Introduction
In den vergangenen mehr als 30 Jahren haben Fortschritte in der Immunsuppressiva Transplantatabstoßung aufgrund von akuten Abstoßung verringert, sondern chronische Abstoßung bleibt eine zentrale Herausforderung. Die wichtigste Manifestation der chronischen Herztransplantatabstoßung ist Transplantat-Arteriosklerose (TA) 1,2. Dieser Zustand wird durch Intimahyperplasie und vasomotorische Dysfunktion Allotransplantat Arterien charakterisiert und entwickelt sich als Folge der immunologischen Targeting von Endothelzellen und glatte Muskelzellen des Empfängers Immunsystems. Die spezifische Ausrichtung des Transplantats Gefäßsystem durch Anerkennung ausländischer Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ist durch die Entwicklung der TA ausschließlich im Transplantat Arterien hervorgehoben unter Schonung Wirtsgefäßen 3. In diesem Sinne ist die Beobachtung, dass TA nicht experimentell auftreten, wenn der Empfänger genetisch identisch zu dem Spender oder wenn der Empfänger-T-Zellen und B-4 fehlt. Immunvermittelten Gefäßverletzung und dysfunction bewirkt, dass die Entwicklung der Intimaverdickung und Fibrose sowie die aberrant Akkumulation von Lipiden und ECM-Proteine, TA 5. Intimaverdickung neigt während der gesamten arteriellen Baum 4-6 konzentrisch zu sein. Graft Verlust und Tod treten in der Regel als Folge der fortschreitenden Ischämie von Lumen Verschluss der Arterien Allograft 4 resultieren.
Im Jahr 1991 Mennander et al. 7 Pionier eine Aorten Zwischenmodell bei Ratten zu Modell TA. Mehrere Gruppen haben anschließend diese Prozedur für den Einsatz in Mäusen angepasst. In diesem Modell entwickeln Allograft Aortasegmente Läsionen, die Funktionen vergleichbar mit TA in klinischen Transplantationen beobachtet haben. Dies schließt Intimaverdickung die durch die Ansammlung von glatten muskelähnlichen Zellen und Leukozyten Empfänger 7. In den letzten 2 Jahren ist dieses Modell verwendet worden, um wichtige Einblicke in die Mechanismen der Gefäßverletzung, Ablehnung und TA zu erzeugen. Es kann unsed, Fragen an Immun- und Kreislauf-Reaktionen während arterielle Pathologie untersuchen. Die Wahl des Antigens Einstimmung beeinflusst die Fähigkeit, diese Fragen angemessen anzugehen.
Transplantation über komplette MHC Barrieren ermöglicht eine umfassende Bewertung der Immunreaktionen, die bekanntermaßen in Organtransplantatabstoßung beteiligt sein. Dies beinhaltet direkte CD4- und CD8-T-Zell-Erkennung und Ausrichtung der Fremdpeptid-MHC durch Pfropf-abgeleiteten Zellen präsentiert, indirekte CD4 (und möglicherweise CD8) T-Zell-Erkennung und Ausrichtung der Transplantat-Empfänger von abgeleiteten Alloantigene Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, und Antikörper- vermittelte Erkennung Alloantigene auf Gefäßzelloberflächen 8. Jedoch kann die vaskuläre Reaktion auf eine Verletzung im vollständigen MHC-fehlangepaßt Experimenten anders als die klinisch beobachtet wird. Johnson et al. 9 zeigt, daß in Zwischenaortatransplantate in einem vollständigen MHC Mismatch Barriere transplantiert meistendie neointimale Zellen des Empfängers Herkunft und nicht die von Spenderursprung. Dies ist anders als in den Menschen transplantiert wird, wo die meisten der intimalen glatten Muskelzellen von Spenderursprung 9,10 beobachtet. Um diese Einschränkung zu berücksichtigen, haben alternative Versuchsmodellen, die über kleinere Histokompatibilitätsantigen Mismatches Pfropfen beinhalten entwickelt, die Gefäßreaktionen, die mehr ähneln denen in der klinischen Transplantation 11 beobachtet auslösen. Während diese alternative Modelle erlauben wichtige Rückschlüsse auf den Gefäßreaktionen, die die Entwicklung der TA, die immunologischen Prozesse, die vaskuläre Abstoßung in kleinere Histokompatibilitätsantigen mismatched Transplantate verursachen nicht komplett neu kapitulieren solche, die in der klinischen Einstellung auftreten fahren hergestellt werden. Zum Beispiel sind Nebenhistokompatibilitätsantigene schlecht von Transplantat reaktive Antikörper 12 erkannt. Angesichts der vorstehenden Erwägungen ist es wichtig, die pathologische questi betrachtenon untersucht bei der Auswahl der Art des Antigens Fehlanpassung in einem aortischen Zwischenmodell verwendet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Maus-Aortazwischen Pfropfen. Wir beschreiben Zwischen Pfropfung zwischen vollständigen MHC-fehlgepa Mäusen, aber das gleiche Protokoll wird für die Transplantation in andere Antigen mismatched Mausstämme verwendet.
