel bevolking verwijdert mogelijk concurrerende selectieve druk. De gekoloniseerde thymus lobben kan ook geënt in mannelijke immunodeficiënte ontvangende muizen waardoor de analyse van het rijpe T cel nakomelingen in vivo, zoals populatiedynamica van tHij perifere immuunsysteem en kolonisatie van verschillende weefsels en organen. Foetale thymus orgaankweken gebleken dat E13 voorlopers snel ontwikkeld in alle volwassen CD3 + cellen en leidde tot de canonieke γδ T cel subsets, zogenaamde dendritische epitheliale T cellen. Ter vergelijking, E18 voorlopers een vertraagde differentiatie en konden dendritische epitheliale T cellen te genereren. De controle van perifeer bloed-thymus geënte CD3 - / - muizen voorts gebleken dat E18 thymus regelen voorlopers genereren, tijd, grotere aantallen mature T cellen dan hun tegenhangers E13, een eigenschap die niet konden worden gewaardeerd in de foetale thymus korte termijn orgaankweken.
Introduction
T-lymfocyten, met het αβ of γδ T-celreceptor (TCR), differentiëren in een gespecialiseerd orgaan, de thymus. De volledig ontwikkelde thymus is georganiseerd in twee verschillende gebieden: de cortex, waar de thymus voorouders ontwikkelen en waar de thymocytes dat productief herschikken de TcR β en α-keten genen worden gered van de dood geprogrammeerd (een proces dat bekend staat als positieve selectie); en het merg, waar de geselecteerde thymocyten met te sterke reactiviteit op self-liganden worden verwijderd (negatieve selectie) 1,2. De thymus is afkomstig van de endodermale laag van het derde faryngeale zak die later wordt omgeven door mesenchymale cellen 3. Het wordt gekoloniseerd door hematopoëtische voorlopercellen vanaf embryonale dag E12 en daarna continu rekrutering vereist voor normale T-cel ontwikkeling 4. Thymus immigranten evolueren door opeenvolgende ontwikkelingsstadia, georkestreerd door een strak gereguleerde programma, geïnitieerd en maintained door de activering van het Notch signaling pathway op thymocyten na interactie met zijn ligand, zoals delta 4, uitgedrukt op thymus epitheelcellen (TEC) 5.
Thymocyt ontwikkeling begint bij de zogenaamde CD4 - CD8 - dubbele ontkenning (DN) stadia. DN thymocyten kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de expressie van CD25 en CD44 in DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) en DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) en CD117 (c-Kit) verdeelt verder de DN1 compartiment in 5 subgroepen, waar DN1a en b overeen met het begin van de thymus voorlopercellen (ETP). Thymocyten herschikken de TcR δ, β en α-ketens in de DN podium en ondergaan vooraf TcR selectie (DN3-DN4 stages). Ze verdere doorvoer naar de CD4 + CD8 + dubbele positieve (DP) compartiment waar de TcR α-keten herschikt voorafgaand aan positieve en negatieve Selectie. In dit stadium meeste thymocyten worden geëlimineerd en slechts een klein percentage (3-5%) bereikt de CD4 + of CD8 + rijpe T cel compartiment.
De lymfoïde differentiatie pad vordert door de stadia van HSC dat multipotente voorlopercellen (MPP) en lymfoïde primer multipotente voorlopercellen (LMPP) dat de erytrocyten en megakaryocyt potentiële 6 verloren genereren. LMPP wordt fenotypisch gedefinieerd door de afwezigheid van gedifferentieerde bloedcellen markers (lineage negatief, Lin -), de expressie van c-Kit (CD117), Sca-1 en Flt3 / flk2 (CD135) en de afwezigheid van detecteerbare niveaus van interleukine ( IL) -7 receptor α-keten (IL-7rα of CD127). LMPPs verder te differentiëren in gewone lymfoïde voorlopers (CLP) 7, dat door die fase de capaciteit om myeloïde cellen te genereren hebben verloren. CLP behouden lymfocyten (B- en T-cel), NK cellen, DC en aangeboren lymfoïde cellen (ILC) potentieel en verschillen van LMPP door de expressie van CD127 en de afwezigheid van hoge niveaus van Sca-1.
