Introduction
Gennem de sidste 30 + år, har fremskridt i immunosuppressive lægemidler formindsket graftafstødning grundet akut afstødning, men kronisk afstødning er fortsat en største udfordring. Det vigtigste manifestation af kronisk hjerte afstødning er transplantation åreforkalkning (TA) 1,2. Denne tilstand er karakteriseret ved intimal hyperplasi og vasomotorisk dysfunktion af allotransplantat arterier og udvikles som følge af immunologisk målretning af endotelceller og glatte muskelceller af modtageren immunsystemet. Den specifikke målretning af graft kar grundet indregning af udenlandske peptid-hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) er fremhævet af udviklingen af TA udelukkende graft arterier, mens besparende vært fartøjer 3. I overensstemmelse med dette er den iagttagelse, at TA ikke forekommer eksperimentelt når modtageren er genetisk identisk til donoren eller når modtageren mangler T- og B-celler 4. Immun-medieret vaskulær beskadigelse og dysfunction forårsager udviklingen af intimal fortykkelse og fibrose, såvel som den afvigende akkumulering af lipider og ECM-proteiner, i TA 5. Intimafortykkelse tendens til at være koncentrisk i hele arterielle træ 4-6. Graft tab og død normalt opstår som et resultat af progressiv iskæmi som følge af luminale okklusion af allotransplantat arterier 4.
I 1991 Mennander et al. 7 banebrydende en aorta indskydning i rotter til model TA. Adskillige grupper har efterfølgende tilpasset denne fremgangsmåde til anvendelse i mus. I denne model allotransplantat aorta segmenter udvikler læsioner, der har funktioner svarende til TA observeret i kliniske transplantationer. Dette omfatter intimafortykkelse kendetegnet ved akkumulering af glatte muskelceller-lignende celler og modtagende leukocytter 7. Løbet af de sidste 2 årtier denne model er blevet anvendt til at generere vigtig indsigt i mekanismerne i vaskulær beskadigelse, afvisning og TA. Det kan være osed til at undersøge spørgsmål vedrørende immun- og vaskulære reaktioner under arteriel patologi. Valget af antigen mismatch påvirker evnen til korrekt behandle disse spørgsmål.
Transplantation tværs komplette MHC barrierer tillader en omfattende evaluering af immunreaktioner, der er kendt for at være involveret i organtransplantation afstødning. Dette omfatter direkte CD4 og CD8 T-celle genkendelse og målretning af fremmed peptid-MHC præsenteret af graft-afledte celler, indirekte CD4 (og muligvis CD8) T-celle genkendelse og målretning af graft-afledte alloantigener præsenteret af modtageren antigen-præsenterende celler, og antistof- medieret anerkendelse af alloantigener på vaskulære celleoverflader 8. Den vaskulære respons på skade i komplette MHC-uoverensstemmende forsøg kan dog være anderledes end observeret klinisk. Johnson et al. 9 viste, at aorta indskydning transplantater transplanteret over et komplet MHC mismatch barriere, de fleste afde neointimale celler er af modtagerens oprindelse og ikke af donor oprindelse. Dette er anderledes end observeret i humane transplantationer, hvor de fleste intimale glatte muskelceller er af donor oprindelse 9,10. At tage højde for denne begrænsning, har alternative forsøgsmodeller, der involverer podning tværs mindre histokompatibilitetsantigen uoverensstemmelser blevet udviklet, som udløser vaskulære reaktioner, der ligger tættere observeret i klinisk transplantation 11. Mens disse alternative modeller giver mulighed for vigtige konklusioner, der skal foretages med hensyn til de vaskulære reaktioner, der driver udviklingen af TA, de immunologiske processer, der forårsager vaskulær afvisning i mindre histokompatibilitetsantigen forkerte transplantater ikke fuldstændig re-kapitulere dem, der forekomme i kliniske omgivelser. For eksempel, er mindre histokompatibilitetsantigener genkendes dårligt af graft reaktive antistoffer 12. I betragtning af de ovenstående betragtninger, er det vigtigt at overveje den patologiske questipå at blive undersøgt, når du vælger den type antigen mismatch anvendes i en aorta indskydning model. Her beskriver vi en detaljeret protokol for murine aorta indskydning podning. Vi beskriver indskydning podning mellem komplette MHC-fejlparrede mus, men den samme protokol bruges til podning på tværs af andre antigen fejlparrede musestammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokollerne i denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af Simon Fraser University dyr pleje etiske udvalg. Brug Balb / cYJ (H2 d) donormus og C57BL / 6 (H2 b) recipientmus at undersøge allogene reaktioner. Mus anvendes til forsøg i alderen 8 til 12 uger. Brug enten kvindelige eller mandlige mus. Syngene kontroller består af aorta segmenter fra C57BL / 6 donorer i C57BL / 6 modtagere.