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Protocol
Alle Protokolle in dieser Studie wurden überprüft und von der Simon Fraser University Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt. Verwenden Balb / CYJ (H2 d) Spendermäusen und C57BL / 6 (H2 b) Empfängermäuse zu allogenen Reaktionen zu untersuchen. Mäuse werden für Experimente im Alter von 8 bis 12 Wochen zwischen verwendet. Verwenden Sie entweder weiblichen oder männlichen Mäusen. Syngenen Kontrollen bestehen aus Aortasegmente von C57BL / 6-Geber in C57BL / 6-Empfänger.
1. Spender und Empfänger Vorbereitung
Anmerkung: Sowohl der Spender und Empfänger anästhesiert und vor der Operation bereit, Ischämie des Transplantats zu minimieren. Injizierbare Anästhetika sind in dem Protokoll zur Behinderung der tierischen Nebenanlagen für die Lieferung von inhalativen Anästhetika erforderlich zu verhindern. Wenn gewünscht, ist aber inhalierten Narkose eine geeignete Alternative. Von der anfänglichen Injektion von Anästhetika, wird der gesamte Prozess in etwa 90 min in Anspruch. Ischämische Zeit des Transplantats weniger Than 30 min.
- Betäuben die Maus mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) und Xylazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Die Maus wird innerhalb von 10 bis 15 min sediert werden. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Einklemmen des Fett Teil des Tieres Fuß-Pad. Verwalten 1/3 der ursprünglichen Dosis des Anästhetikums Cocktail, nach Bedarf, bis das Tier nicht Rückzug Reflex aufweisen. Überwachen Sie die Atemfrequenz eng nach jedem Cocktail verabreicht wird. Während der Operation beurteilen das Niveau der Anästhesie alle 15 min durch Einklemmen des vorderen Bauchwand mit einer Pinzette. Die Mäuse sollten tief für 60 bis 90 min narkotisiert bleiben.
- Augen der Maus die Schmieren mit einer Augensalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern.
- Rasieren Haare so nah an der Haut wie möglich auf die Bauch ventralen Region aus der Mitte des Brustkorbs bis zum Schambein. Seien Sie besonders vorsichtig, nicht nick jede Haut. Verwenden Sie keine Enthaarungscreme, weil es i absorbiert werdenNTO die Haut und kann entzündliche sein.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Handtuch über der Heizung Tisch oder Unterlage.
- Reinigen Sie die Operationsstelle mit einer vorläufigen Peeling mit 2% Chlorhexidin. Bereiten Sie einen großen Arbeitsbereich, um das Operationsfeld zu maximieren. Beginnen Schrubben in der Mitte der Operationsstelle und Bewegung nach außen in einer linearen oder zirkulären Art und Weise. Entsorgen Sie die Gaze. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 5 weitere Male. Tragen Sie eine Alkohol prep Pad auf den gleichen Bereich. Sobald der Alkohol trocken ist, bereiten den sauberen Bereich mit Betadine-Lösung und drapieren mit steriler Gaze.