Hoewel de aard van de thymus afwikkeling voorlopers (TSP) is uitvoerig besproken 8, onlangs duidelijk geworden dat TSP verandering fenotype, differentiatiepotentieel en functie, tijdens de ontwikkeling 9. We voerden in vitro en in vivo assays voor het TSP, geïsoleerd door FACS celsortering van ofwel E13 (eerste golf) of E18 (tweede golf) te karakteriseren. Foetale thymus orgel culturen (FTOC) met bestraalde thymus lobben gekoloniseerd door gelijke aantallen van E13 en E18 voorouders, dragen verschillende allotypische markers, mogen na hun nakomelingen in een soortgelijke ontwikkeling milieu en onthulde cel intrinsieke eigenschappen, verschillende tussen beide soorten voorouders. Thymus lobben gekoloniseerd door ofwel E13 of E18 TSP toegestaan ontwikkeling zonder selectie als gevolg van concurrentie tussen beide voorouders. In vivo transplantatie van de gekoloniseerde thymus lobben toonde verder aan dat ook thij volwassen nakomelingen van E13 en E18 TSP hebben verschillende biologische eigenschappen in vivo. TSP uit de eerste golf snel genereren van T-cellen, maar aanleiding geven tot lage aantallen αβ en γδ T-cellen. Onder de laatste detecteerden we Vγ5Vδ1 dendritische epitheliale T-cellen (DETC), dat een invariant TcR, migreren naar de opperhuid waar ze uitoefenen van een functie in wondgenezing en worden alleen geproduceerd tijdens de embryonale ontwikkeling 10. Daarentegen TSP van de tweede fase langer duren om grote aantallen TcR + T-cellen te genereren en niet kunnen DETC genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: alle experimenten werden uitgevoerd volgens het Pasteur Instituut Ethic Charter, door het Franse ministerie van Landbouw goedgekeurd en aan de EU-richtlijnen. Een manipulator met een opleiding op kleine knaagdieren chirurgie, gecertificeerd door het Franse ministerie van Landbouw, voert alle chirurgische ingrepen.
OPMERKING: Zie bijlage Tabel 1 toont het 5-stappenplan procedure.
1. Selectie van de embryo's
- Gebruik 36 C57BL / 6 vrouwtjes CD45.2, CD45.1 12 vrouwen, 12 C57BL / 6 mannetjes en CD45.1 12 C57BL / 6 mannetjes CD45.2. Overschrijding van de vrouwen met mannelijk genotype produceert embryo CD45.1 / 2 en CD45.1 gebruikt als bron van TSP of CD45.2 als bron van ontvanger thymus lobben. House alle mannen afzonderlijk.
- Om embryo's voor E18 TSP isolatie te verkrijgen, plaatst u 2 vrouwtjes in een kooi met een mannetje CD45.1 om 6 uur, 21 dagen voor het enten experiment. Controleer de aanwezigheid van een vaginale plug de volgende dag, voor de middag. SepaBeoordeel de aangesloten vrouwtjes.
- Om E14 embryo's te verkrijgen om te worden gekoloniseerd door TSP, herhaalt u de bovenstaande procedure (1.2), het gebruik van mannetjes CD45.2, 17 dagen voor het enten experiment.
- Om embryo's te isoleren E13 TSP krijgen, herhaalt u de bovenstaande procedure (1.2), met behulp van de mannetjes C57BL / 6 CD45.1, 16 dagen voor het enten experiment.
2. Dissection van de embryo's onder een horizontale laminaire stroming Hood
OPMERKING: Twee dagen voor het enten experiment.
- Offer de zwangere vrouwtjes door cervicale dislocatie of door progressieve toediening van CO 2 gas gedurende ten minste 5 min, in een verzadigende gesloten kamer. Zorg voor dood door definitieve arrestatie van cardio-respiratoire bewegingen. Bevochtig de buik met 70% ethanol.
- Maak een longitudinale incisie in de huid op de middenlijn buik en openen door aan de huid elkaar. Open het buikvlies met de pincet en een schaar zonder het aanraken van het spijsverteringskanaal. Trek de gespleten uterons scheiden van de vagina met een schaar.
- Plaats de baarmoeder in een 90 x 15 mm petrischaal met 40-50 ml DPBS en snijd dwars tussen decidua elk embryo's.