1. Donor og Modtager Forberedelse
Bemærk: Både donor og modtager er bedøvet, og forberedt før operationen for at minimere iskæmi af transplantatet. Injicerbare anæstetika anvendes i protokollen for at forhindre obstruktion af de animalske nødvendige udstyr til levering af inhalerede anæstetika. Hvis det imidlertid ønskes, inhaleret bedøvelsesmiddel er et hensigtsmæssigt alternativ. Fra den indledende injektion af anæstetika, hele proceduren tager ca. 90 min at fuldføre. Iskæmisk tid af transplantatet er mindre than 30 min.
- Bedøver musen med intraperitoneale injektioner af ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) og xylazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Musen vil blive bedøvet inden for 10 til 15 min. Vurdere dybden af anæstesi ved at klemme den fedtholdige del af dyret trædepude. Administrere 1/3 af den oprindelige dosis af bedøvelsesmidlet cocktail, efter behov, indtil dyret ikke udviser tilbagetrækning refleks. Overvåg respirationsfrekvens nøje efter hver cocktail administreres. Under kirurgi vurdere niveauet af anæstesi hver 15 min ved at klemme den forreste bugvæg med en pincet. Musene skal forblive dybt bedøvet for 60 til 90 min.
- Smør musens øjne med en ophthalmisk salve for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
- Barbere håret så tæt på huden som muligt på den abdominale ventrale region fra midten af thorax til pubis. Vær særlig forsigtig med ikke at nick enhver hud. Brug ikke hårfjerningsmiddel fordi det kan blive absorberet into huden og kan være inflammatoriske.
- Dyret i liggende stilling på et håndklæde over varmebord eller pude.
- Rengør operationsstedet med en indledende krat med 2% klorhexidin. Forbered et stort arbejdsområde for at maksimere det kirurgiske felt. Start skrubning ved midten af det kirurgiske sted og flytte til ydersiden i en lineær eller cirkulær måde. Disponere over gaze. Gentag denne procedure mindst 5 gange mere. Påfør en alkohol prep pad til det samme område. Når alkoholen er tør, forberede rent område med Betadine-opløsning og drapere med steril gaze.
2. End-to-end anastomose Procedure
- Donor Operation
- Oprethold aseptisk teknik under hele operationen. Rengør alle køkkenbordet og kirurgisk bord overflader med 0,5% accelereret hydrogenperoxidopløsning før brug. Wrap og autoklaveres alle kirurgiske instrumenter, gaze, gardiner og kjoler før brug. Kontroller sterilitet af instrumenterne med en dampsterilisator indikator strimmel placeret i hver pakke. Sterile kirurgiske handsker anvendes og bortskaffes mellem operationer. For flere operationer, sterilisere kirurgiske instrumenter mellem anvendelser med det varme glas perle sterilisator.
- Placer donor mus i liggende stilling på en ren, tynd plexiglas bord omviklet med sterilt afdækningsstykke under drift mikroskop ved 8-30X forstørrelse.
- Efter at have sikret tilstrækkelige kirurgisk anæstesi som beskrevet i afsnit 1.1, skal du fortsætte med kirurgi.