2. End-to-End-Anastomose Ordnung
- Donor Betrieb
- Pflegen aseptische Technik während des gesamten Betriebs. Reinigen Sie alle Arbeitsplatte und OP-Tisch Oberflächen mit 0,5% beschleunigt Wasserstoffperoxidlösung vor der Verwendung. Wickeln und Autoklaven alle chirurgische Instrumente, Gazen, Vorhänge und Kleider vor der Verwendung. Stellen Sie sicher, die Sterilität der Instrumente mit einer DampfSterilisator Indikatorstreifen in jeder Packung platziert. Sterile OP-Handschuhe werden verwendet und der zwischen Operationen angeordnet ist. Für mehrere Operationen, sterilisieren die chirurgischen Instrumente zwischen den Anwendungen mit der heißen Glasperlen Sterilisator.
- Legen Sie die Spendermaus in Rückenlage auf eine saubere, dünne Plexiglasplatte mit sterilen Tuch unter dem Operationsmikroskop bei 8-30X Vergrößerung gewickelt.
- Nachdem eine angemessene chirurgische Anästhesie, wie in Abschnitt 1.1 dargelegt, gehen Sie mit der Operation.
- Mit Hilfe einer sterilen Schere, stellen eine einzige Mittellinie untere Längsbauchschnitt, vom Schambein bis zum Schwertfortsatz.
- Mit einem kleinen Retraktors, öffnen Sie die Bauchwand in den Hohlraum zu entlarven.
- Mit sterilen Wattestäbchen Applikatoren, sanft zurückziehen den Darm souverän an die Tier links und Abdeckung mit Gaze mit Kochsalzlösung angefeuchtet haben. Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane inferior und suchen Sie den infrarenalen Aorta und der unteren Hohlvene (IVC). Moiszehn des freigelegten Gewebes periodisch mit Kochsalzlösung.
- Verwendung der medizinischen No. 5 Zange, trenne die Aorta vom IVC, der Pegel des linken Nierenarterie zur Bifurkation. Verwenden 10-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterialien die kleine Äste in der Nähe von der Aorta zu ligieren.
- Sobald der Geber Aorta aus der IVC getrennt worden ist, zu sättigen, das Gefäß mit Kochsalzlösung, decken Sie die freiliegenden Hohlraum mit feuchten Gaze und legen Sie den Spender zur Seite auf einen sterilen Bereich. Überprüfen Sie den Status des Spenders (Atemwegs- und Herz-Kreislauf-Funktion, und die Tiefe der Anästhesie) alle 15 min. Beginnen, die auf den Empfänger, Isolierung der Aorta wie unten (Schritte 2.2.1 bis 2.2.7) beschrieben.
- Sobald der Empfänger Aorta aus der IVC getrennt worden und zur Seite stellen, geben Sie den Geber unter dem Mikroskop. Kreuzklemme (proximal und distal zu dem Segment von Interesse) der Spender Aorta ungefähr 5 mm voneinander entfernt sind, mit zwei 4 mm mikrovaskulärer Klemmen.
- Mit den Vannas-Tübinger Mikroschere,transect einen kleinen Implantatsegment (3 bis 4 mm in der Länge) der Bauchaorta.
- Unter Verwendung einer 25 G 5/8 Nadel an einer Spritze befestigt ist, spülen Sie die ausgeschnitten Aorta mit Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung. Sicherstellen, dass die Spitze der Nadel nicht in Kontakt mit dem Schiff kommen.
- Platz Aorta in heparinisierten (100 U / ml) Kochsalzlösung auf Eis und beiseite stellen. Noch unter tiefer Narkose, lassen Sie die mikrovaskuläre Schellen. Euthanize den Spender durch Ausbluten.
- Implantieren das abgebende Schiff innerhalb von 30 Minuten der Exzision. Obwohl es möglich ist, eine Spenderbehälter für mehrere Empfänger durch Herausschneiden einer größeren Länge der Aorta zu verwenden, halten Sie die ischämischen Zeit auf weniger als 30 min.
- Empfänger Betrieb
- Pflegen aseptische Technik während des Betriebs, wie in den Geberbetrieb.