- Met de paar fijne tip schaar en een fijne tang verwijder de spier membraan van de baarmoeder, neem de embryo's door te snijden tussen de placenta en de dooierzak, en verwijder de amnios, die met behoud van de embryo's.
- Plaats de embryo's in een petrischaal van 90 x 15 mm bevattende HBSS + 1% foetaal kalfsserum (FCS). Voor embryo's ouder dan E15, verwijder de hoofden met een schaar voordat eventuele verdere dissectie.
3. Isolatie van de Thymus
- Onder de verrekijker vergrootglas, plaatst het embryo, liggend in rugligging (ventrale view), op een nat gaasje beddengoed.
- Steek een tang lengterichting langs het kraakbeen van het borstbeen, knijpen en open de thoracale raster. Met gebogen pincet, trek de thoraxwand opzij te visualiseren de thymic lobben aan weerszijden van de trachea.
- Zorgvuldig houdt elke lob van knijpen onderaan met een fijne pincet en plaats ze in een petrischaal met 1 ml HBSS + 1% FCS. Isoleer de lobben en verwijder omliggende bindweefsel met twee 1 ml injectiespuiten + 26 G ⅜ "naalden, zonder schade aan de capsule.
- Was de lobben in 3 ml HBSS + 1% FCS bloedcellen te elimineren.
OPMERKING: Voor E15, worden thymus lobben aan weerszijden van de luchtpijp en later zekering in het midden van een bi-dementie orgaan vormen.
4. Cell Schorsingen
- Tease apart de lobben onder de binoculaire vergrootglas met twee 26 G naalden bevestigd aan 1 ml injectiespuiten, in HBSS + 1% FCS. Filter de celsuspensie door een nylon mesh.
5. kleuring met fluorescerende antilichamen en Cell Sorting
LET OP: Alle antilichamen zijn eerder getitreerd om een optimale definitie van de bevolking (de titrat verkrijgenion kan variëren met het antilichaam batch).
- Incubeer de thymocyten (E13 of E18) gedurende 15-30 min bij 4 ° C met 100 pi van een cocktail van gebiotinyleerde antilichamen tegen lineage positieve cellen te kleuren (anti-CD19, anti-Gr1, anti-TER119, anti-NK1.1 , anti- CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25).
- Weg te wassen dan antilichamen spin down van de buizen met 4 ml HBSS + 1% FCS bij 280 xg gedurende 7 min, elimineren de supernatant en re-schorsing van de pellet in verse HBSS + 1% FCS. Centrifugeer nogmaals.
- Incubeer de E18-biotine gelabelde cellen met streptavidine microbolletjes gedurende 15 min bij 4 ° C en was de cellen tweemaal in HBSS 1% FCS. Resuspendeer de cellen in 2 ml HBSS + 1% FCS. De meeste E13 thymocyten zijn lineage negatief en dus niet MACS verrijking voorafgaand aan celsortering nodig.
- Laat de cellen in de kolom LS, volgens de instructies van de fabrikant. Wanneer alle celsuspensie ging de kolom toe 2 ml HBSS + 1% FCS. Herstellen van de4 ml van de kolom stromen door en centrifugeer de cellen gedurende 7 minuten bij 280 x g.
- Resuspendeer de pellet van ofwel verarmd E18 of E13 thymocyten in totaal 50 pl van het TSP antilichaam mix (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 APCCy7 en streptavidine Pacific Blue ) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met 4 ml HBSS + 1% FCS en resuspendeer de cellen in 1 ml HBSS + 1% FCS met propidium jodide.
- Sorteer de TSP Lin - CD44 + CD117 + CD24 low CD127 + CD135 + cellen in een FACS (met 4 lasers) op een 1,5 ml buisjes met 200 ul compleet medium + 20% FCS. Gate eerst de cellen op basis van hun grootte en de granulariteit van de FSC en SSC kanalen. Elimineren van dode cellen (kleuring met propidiumjodide), poort uit wambuizen en de score van de fluorescentie in exponentiële schalen. Rond 100 of 600 TSP kan worden verkregen van de ene E13 of een E18 thymus, respectively.
6. Kolonisatie van E14 Thymic Lobes met voorouders: Opknoping Drop Techniek
- Bestralen (30 Grays = 30 Gy) E14 thymus lobben van CD45.2 embryo, 3 uur voor cultuur.
