Introduction
I løpet av de siste 30 år, har fremskritt i immundempende medikamenter redusert podingsforkastelse grunn av akutt avstøting men kronisk avvisning er fortsatt en hovedutfordring. Den viktigste manifestasjon av kronisk hjertetransplantasjon avvisning er transplantasjon arteriosklerose (TA) 1,2. Denne tilstanden er karakterisert ved intimal hyperplasi og vasomotorisk dysfunksjon av allograft arterier og utvikler seg som et resultat av immunologisk målretting av endoteliale og glatte muskelceller av mottakeren immunsystemet. Den spesifikke målrettingen av graftet blodkar på grunn av godkjenning av utenlandsk peptid-hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) fremheves av utviklingen av TA utelukkende i pode arterier mens sparsom verts fartøy tre. I tråd med dette er den observasjon at TA ikke skjer eksperimentelt når mottakeren er genetisk identiske med donor eller når mottakeren mangler T- og B-celler 4. Immunmediert vaskulær skade og dysfunction fører til utvikling av intimal fortykning og fibrose, så vel som den avvikende akkumulering av lipider og ECM-proteiner, i TA 5. Intimalfortykning tendens til å være konsentrisk på hele arterielle treet 4-6. Graft tap og død oppstår vanligvis som et resultat av progressiv iskemi som følge av luminal okklusjon av allograft arterier 4.
I 1991 Mennander et al. 7 pioner en aortic inter modell i rotter å modellere TA. Flere grupper har deretter tilpasset denne fremgangsmåten for bruk i mus. I denne modellen allograft aorta segmenter utvikle lesjoner som har egenskaper som kan sammenlignes TA observert i kliniske transplantasjoner. Dette inkluderer intimalfortykning karakterisert ved akkumulering av glatte muskelceller-liknende celler og mottaker leukocytter 7. I løpet av de siste to tiår har denne modellen har blitt brukt til å generere viktig innsikt i mekanismene for vaskulær skade, avvisning og TA. Det kan være ossed å undersøke spørsmål knyttet til immun og vaskulære reaksjoner under arteriell patologi. Valget av antigen mismatch påvirker evne til riktig håndtere disse spørsmålene.
Transplantasjon tvers komplett MHC barrierer tillater en omfattende evaluering av immunresponser som er kjent for å være involvert i organtransplantasjon avvisning. Dette omfatter direkte CD4 og CD8 T-celle anerkjennelse og målretting av utenlandsk peptid-MHC presentert av pode-deriverte celler, indirekte CD4 (og muligens CD8) T-celle anerkjennelse og målretting av pode-avledet alloantigener presenteres av mottakeren antigenpresenterende celler og antistoff mediert anerkjennelse av alloantigener på vaskulære celleoverflater 8. Imidlertid kan den vaskulære respons på skade i et fullstendig MHC-feilaktige forsøk være annerledes enn det som ble observert klinisk. Johnson et al. 9 viste at i aorta inter grafts transplanterte over et komplett MHC mismatch barriere, de fleste avde neointimale cellene er på mottaker opprinnelse og ikke fra donor opprinnelse. Dette er annerledes enn det som ble observert i humane transplantasjoner der de fleste intimale glatte muskelceller er av donor opprinnelse 9,10. Å ta hensyn til denne begrensningen, har alternative eksperimentelle modeller som involverer pode over mindre histocompatibility antigen uoverensstemmelser blitt utviklet som utløser vaskulære reaksjoner som ligne de som ble observert i klinisk transplantasjon 11. Selv om disse alternative modeller tillate viktige konklusjoner å bli gjort om de vaskulære reaksjoner som driver utviklingen av TA, de immunologiske prosesser som forårsaker vaskulære avvisning i moll histocompatibility antigen umake grafts ikke helt re-kapitulere de som forekommer i klinisk setting. For eksempel er mindre histokompatibilitetsantigener anerkjent dårlig av pode reaktive antistoffer 12. Gitt de ovennevnte hensyn, er det viktig å vurdere patologiske questipå å bli undersøkt ved valg av type antigen mismatch brukes i en aortic inter modell. Her beskriver vi en detaljert protokoll for murine aortic inter pode. Vi beskriver inter pode mellom komp MHC-umake mus, men den samme protokollen brukes for pode på tvers av andre antigen feilaktige musestammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokollene i denne studien ble gjennomgått og godkjent av Simon Fraser University dyr omsorg etikkomité. Bruk Balb / cYJ (H2 d) donor-mus og C57BL / 6 (H2 b) resipientmus å undersøke allogene reaksjoner. Mus brukes til eksperimenter i alderen 8 til 12 uker. Bruk enten kvinnelige eller mannlige mus. Syngene kontroller består av aorta-segmenter fra C57Bl / 6 givere i C57BL / 6 mottakere.