- Anvendelse af steril saks, lave en enkelt midtlinje lavere langsgående abdominal incision, fra pubis til xyphoid proces.
- Ved hjælp af en lille retraktor åbne abdominale vægge til at eksponere hulrummet.
- Anvendelse af sterilt bomuld Vippet applikatorer, forsigtigt trække tarmene overlegent til dyrets venstre dække med gaze fugtet med saltopløsning. Flyt de reproduktive organer nedadtil, og find den infrarenale aorta og vena cava inferior (IVC). Moisti de udsatte væv periodisk med saltvandsopløsning.
- Under anvendelse af de medicinske No. 5 pincet, adskille aorta fra IVC, fra niveauet for den venstre nyrearterie til bifurkationen. Bruge 10-0 polyamid monofilament suturer til ligering af små grene nær aorta.
- Når donorens aorta er blevet adskilt fra IVC, mætte beholderen med saltvand, dækker den udsatte hulrum med gaze og sæt donor til side på et sterilt område. Kontrollere status for donoren (respiratoriske og kardiovaskulære funktion, og dybden af bedøvelse) hver 15 min. Begynd opererer på modtageren, isolere aorta som beskrevet nedenfor (trin 2.2.1 til 2.2.7).
- Når modtageren aorta er blevet adskilt fra IVC og der er afsat, returnere donor under mikroskopet. Cross klemme (proksimal og distal til segmentet af interesse) donor aorta, ca. 5 mm fra hinanden, med to 4 mm mikrovaskulære klemmer.
- Brug af Vannas-Tübingen microscissors,transektere en lille graft segment (3 til 4 mm i længde) af den abdominale aorta.
- Anvendelse af en 25 G 5/8 nål fastgjort til en sprøjte, skylle det udskårne aorta med hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning. Sørg spidsen af nålen ikke kommer i kontakt med skibet.
- Placer aorta i hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning på is og der er afsat. Mens stadig under dyb anæstesi, frigive de mikrovaskulære klemmer. Aflive donoren ved afblødning.
- Implantere donorfartøjets inden for 30 minutter af excision. Selv om det er muligt at anvende én donor beholder til flere modtagere ved at udskære et større længde af aorta, holde den iskæmiske tid til mindre end 30 min.
- Modtager Operation
- Oprethold aseptisk teknik under hele operationen, som i donor drift.
- Placer modtageren musen i liggende stilling på en tynd plexiglas bord omviklet med sterilt afdækningsstykke under drift mikroskop ved 8-30X forstørrelse.
- After sikre tilstrækkelig anæstesi, fortsæt med kirurgi, når dyret ikke udviser tilbagetrækning refleks.
- Anvendelse af steril saks, lave en enkelt midtlinje lavere langsgående abdominal incision, fra pubis til xyphoid proces.
- Ved hjælp af en lille retraktor åbne abdominale vægge til at eksponere hulrummet.
- Anvendelse af sterilt bomuld Vippet applikatorer, forsigtigt trække tarmene overlegent til dyrets venstre dække med gaze fugtet med saltopløsning. Flyt de reproduktive organer nedadtil, og find den infrarenale aorta og IVC. Fugt de udsatte væv periodisk med saltvandsopløsning.
- Adskil aorta fra IVC, fra niveauet for den venstre nyrearterie til bifurkationen. Brug om nødvendigt 10-0 polyamid monofilament suturer at ligere de små grene nær aorta.
- Cross klemme (proksimal og distal til segmentet af interesse) aorta, ca. 5 mm fra hinanden, med to 4 mm mikrovaskulære klemmer.
- Under anvendelse af de Vannas-Tübingen microscissors, lave en enkelt vandret aortotomy og resecere et lille segment (ikke mere end 0,5 mm), i den abdominale aorta til at rumme donoren aortagraft.
- Skyl udskåret aorta med hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning. Donoren aortagraft bør være af passende længde til at forbinde modtagerens overskårne aorta ender.