- Platzieren Sie den Empfänger der Maus in Rückenlage auf einer dünnen Plexiglasplatte mit sterilen Tuch unter dem Operationsmikroskop bei 8-30X Vergrößerung gewickelt.
- After eine angemessene Betäubung, gehen Sie mit der Operation, wenn das Tier nicht Rückzug Reflex aufweisen.
- Mit Hilfe einer sterilen Schere, stellen eine einzige Mittellinie untere Längsbauchschnitt, vom Schambein bis zum Schwertfortsatz.
- Mit einem kleinen Retraktors, öffnen Sie die Bauchwand in den Hohlraum zu entlarven.
- Mit sterilen Wattestäbchen Applikatoren, sanft zurückziehen den Darm souverän an die Tier links und Abdeckung mit Gaze mit Kochsalzlösung angefeuchtet haben. Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane inferior und suchen Sie den infrarenalen Aorta und die IVC. Befeuchten Sie die freiliegenden Gewebe periodisch mit Kochsalzlösung.
- Trenne die Aorta vom IVC, von der Ebene der linken Nierenarterie zur Bifurkation. Falls erforderlich, verwenden 10-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterialien die kleine Äste in der Nähe von der Aorta zu ligieren.
- Kreuzklemme (proximal und distal zu dem Segment von Interesse) die Aorta ungefähr 5 mm voneinander entfernt, mit zwei 4 mm mikrovaskulärer Klemmen.
- Verwendung der Vannas-Tübingen Mikroscheren, stellen eine einzelne horizontale Aortotomie und resezieren ein kleines Segment (nicht mehr als 0,5 mm) aus der Bauchaorta, den Spender Aortentransplantat aufzunehmen.
- Spülen Sie die ausgeschnitten Aorta mit heparinisierter (100 U / ml) Kochsalzlösung. Der Spender Aortentransplantat sollte von geeigneter Länge zu durchtrennten Enden der Aorta des Empfängers zu verbinden.
- Setzen Sie den Spender Aortentransplantat im orthotopen Position und anastomosieren Transplantat Ende des Spenders auf der Empfängerseite, passend zu den jeweiligen Transplantat anatomischen Orientierung mit dem des Empfängers an.
- Fassen Sie die Tunica externa des Schiffes und umzustülpen es leicht mit den medizinischen No.5 Pinzette. Mit den Zangen, fahren die Nadel an der 10-0 Polyamid-Monofilament Faden durch die gesamte Dicke der Gefäßwand befestigt, um die Spender Aortentransplantat reseziert Gefäß des Empfängers zu sichern. Achten Sie darauf, dass die Gefäßöffnung nicht ausgeschaltet aufgrund t geschlosseno unbeabsichtigte Nähte der Rückwand des Behälters.
- Für kontinuierliche Maschen, legen Nähte bei 9 Uhr in der oberen und unteren Enden des Transplantats. Beginnend am oberen Ende des Transplantats ab 3 Uhr, anastomosieren die reseziert Enden mit 2 Lauf Nähte und sichern Sie die Naht auf die Naht Aufenthalt.
- Flip das Transplantat über und setzen Sie die fortlaufende Naht, einen Teil des Schiffes dorsal, welche den Ursprung Aufenthalt Naht. Befestigen, ohne großen Druck auf das Gefäß. Wiederholen Sie das Nähen für den unteren Anastomose.
Anmerkung: Die Einzelnähten beginnen auf die gleiche Weise wie die fortlaufende Naht, mit der Ausnahme, dass der Behälter mit drei getrennten Stichen zwischen den Haltefäden anastomosiert. Anastomose Zeit beträgt gewöhnlich 20 min.
- Flip das Transplantat über und setzen Sie die fortlaufende Naht, einen Teil des Schiffes dorsal, welche den Ursprung Aufenthalt Naht. Befestigen, ohne großen Druck auf das Gefäß. Wiederholen Sie das Nähen für den unteren Anastomose.