OPMERKING: E14 of E15 thymus lobben met succes gebruikt als ontvanger van T-cel voorlopers. Met ontvanger thymus lobben van latere gestational dagen leidt tot voortijdige necrose vanwege de grotere omvang van het orgaan, terwijl thymus lobben in eerdere zwangerschap dagen ontwikkelen slecht, waarschijnlijk door onvolledige ontwikkeling van de epitheelcellen. - Centrifuge gesorteerd TSP en resuspendeer de cellen in kweekmedium (OPTI-MEM compleet medium met 10% FCS, penicilline (50 eenheden / ml), streptomycine (50 ug / ml) en 2β-mercaptoethanol (50 uM)) dat 35 pi bevatten 500 TSP.
- Plaats een 35 ul druppel celsuspensie elke andere goed van een 60 goed Terasaki plaat.
OPMERKING: 35 pl druppels kunnen smelten wanneer zij in aangrenzende putjes geplaatst. - Plaats een bestraalde kwab op de oppervlakte van elke druppel. Sluit de Terasaki plaat en draai de plaat op zijn kop te laten de cellen bereikt de apicale pool van de daling door de zwaartekracht.
- Raak zachtjes de bovenzijde van de omgekeerde plaat om de lobben te dwingen te schuiven naar de apicale kant van de druppel. Incubeer de omgekeerde Terasaki plaat in een bevochtigde incubator gedurende 48 uur bij 37 ° C + 5% CO2. Na kolonisatie, ofwel cultuur E14 thymi in FTOC 7 of graft onder de nier capsule van een ontvanger volwassen muis 8.
7. Foetale Thymic Organ Cultuur
- Plaats 3 ml compleet medium op een 35 mm petrischaal. Een isopore membraanfilter drijvend op het medium. Plaats de gereconstitueerde lobben aan de rand van het membraan met een pincet (ten hoogste 8 lobben op een membraan).
- Plaats de platen met de thymus lobben in een 90 mm petrischaal, tezamen met een 35 mm schaal, zonder deksel, bevattende 2 ml water, optimale vochtigheid waarborgen. Incubeer 12 dagen bij 37 ° C + 5% CO2.
8. Enten Onder de Nier Capsule onder steriele omstandigheden
OPMERKING: De nierparenchym is omgeven door bindweefsel vormen van een capsule. De sub-capsulaire gebied is bijzonder rijk aan bloed- en lymfevaten waardoor een geschikte omgeving voor de ontwikkeling van transplantaten (bijvoorbeeld thymus lobben, pancreatische eilandjes of pasgeborene harten). Enten wordt meestal op de linker nier omdat het toegankelijker is dan de rechter nier. CD3 - / - mannelijke muizen werden als ontvangers aldus graft versus host reactie veroorzaakt minor histocompatibility antigenen verbonden met het Y-chromosoom voorkomen omdat geslachtsbepaling voordat E15 is niet eenvoudig.
- Steriliseer de instrumenten en draag steriele handschoenen langs de operatie. Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van een oplossing van ketamine 10 mg / ml xylazine + 1 mg /ml verdund in PBS: (50 tot 100 pl per 10 g lichaamsgewicht) met een injectiespuit 1 ml. Controleer anesthesie door het controleren van een gebrek aan interdigitale reflexen. Plaats een druppel van hydro-Optimune gel op elk oog tot droog tijdens anesthesie te voorkomen.
NB: De oplossing moet ex tempore worden voorbereid en opgewarmd op kamertemperatuur vóór de injectie. De verdoving duurt tenminste 20 minuten. De mate van anesthesie moet worden gecontroleerd langs de operatie. De anesthesie kan worden verlengd door intraperitoneale injectie van een halve dosis om de 20 min. - Plaats de muis op zijn rechterzijde, onder een horizontale lamina stroming kap. Steriliseer het chirurgische gebied met 70% ethanol en 10% jodide dermische oplossing. Met een pincet deel van de muis haar langs een 2 cm lengte net boven het gewricht van de achterpoot. Scheer de chirurgische gebied.
- Met een scalpel, maken een incisie van 1,5 cm lengte van de eerste, de huidweefsel, dan met een schaar knippen de spierweefsel. Breng een lichte druk op beide zijden van de incisieDie de nier zal dwingen uit de buikholte.