- Placer donor aorta graft i ortotopisk position og anastomose donorens graft ende på modtagerens ende, der matcher den respektive graft anatomiske orientering med den af modtageren.
- Klem forsigtigt tunica externa af fartøjet og krænge det lidt ved hjælp af de medicinske No.5 pincet. Under anvendelse af de pincet, drive nålen fæstnet til 10-0 polyamid monofilament sutur gennem den fulde tykkelse af karvæggen for at sikre donor aortagraft til modtagerens resekterede fartøj. Sørg for, at skibet åbning ikke er lukket på grund af to utilsigtet syning af bagvæggen af beholderen.
- For kontinuerlige masker, sted ophold suturer klokken 9 i både de øvre og nedre ende af transplantatet. Begyndende ved den øvre ende af implantatet fra klokken 3 anastomose de resektion ender med 2 driftsforhold suturer og fastgør suturen til opholdet sutur.
- Flip transplantatet lidt og fortsætte driften sutur til dorsal del af fartøjet, møde oprindelsen ophold sutur. Fastgør uden at anvende meget pres på fartøjet. Gentag sutur for den nederste anastomose.
Bemærk: De afbrudte suturer starter på samme måde som den fortsatte sutur med den undtagelse, at fartøjet er anastomoseret med tre adskilte sting mellem ophold suturer. Anastomose er normalt 20 min.
- Flip transplantatet lidt og fortsætte driften sutur til dorsal del af fartøjet, møde oprindelsen ophold sutur. Fastgør uden at anvende meget pres på fartøjet. Gentag sutur for den nederste anastomose.
- Når anastomose er færdig, slipper den distale mikrovaskulære klemme til at tillade retrograd blodet at strømme og tjekke for lækage af anastomoseres websteder. Hvis der er en lækage, immediately placere et søm til at lukke den defekte site. Hvis der ikke er blødning på de steder, slip derefter den proksimale klemme.
- Undersøge transplantationen og kontrollere, at der er ingen blod obstruktion i implantatet, og de proximale og distale del af modtagerens fartøjet. Kraftig puls mønster i både donorens og modtagerens fartøj er en primær tegn på, at blodet flyder frit. Ved hjælp af tang, forsigtigt fat ene ende af opholdet suturer og krænge skibet at inspicere bagvæggen af beholderen smule.
Bemærk: Der bør ikke være nogen rynkning af karvæggen ved begge ender af de anastomoseres sites. Dårlig blodgennemstrømning efter fjernelse af klemmerne er et tegn på thrombose. - Brug af bomuld tippes applikatorer, returnere tarmene i bughulen.
- Med Castroviejo nåleholder og Graefe pincet den, lukke bugvæggen med 5-0 polypropylen suturer anvender kontinuerlig syning. Luk hudlag med sammesuturer bruger subkutikulær lukning.
- Administrere Torbugesic (1 mg / kg) im umiddelbart efter afslutningen af transplantationen.
- Giv straks, i den rækkefølge, Atipamezol (1 mg / kg), ketoprofen (5 mg / kg) og opvarmet lactat Ringers opløsning subkutant.
- Umiddelbart efter operationen, placere mus i en opvarmet bur under en vand tæppe natten over (12 timer). Under bedøvelse-tilbagebetalingsperioden, placere dyrene alene i en ren, tør uhindret område. Linje buret (autoklaveret) med rene papirhåndklæder og justere temperaturen af vandet tæppe til ca. 20 til 22 ° C. Giver tørre og våde foderpiller ad libitum på buret gulvet.
Bemærk: En vigtig komponent i post-kirurgisk behandling er den observation af dyret og passende intervention, efter behov, under restitution fra anæstesi og kirurgi. Den nødvendige intensitet overvågning vil variere med dyret og kan være større i den umiddelbare bedøvelsesmiddel restitutionsperiode som compared til senere i postoperative opsving. - Løbende overvågning af dyr, der har gennemgået anæstesi overvåges, indtil de kommer sig fuldstændigt. Dyret skal være i stand til at opretholde uden hjælp brystleje og det skal fremstå rolig og fri for smerter, før det kan efterlades uden opsyn.