1. donor og mottaker Forberedelse
Merk: Både donor og mottaker bedøves og prepareres før kirurgi for å minimal iskemi av graftet. Injiserbare bedøvelsesmidler anvendes i protokollen for å forhindre tilstopping av dyret ved utstyr som er nødvendig for levering av inhalerte anestetika. Imidlertid, hvis ønskelig, er inhalert bedøvelse et hensiktsmessig alternativ. Fra den første injeksjon av bedøvelsesmidlene, tar hele prosedyren omtrent 90 min for å fullføre. Iskemisk tiden av pode er mindre than 30 min.
- Bedøve mus med intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) og xylazin (10 mg / kg, 1 mg / ml). Musen vil bli bedøvet innen 10 til 15 min. Vurdere anestesidybden ved å knipe fettdelen av dyret matte. Administrere 1/3 av den opprinnelige dosen av narkosen cocktail, etter behov, inntil dyret ikke oppviser uttak refleks. Overvåke respirasjonsfrekvens tett etter hver cocktail administreres. Under operasjonen, vurdere nivået av anestesi hvert 15 min ved å knipe den fremre bukveggen med en pinsett. Musene bør forbli dypt bedøvet etter 60 til 90 min.
- Smør muse øyne med en oftalmisk salve for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Barbere håret så nær huden som mulig på mage ventral regionen fra midten av brystkassen til pubis. Vær spesielt forsiktig med å nick noen hud. Ikke bruk hårfjerningskrem fordi det kan bli absorbert inFor huden og kan være provoserende.
- Plasser dyret i liggende stilling på et håndkle over varmebord eller pad.
- Rengjør kirurgiske området med en foreløpig skrubb med 2% klorheksidin. Forberede et stort arbeidsområde for å maksimere kirurgiske feltet. Begynn å skrubbe på midten av det kirurgiske området, og gå ut i friluft i et lineært eller sirkulært. Kast den gasbind. Gjenta denne fremgangsmåten minst fem ganger. Påfør en alkohol prep pad til det samme området. Når alkoholen er tørr, forberede rent område med Betadine løsning og drapere med steril kompress.
2. End-to-end Anastomose Prosedyre
- Donor Operation
- Opprettholde en aseptisk teknikk under hele operasjonen. Rengjør alle benkeplate og kirurgisk bordflater med 0,5% akselerert hydrogen peroxide løsning før bruk. Pakk og autoklav alle kirurgiske instrumenter, trådnett, gardiner og kjoler før bruk. Kontroller sterilitet av instrumentene med dampsterilisator indikator stripe plassert i hver pakke. Sterile operasjonshansker brukes og kastes mellom operasjoner. For flere operasjoner, sterilisere kirurgiske instrumenter mellom bruker med den varme glassperle sterilisator.
- Plasser donor mus i en liggende stilling på et rent, tynt pleksiglass bord pakket med steril drapere under operasjonsmikroskop på 8-30X forstørrelse.
- Etter å sikre tilstrekkelige kirurgisk anestesi som skissert i avsnitt 1.1, fortsette med kirurgi.