- Sobald die Anastomose abgeschlossen ist, lassen Sie die mikrovaskuläre distale Klemme, damit retrograden Blut zu fließen und überprüfen Sie die Leckage der Anastomose Webseiten. Wenn es eine Leckage immediately legen einen Stich, um den defekten Stelle zu schließen. Wenn es keine Blutungen an den Standorten, lassen Sie die proximale Klemme.
- Untersuchen Sie die Transplantation und überprüfen, dass es keine Blut Hindernis in dem Transplantat und der proximalen und distalen Teil des Schiffes des Empfängers. Kräftigem Impulsmuster sowohl des Spenders und des Empfängers Gefäß ist eine primäre Anzeige, daß das Blut frei fließt. Unter Verwendung der Pinzette vorsichtig greifen ein Ende der Haltefäden und leicht umzustülpen, das Schiff an der Rückwand des Schiffes zu prüfen.
Anmerkung: Es sollte kein Kräuseln der Gefäßwand an den beiden Enden der anastomosiert Seiten besteht. Schlechte Durchblutung nach dem Entfernen der Klemmen ist ein Zeichen der Thrombose. - Verwendung Wattestäbchen Applikatoren, zurück in den Darm in die Bauchhöhle.
- Mit dem Nadelhalter Castroviejo und Graefe Pinzette, schließen Sie die Bauchdecke mit 5-0 Polypropylen Nähte mit Seriennähen. Schließen Sie die Hautschicht mit dem gleichenNähte mit subkutikuläre Verschluss.
- Verabreichen Torbugesic (1 mg / kg) im unmittelbar nach Beendigung der Transplantation.
- Geben sofort, in der Reihenfolge, Atipamezol (1 mg / kg), Ketoprofen (5 mg / kg) und erwärmte Ringer-Lactat-Lösung subkutan.
- Unmittelbar nach der Operation, legen Mäuse in einem beheizten Käfig unter einem Wasser Decke über Nacht (12 h). Während der Narkose-Erholungsphase, legen die Tiere allein in einem sauberen, trockenen unverbauten Gegend. Linie den Käfig (autoklaviert) mit sauberen Papiertüchern und stellen Sie die Temperatur des Wassers, Decke, um etwa 20 bis 22 ° C. Bieten Trocken- und Nass kibbles ad libitum auf dem Käfigboden.
Wichtig: eine wichtige Komponente von postoperativen Betreuung ist die Beobachtung des Tieres und ein entsprechender Eingriff, wenn erforderlich, während der Erholung von der Anästhesie und Chirurgie. Die notwendige Intensität der Überwachung wird mit dem Tier unterscheiden und konnten während der sofortigen Betäubung Erholungsphase als Co größer seinmpared später in postoperative Erholung. - Kontinuierlich Tiere unterzogene Narkose überwacht, bis sie wieder ganz gesund zu überwachen. Das Tier muss in der Lage, ohne fremde Hilfe Brustlage zu halten, und es muss ruhig und schmerzfrei erscheinen, bevor sie unbeaufsichtigt gelassen werden.
- Geben Buprenorphin (0,1 mg / kg BID) und Ketoprofen (5 mg / kg SID) für einen Zeitraum von drei Tagen, sowohl subkutan.
- Überwachen kardiovaskulären und respiratorischen Funktion, Körpertemperatur, und postoperative Schmerzen oder Beschwerden während der Erholung von der Anästhesie für ein Minimum von drei Tagen. Zusätzliche Sorgfalt erforderlich sein kann, wie beispielsweise Analgetika und anderen Drogen, und parenterale Fluide zu Dehydratation und Elektrolytverlust zu minimieren.
- Beurteilen Sie den Erfolg der Transplantationschirurgie durch die Beobachtung der motorischen Funktion der hinteren Gliedmaßen. Voller Erfolg der Transplantation beinhaltet ungehinderten Blutfluss in den hinteren Gliedmaßen und Schwanz, der sofort bei der Wiederherstellung des anim sein sollteal und vollständige Erholung ohne Lähmung der hinteren Gliedmaßen am zweiten Tag
3. Gewebeentnahme
Anmerkung: Vorbestimmte Endpunkte in Abhängigkeit von der Art der gewünschten Analyse und der Natur des Antigens Fehlanpassungsbereich von 3 bis 60 Tagen. Im Allgemeinen ist Intimaverdickung nach der Transplantation über komplette MHC mismatched Mausstämme robust am Tag 30.