- Breng een zoutoplossing met een katoenen-knop om de nier vochtig te houden. Als je problemen met het blootstellen van het orgel, met een platte tang te trekken uit de omliggende adipocyte weefsel waarop de nier is bevestigd. Handhaving van de nier uit de retroperitoneale holte door een wattenstaafje aangebracht onder het orgel.
- Met twee fijne tang, maak een 2-3 mm gat in de capsule (vermijd het aanraken van de parenchyma om bloeden te voorkomen). Tijdens de gehele chirurgische procedure houdt de blootgestelde nierkapsel continu bevochtigd.
- Plaats voorzichtig de lobben onder de nierkapsel, door het handhaven van de wand van de capsule geopend en schuif de graft onder de capsule naar de rand paal. Plaats tot 6 lobben per nier.
- Vervang de nier bij de retro-peritoneale holte. Hecht de spier aponeurosen, daarna de huid met individuele chirurg knopen. Bevochtig de wond met 10% jodide povidon oplossing. Plaats de muis op een verwarmde pad bij 37 ° C.
- De enquête van de getransplanteerde muis tot volledig herstel van de anesthesie door het regelen van hart-, ademhalings- en snorhaar bewegingen, mucosale kleuren tot volledig herstel gezien door zelfstandige bewegingen.
OPMERKING: Wij raden injectie van pijnstillende oplossing (Buprenorfine, 0,1 mg / kg) intra spieren vlak na de operatie en de 2 dagen na de ingreep om na de ingreep pijn te voorkomen. - Houd de geopereerde dieren in afzondering tot volledig hersteld. Controleer elke dag de steken van de wond te verifiëren en besmetting te voorkomen. Nooit waargenomen wondinfectie na deze procedure.
OPMERKING: Wekelijkse analyse van perifere bloedcellen van de CD3 - / - muizen geënt toelaten de thymus afgeleide populaties afkomstig van ofwel E13 of E18 progenitors met de CD45 marker en allotypische T-cellijn specifieke antilichamen (Figuur 3) te detecteren.
9. Analyse van het TSP nageslacht door flowcytometrie
- Stain celsuspensies van individuele lobben met een antilichaam mengsel dat antilichamen die CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE en incubeer zoals beschreven in paragraaf 5.
- Resuspendeer de cellen in HBSS + 1% FCS + propidiumjodide en geanalyseerd in een flowcytometer (zie resultaten in Figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een methode thymus lobben van endogene thymocyten waardoor betere ontwikkeling koloniseren progenitors afbrekende kiezen, vergeleken we de niveaus van T-cel reconstitutie thymus lobben gekoloniseerd na bestraling of een 5-daagse deoxy-guanosine (d-Gua) behandeling. De resultaten tonen dat, terwijl er geen verschil op dag 9 van kweek, bestraald kwabben bevatte meer T-cellen dan behandeld met d-Gua, op dag 12. Aldus bestraling geschikter dan d-Gua behandeling om T cel ontwikkeling verzoekt nadat thymus kolonisatie (figuur 1). Om het vermogen van ontwikkeling van E13 en E18 TSP bestuderen we gekoloniseerd E14 bestraald thymus lobben met een mengsel van gelijke hoeveelheden van de twee voorlopers. De resultaten tonen aan dat TSP E13 leiden tot minder thymocyten en DP lager dan E18 TSP maar daarentegen E13 TSP genereren DETC en hogere frequenties van CD3 + rijpe cellen (Figuur 2). Om de in vivo pot analyserentieel van de E13 en E18 TSP, thymus lobben gekoloniseerd met elk type van voorouders werden geënt onder de nier capsule van CD3 - / - ontvangers. De resultaten tonen dat, in overeenstemming met de FTOC, E13 TSP leidde tot T-cellen sneller E18 progenitors maar het aantal circulerende T-cellen was significant lager (Figuur 3).