- Ved hjelp av steril saks, lage en enkelt midtlinjen nedre lengde abdominal snitt, fra pubis til xyphoid prosessen.
- Ved hjelp av en liten retractor, åpen abdominal vegger å avsløre hulrom.
- Bruk steril bomull tippet applikatorer, forsiktig trekke tarmen overlegent til dyrets venstre og dekk med gasbind fuktet med saltvann. Flytt den reproduktive organer inferiorly og finn infrarenale aorta og vena cava inferior (IVC). Moisti de eksponerte vevet periodisk med saltoppløsning.
- Ved å bruke den medisinske No. 5 tang, separere aorta fra IVC, fra nivået av den venstre nyrearterien til forgreningen. Bruk 10-0 polyamidmonofilament sting for å ligere de små greiner i nærheten av aorta.
- Når donor aorta har blitt separert fra IVC, mette fartøyet med saltvann, dekke den eksponerte hulrom med fuktig gasbind og sett donor til side på et sterilt område. Kontrollere status for donor (respiratoriske og kardiovaskulære funksjon, og anestesidybden) hvert 15 min. Begynn opererer på mottakeren, isolere aorta som beskrevet nedenfor (trinn 2.2.1 til 2.2.7).
- Når mottakeren aorta har blitt separert fra IVC og satt til side, returnere donor under mikroskopet. Cross klemme (proksimale og distale til den delen av interesse) donor aorta, ca 5 mm fra hverandre, med to 4 mm mikrovaskulære klemmer.
- Bruke Vannas-Tübingen microscissors,tvers en liten pode segment (3 til 4 mm i lengde) på den abdominale aorta.
- Ved å bruke en 25 G 5/8 nål festet til en sprøyte, skyll det utskårede aorta med heparinisert (100 U / ml) saltoppløsning. Sikre at nålespissen ikke kommer i kontakt med fartøyet.
- Plasser aorta i heparinisert (100 U / ml) saltløsning på is og satt til side. Mens fortsatt under dyp narkose, slipper de mikrovaskulære klemmer. Avlive donor ved blodtapping.
- Implantat donor fartøyet innen 30 minutter av excision. Selv om det er mulig å anvende en donorbeholder for flere mottakere ved excising en større lengde av aorta, holde den iskemiske tid til mindre enn 30 min.
- Mottaker Operation
- Opprettholde en aseptisk teknikk under hele operasjonen, som i donor drift.
- Plasser mottakeren mus i en liggende stilling på et tynt pleksiglass bord pakket med steril drapere under operasjonsmikroskop på 8-30X forstørrelse.
- After å sikre adekvat anestesi, fortsette med operasjonen når dyret ikke oppviser uttak refleks.
- Ved hjelp av steril saks, lage en enkelt midtlinjen nedre lengde abdominal snitt, fra pubis til xyphoid prosessen.
- Ved hjelp av en liten retractor, åpen abdominal vegger å avsløre hulrom.
- Bruk steril bomull tippet applikatorer, forsiktig trekke tarmen overlegent til dyrets venstre og dekk med gasbind fuktet med saltvann. Flytt den reproduktive organer inferiorly og finn infrarenale aorta og IVC. Fukt utsatte vev periodisk med saltvannsoppløsning.
- Separer aorta fra IVC, fra nivået av den venstre nyrearterien til forgreningen. Om nødvendig, bruk 10-0 polyamidmonofilament sting for å ligere de små greiner i nærheten av aorta.
- Cross klemme (proksimale og distale til den delen av interesse) aorta, ca 5 mm fra hverandre, med to 4 mm mikrovaskulære klemmer.
- Ved hjelp av Vannas-Tubingen microscissors, gjør en enkel horisontal aortotomy og resect et lite segment (ikke mer enn 0,5 mm) i den abdominale aorta for å gi plass til donor pulsåretransplantasjonen.
- Skyll det utskårede aorta med heparinisert (100 U / ml) saltoppløsning. Donorpulsåretransplantasjonen bør være av passende lengde for å koble mottakerens transektert aorta ender.