- Giv Buprenorphin (0,1 mg / kg BID) og ketoprofen (5 mg / kg SID) i en periode på tre dage, både subkutant.
- Overvåg kardiovaskulære og respiratoriske funktion, kropstemperatur, og postoperative smerter eller ubehag under restitution fra anæstesi i mindst tre dage. Kan kræves yderligere behandling, såsom administration af analgetika og andre lægemidler og parenterale væsker til at minimere dehydrering og elektrolyt tab.
- Vurdere resultatet af transplantationen kirurgi ved at observere motorik af bagbenene. Komplet succes af transplantationen indebærer uhindret blodtilførslen til bagben og hale, som bør være øjeblikkelig ved inddrivelse af animal, og fuldstændig helbredelse uden paralyse af bagben på andendagen
3. Tissue Collection
Bemærk: forudbestemt endepunkter spænder fra 3 til 60 dage afhængigt af type analyse ønskes og arten af antigenet mismatch. Generelt intimafortykkelse er robust på dag 30 efter transplantation på tværs komplette MHC uoverensstemmende musestammer.
- Bedøver musen med intraperitoneale injektioner af ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) og xylazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Vurdere dybden af anæstesi ved at klemme den fedtholdige del af dyret trædepude. Fortsæt med kirurgi, når dyret ikke udviser tilbagetrækning refleks.
- Rengør operationsstedet med vand og slutter med 70% alkohol.
- Placer dyret i liggende stilling på en bakke foret med absorberende pude.
- Åbne bughulen med en stor midterlinjen langsgående snit. Placer en selvstændig fastholde retraktor for at blotlægge kaviteten, IVC end den abdominale aorta.
- Forsigtigt adskille det transplanterede donor aorta segment fra den nærliggende IVC anvendelse af et par medicinsk No. 5 pincet. Vær særlig forsigtig med ikke at fratage adventitia af det transplanterede fartøj.
- Eksponere brysthulen ved at skære gennem ribbenene langs begge sider af den thorakale hvirvelsøjle hele vejen til den thorakale indløb. Afspejle den forreste brystvæg overlegent at blotlægge hjertesækken og fastgør brystkassen med et par hæmostat.
- Når hjertet er udsat for, indsætte en 25 G 5/8 nål (fastgjort til en sprøjte) ind i den venstre ventrikel og flugter med 0,1 ml hepariniseret (100 U / ml) saltvandsopløsning.
- Ved hjælp af en saks, fjerne det højre atrium for at tillade blod, hepariniseret saltvand og fiksativ til at forlade kroppen under perfusion. Perfundere dyret med 5 ml 4% paraformaldehyd eller indtil væsken er klart. Fjern hjertet at sikre eutanasi.
- Punktafgifter transplanteret karsegment og fordybe i 4% paraformaldehyd for ikke mere end en time. Indstil det transplanterede skib i oktober (optimal skæring temperatur) matrix og flash fryse. Sektionen fartøjet under en kryostat fastsat til 8 um tykkelse. Stain sektioner med Hæmatoxylin & eosin og / eller Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastik pletten.
4. Morfologisk analyse af udtagne transplantater
Bemærk: TA er karakteriseret ved intimafortykkelse 13. I denne model, intimal fortykkelse og en resulterende reduktion i størrelsen af lumen er reflekterende af alvorligheden af immun-medieret vaskulær beskadigelse. Syngraft kontroller bruges til at bestemme de grundlæggende karakteristika for fartøjer i mangel af allogene immunrespons. Disse kontroller tillader også evaluering af arteriel skader, der opstår som et resultat af den kirurgiske procedure. Der bør ikke være intimafortykkelse i syngrafts.
- At undersøge intimal fortykkelse og luminal okklusion, måle arealet inden for den endotelcellelag, intern elastisk lamina (IEL) og ekstern elastisk lamina (EEL) på elastiske van Gieson farves arterie segmenter med et billedanalyse-software. Parametrene nedenfor kan bruges til at bestemme arterielle ændringer reflekterende af TA.