Figuur 1: T cel ontwikkeling efficiënter dan bestraald in deoxyguanosine behandelde gekoloniseerd thymus lobben E14 thymus lobben (CD45.2) werden hetzij bestraald met 30 Gy of behandeld gedurende 5 dagen met deoxy-guanosine (d-Gua).. Thymus kwabben werden vervolgens gekoloniseerd met 1000 Lin - CD117 + Sca-1 + (LSK) E14 FL cellen geïsoleerd van CD45.1 / 2 embryo's, in opknoping druppel voor 48 uur en gekweekt op een filter. Er werden geen verschillen waargenomen in de efficiëntie van enendogene thymocyt depletie tussen de twee groepen thymus lobben. Het ontwikkelen van thymocyten gekleurd met antilichamen tegen CD45.1, CD45.2, CD3, Vγ5, Vδ1 en CD4 werden op dag 9 en 12 geanalyseerd door FACS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: In tegenstelling tot de E18, E13 TSP genereren Vγ5Vδ1 DETC CD45.2 thymus kwabben werden bestraald en gekoloniseerd voor 48 uur met een gemengde cohort van 500 E13 TSP uit CD45.1 / 2 embryo's en 500 E18 TSP uit CD45.1 embryo's. . Onder deze experimentele omstandigheden, E13 en E18 TSP ontwikkelen in dezelfde omgeving en verschillen in de mate van differentiatie en volwassen T-cel subsets waargenomen na cultuur kan geven alleen verschillen in cel intrinsieke biologischeeigenschappen. Na 12 dagen in kweek thymocyten uit afzonderlijke lobben werden geanalyseerd door flow cytometrie na kleuring met antilichamen die CD45.1, CD45.2, CD4, CD8, CD3, Vγ5, Vδ1. (A) panelen tonen het aantal cellen teruggewonnen in elke lob. (B) vertegenwoordiger flowcytometrie profielen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: E13 TSP ontwikkelen sneller dan E18 TSP CD45.2 thymus kwabben werden bestraald en gekoloniseerd voor 48 uur met 500 E13 TSP of 500 E18 TSP uit CD45.1 embryo's.. CD3 - / - muizen werden geënt met 4 thymus lobben gekoloniseerd met ofwel E13 of E18 TSP. Perifeer bloed werd op wekelijkse intervallen verzameld en door FACS voor doe geanalyseerdnoch (CD45.1) CD3 + T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| stap 1 | Paring muizen E18 embryo's (dag -21) te verkrijgen; paring muizen E14 embryo's (dag -17) te verkrijgen; paring muizen E13 embryo verkrijgen (dag -16) | ||
| stap 2a | Dissectie van de embryo's, dag -2 | ||
| stap 2b | Bestraling van E14 thymus lobben, dag -2 | ||
| stap 2c | Het voorbereiden, vlekken, en sorteren cellen van E13 en E18 thymus lobben, dag -2 | ||
| stap 2d | Opknoping druppel cultuur, dag -2 | ||
| stap 3a | Foetale Thymic Organ Cultuur, dag 0 | ||
| stap 3b | Graft onder de nierkapsel, dag 0 | stap 4 | FTOC: flowcytometrieanalyse, dag 12 |
| stap 5 | Graft: wekelijks flowcytometrie analyse van circulerende T-cellen, dag 15, 22, 35 |
Tabel 1: De 5-stappen procedure in het experiment Tijdschema van het experiment van de dekking van de verschillende muizenstammen tot de analyse van de getransplanteerde muizen.. Enten worden uitgevoerd in 7 weken oude muizen. De tijd van transplantatie dag 0, dag -21 is de kruising van muizen E18 embryo's te verkrijgen, dag -17 tot E14 embryo's te verkrijgen, dag -16 tot E13 embryo's te verkrijgen, en dag -2 het sorteren van E13 en E18 TSP , bestraling thymus kwab en opknoping druppel techniek.
| Antilichaam | Kloon Number | Antilichaam | Kloon Number | |
| CD25 | 7D4 | CD19 | 6D5 | |
| CD44 | IM7 | Ter 119 | TER-119 | |
| CD24 | M1 / 69 | NK1.1 | PK 136 | |
| CD117 | 2B8 | CD11c | HL3 | |
| CD3 | 145-2C11 | Gr1 | RB6-8C5 | |
| CD4 | RM4-5 | GD | eBioGL3 | |
| CD8 | 53-6,7 | Sca-1 | D7 | |
| CD135 | A2F10 | CD45.2 | 104 | |
| CD127 | A7R34 | Ly5.1 | A20 |
Tabel 2: Antilichamen en kloon nummers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Twee belangrijke testen kunnen worden gebruikt om T-celdifferentiatie ex vivo te analyseren. De laatst gerapporteerde de co-cultuur van hematopoiëtische progenitors met BM stromale cellen, OP9, de uiting van de liganden van Noth1, delta zoals 1 of 4 12. Het 2-D test is gemakkelijk uit te voeren zeer efficiënte en gevoelige, waardoor analyse op de single cell niveau. Echter geen ondersteuning T cel ontwikkeling dan het stadium van DP noch de vorming van γδ DETC 13, die beide vereisen directe interacties met de thymus epitheel.