- Plasser donor aortic graft i orthotopic posisjon og anastomose donor pode ende til mottakerens slutten, matchende den respektive pode anatomisk orientering med at av mottakeren.
- Forsiktig tak tunica externa av fartøyet og vrenge den litt ved hjelp av medisinske No.5 tang. Ved hjelp av pinsett, drive nål festet til 10-0 polyamid-monofilament-sutur gjennom den fulle tykkelse av karveggen for å sikre donor pulsåretransplantasjonen til mottakerens resected fartøy. Vær nøye med å sørge for at fartøyet åpningen ikke er stengt av på grunn to utilsiktet søm av bakveggen av beholderen.
- For kontinuerlige masker, plasser opphold sting på 9:00 i både øvre og nedre enden av pode. Fra den øvre ende av graftet fra tre, anastomose ved reseksjon endene med to løpe suturer og feste suturen til oppholdet sutur.
- Flip pode over og fortsette driften sutur til dorsal del av fartøyet, møte opprinnelsen oppholdet sutur. Fest uten å bruke mye press på fartøyet. Gjenta suturering for nedre anastomose.
Merk: avbrutte suturer starte på samme måte som den kontinuerlige sutur med unntak av at fartøyet anastomoseres med tre adskilte masker mellom opphold sting. Anastomose Tiden er vanligvis 20 min.
- Flip pode over og fortsette driften sutur til dorsal del av fartøyet, møte opprinnelsen oppholdet sutur. Fest uten å bruke mye press på fartøyet. Gjenta suturering for nedre anastomose.
- Når anastomose er ferdig, slipper distal microvascular klemme slik at retrograd blod å flyte og sjekk for lekkasje av anastomoseres nettsteder. Hvis det er en lekkasje, immediately plassere et sting for å lukke den defekte området. Hvis det ikke er blødning på nettstedene, og slipp den proksimale klemme.
- Undersøke transplantasjon og sjekk at det ikke er blod hindring i pode, og den proksimale og distale delen av mottakerens fartøyet. Energisk pulsmønsteret i både donor og mottaker fartøy er en primær indikasjon på at blodet strømmer fritt. Ved hjelp av pinsett, forsiktig gripe en ende av oppholdet suturer og litt vrengning av fartøyet for å inspisere bakveggen av beholderen.
Merk: Det skal ikke rynkes karveggen ved begge ender av anastomoseres områder. Dårlig blodstrøm etter fjerning av klemmene er et tegn på trombose. - Ved hjelp av bomull tippet applikatorer, returnere tarmen i bukhulen.
- Med Castroviejo nålholderen og Græfe tang, lukker bukveggen med 5-0 polypropylen sting ved hjelp av kontinuerlig søm. Lukk huden laget med den sammesting bruker subkutikulær nedleggelse.
- Administrere Torbugesic (1 mg / kg) im umiddelbart etter ferdigstillelse av transplantasjon.
- Gi straks, i den rekkefølgen, Atipamezol (1 mg / kg), ketoprofen (5 mg / kg) og varmet Ringer-laktat oppløsning subkutant.
- Umiddelbart etter operasjonen, plasseres mus i et bur under et oppvarmet vannteppe over natten (12 timer). Under narkosen-utvinning perioden, plassere dyrene alene i en ren, tørr uhindret området. Linje buret (autoklavert) med rene papirhåndklær og justere temperaturen i vannteppe til omtrent 20 til 22 ° C. Gi tørre og våte kibbles ad libitum på buret gulvet.
Merk: En viktig komponent av post-kirurgisk behandling er observasjonen av dyret og passende tiltak, etter behov, under oppvåkning fra anestesi og kirurgi. Den nødvendige intensiteten av overvåking vil variere med dyret, og kan være større i umiddelbar bedøvelse restitusjonsperiode som compared til senere i postoperative utvinning. - Kontinuerlig overvåke dyrene har gjennomgått anestesi overvåkes inntil de blir helt friske. Dyret må være i stand til å opprettholde egen hjelp sternal recumbency og det må vises rolig og fri for smerter før det kan stå uten tilsyn.