- Måle den absolutte intimale område: område i det indre elastiske lamina - området inden endothelcellelaget. Dette giver en absolut måling af intima ekspansion, som er kendetegnende for TA.
- Mål den absolutte mediale område: område inden for ekstern elastisk lamina - område i det indre elastiske lamina. Dette giver en absolut måling af medial nedbrydning eller vækst, som lejlighedsvis kan forekomme som et resultat af immunmedierede ændringer i denne region i karvæggen.
- Mål det totale fartøj område som området inden for den ydre elastiske lamina. Dette tilvejebringer en måling af fartøj remodeling der involverer udvidelse eller sammentrækning af arterien som følge af immunologisk skade.
- Målintima / medie: (område i det indre elastiske lamina - område inden endothelcellelaget) / (areal inden for den ydre elastiske lamina - område i det indre elastiske lamina). Dette giver et relativt mål for intimal ekspansion og normaliserer for forskelle i fartøjets størrelse.
- Mål% Luminal Indsnævring: [(område i det indre elastiske lamina - område inden endothelcellelaget) / område med det indre elastiske lamina)] * 100. Dette giver et mål for omfanget af luminal okklusion, der skyldes en kombination af intimal ekspansion og remodellering (aktiv eller passiv) af karvæggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne model er den abdominale aorta fra en Balb / cYJ mus indskudt i den infrarenale aorta af en C57BL / 6 modtager. Dette tillader en omfattende evaluering af alloimmune reaktioner, der er målrettet allotransplantat arterier. Immun-medieret vaskulær beskadigelse i denne model initierer vaskulære reparative reaktioner, der kulminerer i intimafortykkelse, luminal indsnævring og rekruttering af immunceller (figur 1 og 2). Disse kriterier således anvendes som udlæsning til alvorligheden af alloimmune responser, vaskulær afstødning, og TA. Vellykket resultat af indgrebet kan vurderes ved udviklingen af robuste intimal fortykkelse af allotransplantat arterie segmenter og fraværet af intimafortykkelse i syngraft kontroller. Klinisk relevant immunosuppression kan anvendes med denne model til mere ligner klinisk transplantation. Denne model kan også anvendes med transgene dyr for at undersøge effekten af specifikke proteiner / veje i alloimmune responser ens vi har gjort 14.
Allotransplantat aorta segmenter udvikle intimafortykkelse
Mængden af immun-medieret allograft vaskulær skade blev undersøgt ved at kvantificere intimafortykkelse og luminale indsnævring i podede aorta segmenter på dag 30 efter transplantationen. Allotransplantat arterie segmenter skaber en stor intimal fortykkelse og luminal okklusion og observeres ingen ændringer i syngraft arterie kontrol segmenter (figur 1).
Ophobning af leukocytter i allotransplantat aorta segmenter.