FTOCs zijn lang gebruikt om T-celontwikkeling 3 analyseren. De grote kracht van deze test is waardoor het genereren van alle volwassen T-cel compartimenten, een eigenschap door de efficiënte 3-D interacties van thymocyten met de thymus epitheel verleend. We testen hier twee methoden die momenteel worden gebruikt om endogene thymocytes waardoor efficiënte kolonisatie door exogene voorouders afbrekende. Zowel de ioniserende straling en deoxyguanosine behandeling efficiënt uitgeput ontwikkelen thymocyten. Slechts bestraalde thymus lobben liep een sterke T cel ontwikkeling voor langere tijd suggereert dat d-Gua behandeling kunnen ook invloed componenten van de epitheliale compartiment. Embryonale thymus lobben werden gekoloniseerd door exogene voorouders met behulp van de "opknoping drop" methode. Kolonisatie van bestraalde lobben met beide populaties in de concurrentie maakt het opsporen van andere cel autonome biologische eigenschappen. Kolonisatie met slechts één van de TSP subsets openbaart hun differentiatie capaciteit in een niet-competitieve omgeving.
Het nadeel van deze werkwijze is een lager rendement van de frequentie van TSP die uitgroeien tot T cellen in vergelijking met OP9Dl co-kweken 14. We hebben echter één of DN1 DN2 cellen gedaan individuele thymus lobben koloniseren met efficiëntie dichter bij die verkregen met de stromale cellen. Een tien-voudige reduction efficiency van T-cel productie gevonden bij FL of BM hematopoietische progenitors worden gebruikt voor FTOC die niet wordt waargenomen in de OP9 delta dergelijke kweken. Deze minder efficiënte ontwikkeling blijkt dat niet alle BM of FL cellen met T-cel potentieel kan de thymus koloniseren.
Enten gekoloniseerd thymus lobben biedt een betere voedingsstoffen en zuurstof naar het ontwikkelen thymi dan in FTOC, en de mogelijkheid om het lot van het nageslacht van TSP toepassen, in vivo. Met behulp van deze twee gecombineerde strategieën kunnen we de stappen van differentiatie en functionele mogelijkheden van het nageslacht van TSP beschrijven. Omdat CD3 - / - muizen CD45.2 15, dat mature T-cellen niet kunnen ontwikkelen, werden gebruikt als gastheren, konden met de CD45 allotypische verschillen, volgt ondubbelzinnig de nieuw gegenereerde T cellen in hun natuurlijke omgeving
De nieuwe aspecten van de hier beschreven experimentele procedure is de combinatie van gereconstitueerde FTOCmet in vivo transplantatie. Dit liet het identificeren en opsporen van de nakomelingen van gedefinieerde subsets van hematopoietische voorlopers. We vonden dat TSP uit de eerste en tweede golven genereren verschillende subsets van γδT cellen, verschillende aantallen αβT cellen en hebben verschillende kinetiek van differentiatie.
Fase van het embryo: dag 0 wordt beschouwd 18 uur na de paring van de muizen, de plug detectie. Dissecties van de thymi vereist een goede koude licht van 150 W, een verrekijker dissectie microscoop en wat oefening voor dissecties, anesthesie en graft procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Ondersteund door het Instituut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'lymfopoiese'), de Revive Future Investment Program en "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26 G ⅜" 0.45 x 10 mm syringes with needles | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility actions |
| Ketamine 100 mg/ml (stock solution) | MERIAL | Anesthesic | |
| Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution | AXIENCE | Morphinic analgesic | |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | Eye protection | |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fetal calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2-Mercaptoethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine iris scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| 2 pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1x270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R.
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J.
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