- Gi Buprenorfin (0,1 mg / kg to ganger daglig) og ketoprofen (5 mg / kg SID) i en periode på tre dager, både subkutant.
- Overvåk kardiovaskulære og respiratoriske funksjon, kroppstemperatur, og postoperative smerter eller ubehag under oppvåkning fra anestesi i minst tre dager. Ytterligere behandling kan være nødvendig, slik som administrering av analgetika og andre stoffer, og parenterale væsker for å minimalisere tap av dehydrering og elektrolytt.
- Vurdere hvor vellykket transplantasjon kirurgi ved å observere motorisk funksjon av baklemmene. Fullstendig suksess av transplantatet omfatter uhindret blodstrømmen til bakben og hale, som bør være umiddelbart ved utvinning av Animal, og fullstendig gjenvinning uten lammelse av baklemmene på den andre dagen
3. Tissue Collection
Merk: forhåndsbestemt endepunktene varierer 3-60 dager, avhengig av den type analyse som ønskes og naturen av antigenet mismatch. Vanligvis er intimalfortykning robust i dag 30 etter transplantasjon tvers komplett MHC feilaktige musestammer.
- Bedøve mus med intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) og xylazin (10 mg / kg, 1 mg / ml). Vurdere anestesidybden ved å knipe fettdelen av dyret matte. Fortsett med kirurgi når dyret ikke viser tilbaketrekking refleks.
- Rengjør kirurgiske området med vann og slutter med 70% alkohol.
- Plasser dyret i liggende stilling på et brett foret med absorberende puten.
- Åpne bukhulen med en stor midtlinjen langsgående snitt. Plasser en selvholde rullen for å eksponere hulrommet, at en IVCd abdominal aorta.
- Forsiktig skille transplantert donor aortic segment fra nabo IVC hjelp av et par medisinsk No. 5 tang. Vær spesielt forsiktig med å strippe adventitia av transplantert fartøyet.
- Eksponer brysthulen ved å skjære gjennom ribbene langs begge sider av thorax ryggraden helt til thorax innløpet. Reflektere fremre brystveggen overlegent å avdekke hjerteposen og fest brystkasse med et par hemostat.
- Når hjertet eksponeres, sette inn en 25 G nål 5/8 (festet til en sprøyte) inn i den venstre ventrikkel og i flukt med 0,1 ml heparinisert (100 U / ml) saltoppløsning.
- Ved hjelp av en saks, fjerne høyre atrium å tillate blod, heparinisert saltvann, og fikseringsmiddel for å forlate kroppen under perfusjon. Perfuse dyret med 5 ml av 4% paraformaldehyd, eller inntil væsken er klar. Fjern hjertet for å sikre aktiv dødshjelp.
- Vesenet transplantert skipssegmentet og lev i 4% paraformaldehyd for ikke mer enn en time. Sett transplantert fartøyet i OCT (optimal skjæring temperatur) matrise og flash fryse. § fartøyet under en cryostat fastsatt til 8 um tykkelse. Flekke seksjoner med haematoksylin & eosin og / eller Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastisk flekken.
4. morfologisk analyse av transplantat
Merk: TA er karakterisert ved intimalfortykning 13. I denne modellen, intimal fortykning og en resulterende reduksjon i størrelsen av lumen er reflektert av alvorlighetsgraden av immun-mediert vaskulær skade. Syngraft kontrollene brukes til å bestemme baseline karakteristikker av fartøy i fravær av allogene immunresponser. Disse kontrollene også tillater evaluering av arteriell skade som oppstår som et resultat av den kirurgiske prosedyren. Det bør ikke være intimalfortykning i syngrafts.
- For å undersøke intimalfortykning og luminal okklusjon, måle område innenfor endotelcellerlag, innvendig elastisk lamina (IEL) og ekstern elastisk lamina (ål) på elastiske van Gieson farget blod segmenter med en bildeanalyse programvare. Parametrene nedenfor kan benyttes for å bestemme endringer i arterielle reflekterende av TA.