Ophobningen af leukocytter i allotransplantat arterier blev undersøgt ved kvantificering af antallet af CD4 T-celler, CD8 T-celler og makrofager (Mac-3) 15 ved immunhistokemi. Mac-3 blev anvendt til at farve til makrofager i denne undersøgelse selv om andre markører, såsom F4 / 80, også kan anvendes 16. CD4 T-celler, blev CD8 T-celler og makrofager fundet i intima allotransplantat arterier (figur 2)
Figur 1: Histologisk analyse af podede arterier (A) abdominale aorta segmenter fra syngene og allogene mus blev indskudt i de resektion abdominale aorta hos C57BL / 6-mus.. De podede arterier blev høstet på dag 30 efter transplantation. Repræsentative mikrofotografier af elastisk van Giesen farvede arterier er vist. Scale bar = 0,1 mm = 100 pm (B) Diagram der viser, hvordan de forskellige lag i beholderen måles, L:. Lumen, E: endotel lag, I: intima, M: medier, A:. Adventitia (C) Kvantificering af intima / medie-forholdet og% luminale indsnævres fra 30 dage syngeniske (n = 3) og allogene (n = 6) transplantater, * P <0,05.= "_ Blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immune celleakkumulering i allotransplantat arterier. Repræsentative mikrofotografier af allotransplantat aorta segmenter immunhistokemisk farvet for (A) CD4, (B) CD8, og (C) Mac-3 og modfarvet med hematoxylin er vist. Scale bar = 0,1 mm = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en protokol for aorta indskydning podning på mus, som er nyttigt til undersøgelse immun-medieret vaskulær afstødning og TA. Denne model kan anvendes til at undersøge årsagerne til TA samt udviklingen af nye terapeutiske strategier. Det er blevet anvendt i fortiden for at etablere en væsentlig rolle adaptiv immunitet, cytotoksiske T-celle-responser, cytokin-medieret CD4 T-celle effektor reaktioner og antistof-medieret skade på transplantatet i TA 14,17-21. Artery transplantation i mus er vanskelig på grund af den åbenlyse lille størrelse af dyret; dog med praksis og due diligence, vellykkede indgreb kan opnås. Succes afhænger af åbenheden af fartøjet. Dette indebærer at sikre, at transplantatet ikke beskadiges af forkert håndtering af beholderen med pincet, konstriktion af karhulrummet, suturering bagvæggen af beholderen, og gentagne sutur af det samme sted. Lækage af fartøjet er også problematisk og kræver pleje til ePÍ, at antallet og placeringen af masker er fordelt ligeligt omkring karvæggen. Det er også vigtigt, at graft iskæmi minimeres til mindre end 30 minutter. Med dette, kan en succesrate på mere end 95% skal nås.
Aorta er den største arterie i musen så denne procedure er den enkleste mikrokirurgiske tilgang til undersøgelse vaskulær afstødning i denne model dyr. Også den aortasegment podet i en fysiologisk relevant beliggenhed, oplever normal blodgennemstrømning, og intimafortykkelse udvikler sig hurtigt. Den anden store model, der anvendes til vurdering af vaskulær afvisning og TA er heterotopisk hjertetransplantation, som har den fordel, at den undersøger udviklingen i TA i kranspulsårerne, og i forbindelse med hjertetransplantation, som er den mest relevante kliniske scenario for TA. Imidlertid heterotope hjertetransplantationer anbragt i en ikke-fysiologisk placering i legemet (normalt anastamosed til vena cava ogaorta i underlivet) og hjertet ikke pumpe blod gennem hjertekamrene grund af retrograd karakter af blodforsyningen til det transplanterede hjerte. Som sådan kan arten af blodstrømmen gennem koronar træet være forskellig fra, hvad der normalt opleves af koronar vaskulatur 22,23. Også, at strategier overvinde akut afstødning af hjertet skal indarbejdes for at vurdere arterielle ændringer. I begge modeller er det vigtigt nøje at vælge den type af antigen mismatch udnyttes for at være i stand til på passende vis løse specifikke spørgsmål i forbindelse med vaskulær afvisning og TA.
Sammenfattende aorta indskydning podning er en kraftfuld teknik til undersøgelse immunmedieret arteriel beskadigelse og TA. Det kan rutinemæssigt beherskes med praksis og omhu hos forskeren. Når beherskes, kan denne procedure modificeres til indskydning podning af andre arterielle segmenter, såsom halspulsåren, thved kan undersøgelsen af yderligere videnskabelige spørgsmål. Desuden kan anvendelsen af denne model forlænges ud over studiet af transplantation. Indskydning podning af arterier kan anvendes til at indføre arterielle segmenter fra modificeret (f.eks transgene eller lipid-fodrede) mus til ikke-modificerede modstykker, eller omvendt, for at isolere de biologiske virkninger af molekyler til arterievægceller versus ikke-arterievægceller 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research og Heart and Stroke Foundation of BC & Yukon (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/ml | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/ml | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25 G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27 G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 - Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