- Mål absolutt intimal området: Området innenfor den interne elastisk lamina - området innenfor endothelial cellelaget. Dette gir et absolutt mål på intimal ekspansjon, som er kjennetegn på TA.
- Mål absolutt mediale området: Området innenfor den ytre elastiske lamina - område innenfor innvendig elastisk lamina. Dette tilveiebringer en absolutt måling av mediale nedbrytning eller vekst, noe som av og til kan forekomme som et resultat av immun-medierte endringer i denne regionen av karveggen.
- Mål total fartøyet området som området innenfor den ytre elastiske lamina. Dette gir et mål på fartøy ombygging som innebærer utvidelse eller innsnevring av arterien som følge av immunologisk skade.
- Målintima / media: (område i det indre elastiske lamina - område innenfor endotelial cellelaget) / (område innenfor den eksterne elastiske lamina - område i det indre elastiske lamina). Dette gir et relativt mål på intima ekspansjon og normaliserer for ulikheter i fartøyets størrelse.
- Mål% Luminal Innsnevring: [(område innenfor innvendig elastisk lamina - område innenfor endotelceller lag) / område med innvendig elastisk lamina)] * 100. Dette gir et mål på graden av luminal okklusjon, som resulterer fra en kombinasjon av intimal ekspansjon og remodellering (innover eller utover) av beholderveggen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne modellen er den abdominale aorta fra en Balb / cYJ mus innskutt inn i infrarenale aorta fra en C57BL / 6 mottaker. Dette muliggjør en omfattende evaluering av alloimmun svar som er rettet mot allograft arterier. Immunmediert vaskulær skade i denne modellen starter vaskulære reparerende tiltak som kulminerer i intimalfortykning, luminal innsnevring og rekruttering av immunceller (figur 1 og 2). Disse kriteriene da tjene som en lese-out for alvorlighetsgraden av alloimmun svar, vaskulær avvisning, og TA. Suksessen av prosedyren kan vurderes ved utvikling av robuste intimalfortykning av allograft arterie segmenter og fraværet av intimalfortykning i syngraft kontroller. Klinisk relevant immunsuppresjon kan brukes med denne modellen å ligne klinisk transplantasjon. Denne modellen kan også benyttes sammen med transgene dyr for å studere effekten av spesifikke proteiner / trasé i alloimmun responser ens vi har gjort 14.
Allograft aorta segmenter utvikle intimalfortykning
Mengden av immunmediert allograft vaskulære skader ble undersøkt ved å tallfeste intimalfortykning og luminal innsnevring i podet aorta segmentene på dag 30 etter transplantasjon. Allograft arterie segmenter utvikle betydelig intimalfortykning og luminal okklusjon og ingen endringer er observert i syngraft kontroll blod segmenter (figur 1).
Akkumulering av leukocytter i allograft aorta segmenter.
Akkumulering av leukocytter i allograft arterier ble undersøkt ved å kvantifisere antallet CD4 CD8 T-celler, T-celler og makrofager (Mac-3) 15 ved immunohistokjemi. Mac-3 ble anvendt for å farge til makrofager i denne undersøkelsen, selv om andre markører, slik som F4 / 80, kan også benyttes 16. CD4 T-celler, ble CD8 T-celler og makrofager detektert i intima av allograft arterier (figur 2)
Figur 1: Histologisk analyse av podet arterier (A) bukaorta segmenter fra syngenisk og allogene mus ble innsatt i de resected mage Aorta av C57BL / 6 mus.. De podet arteriene ble høstet på dag 30 etter transplantasjon. Representative photomicrographs av elastisk van Giesen farget blodårene vises. Skala bar = 0,1 mm = 100 um (B) diagram som viser hvordan de forskjellige lag i beholderen måles, L:. Lumen, E: endotelial lag, I: intima, media: M, A:. Adventitia (C) Kvantifisering av intima / media-forholdet og% luminal innsnevring fra 30 dagers syngen (n = 3) og allogene (n = 6) transplantasjoner, * P <0,05.= "_ Blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immune celle akkumulering i allograft arterier. Representative mikrofotografier av allograft-aorta-segmenter immunhistokjemisk farget for (A) CD4, (B) CD8, og (C) Mac-3 og motfarget med hematoksylin er vist. Scale bar = 0,1 mm = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en protokoll for aorta inter poding i mus som er nyttig for å studere immunformidlet vaskulær avvisning og TA. Denne modellen kan brukes til å undersøke årsakene til TA, så vel som utvikling av nye terapeutiske strategier. Det har blitt brukt tidligere for å etablere en vesentlig rolle for adaptiv immunitet, cytotoksiske T-celleresponser, cytokin-mediert CD4 T-celle-effektor-responser, og antistoff-mediert pode skader i TA 14,17-21. Artery transplantasjon i mus er vanskelig på grunn av den åpenbare lille størrelsen på dyret; men med praksis og due diligence, vellykkede operasjoner kan utføres. Suksess avhenger av åpenheten til fartøyet. Dette innebærer sikrer at transplantatet ikke skades av feilaktig håndtering av fartøyet med tang, innsnevring av årehulrommet, sy bakveggen av beholderen, og repeterende suturering av det samme området. Lekkasje av fartøyet er også problematisk og krever omsorg til eONTROLLER at antallet og posisjonen av maskene er fordelt jevnt rundt beholderveggen. Det er også viktig at pode iskemi minimeres til mindre enn 30 minutter. Med dette kan en suksessrate på mer enn 95% oppnås.
Aorta er den største arterie i mus, så denne prosedyren er den enkleste mikrokirurgisk metode for undersøkelse av vaskulær avvisning i denne modellen dyret. Dessuten er aortic segment podet inn en fysiologisk relevant sted, opplever normal blodstrøm, og intimalfortykning utvikler seg raskt. Den andre hovedmodellen som brukes for vurdering av vaskulær avvisning og TA er heterotop hjertetransplantasjon, som har fordelen av å undersøke utviklingen av TA i koronararteriene og i forbindelse med hjertetransplantasjon som er det mest relevante kliniske scenario for TA. Imidlertid er heterotop hjertetransplantasjoner plassert i en ikke-fysiologisk sted i kroppen (vanligvis anastamosed til vena cava ogaorta i abdomen) og hjertet ikke pumpe blod gjennom ventriklene på grunn av den retrograde arten av blodtilførselen til det transplanterte hjertet. Som sådan, kan arten av blodstrømmen gjennom krans treet være en annen enn det som vanligvis oppleves av den koronare blodkar 22,23. Også, strategier for å overvinne akutt avvisning av hjertet må innarbeides for å evaluere endringer i arterielle. I begge modellene, er det viktig å nøye velge type antigen mismatch benyttes for å være i stand til riktig løse spesifikke spørsmål knyttet til vaskulær avvisning og TA.
Oppsummert er aortic inter pode et kraftig teknikk for å undersøke immunmediert arteriell skade og TA. Det kan bli rutinemessig mestret med praksis og flid på den delen av forskeren. Når mestret, kan denne fremgangsmåten modifiseres for inter poding av andre arterielle segmenter, slik som arteria carotis, thpå kan gjøre det mulig for undersøkelse av flere vitenskapelige spørsmål. Dessuten kan bruk av denne modellen bli utvidet utover studiet av transplantasjon. Inter poding av arterier kan brukes til å introdusere arterielle segmenter fra modifisert (f.eks transgen eller lipid-matet) mus i ikke-modifiserte kolleger, eller vice versa, for å isolere de biologiske effektene av molekyler til blodåreveggen celler versus ikke-arterielle vegg celler 24 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research and Heart and Stroke Foundation of BC & Yukon (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/ml | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/ml | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25 G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27 G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 - Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