- Betäuben die Maus mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (100 mg / kg; 10 mg / ml) und Xylazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Einklemmen des Fett Teil des Tieres Fuß-Pad. Fahren Sie mit der Operation, wenn das Tier nicht Rückzug Reflex aufweisen.
- Reinigen Sie die Operationsstelle mit Wasser und endend mit 70% Alkohol.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem Tablett mit absorbierenden Kissen ausgekleidet.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem großen Mittellinie Längsschnitt. Legen Sie ein Selbsthalter, um den Hohlraum freizulegen, die IVC eind der Bauchaorta.
- Trennen sanft das transplantierte Spender Aortensegment vom benachbarten IVC Verwendung eines Paars von medizinischen No. 5 Pinzette. Seien Sie besonders vorsichtig, nicht zu der Adventitia des transplantierten Gefäß abstreifen.
- Setzen die Brusthöhle durch Schneiden durch die Rippen auf beiden Seiten der Brustwirbelsäule ganzen Weg zu der Brusteinlass. Spiegeln die vorderen Brustwand superior, den Herzbeutel freizulegen und sichern Sie den Brustkorb mit einem Paar von Gefäßklemme.
- Sobald das Herz ausgesetzt ist, legen Sie eine 25 G 5/8 Nadel (an einer Spritze angebracht ist) in den linken Ventrikel und bündig mit 0,1 ml heparinisiertes (100 U / ml) Kochsalzlösung.
- Verwenden Sie eine Schere, entfernen Sie den rechten Vorhof, damit das Blut, heparinisierter Kochsalzlösung, und Fixiermittel, um den Körper während der Perfusion zu verlassen. Perfundieren das Tier mit 5 ml 4% Paraformaldehyd oder bis die Flüssigkeit klar ist. Entfernen Sie die Herzen der Euthanasie zu gewährleisten.
- Excise transplantiert Gefäßsegment und tauchen in 4% paraFormaldehyd nicht mehr als eine Stunde. Stellen Sie die transplantierte Gefäß in OCT (optimale Schnitttemperatur) Matrix und Flash-Freeze. Abschnitt der Behälter unter einem Kryostaten bei 8 um Dicke eingestellt. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin und / oder Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastische Fleck.
4. Morphologische Analyse von Grafts
Anmerkung: TA durch Intimaverdickung 13 gekennzeichnet. In diesem Modell Intimaverdickung und eine resultierende Verringerung der Größe des Lumens reflektierend sind für die Schwere der immunvermittelten Gefäßverletzung. Syngraft Kontrollen werden verwendet, um die Baseline-Charakteristika der Schiffe in der Abwesenheit von allogenen Immunantworten zu bestimmen. Diese Steuerungen ermöglichen auch Auswertung Arterienschädigung, die als Ergebnis des chirurgischen Eingriffs auftritt. Es sollte keine intimale Verdickung in syngrafts sein.
- Um Intimaverdickung und luminale Okklusion prüfen, messen Sie den Bereich innerhalb der EndothelzellenSchicht, innere elastische Lamina (IEL) und auf elastischen van Gieson gefärbt Arterien-Segmente mit einer Bildanalysesoftware externe elastische Lamina (EEL). Die folgenden Parameter können verwendet werden, um den arteriellen Veränderungen widerspiegeln TA zu bestimmen.
- Messen Sie die absolute Intima-Bereich: Bereich innerhalb der innere elastische Lamina - Bereich innerhalb der endothelialen Zellschicht. Dies stellt eine absolute Messung der Intima-Expansion, die das Markenzeichen der TA ist.
- Messen Sie die absolute medialen Bereich: Bereich innerhalb des externen elastischen Lamina - Bereich innerhalb der innere elastische Lamina. Dies liefert eine absolute Messung der medialen Zersetzung oder das Wachstum, die gelegentlich als Folge immunvermittelte Änderungen in diesem Bereich der Gefäßwand auftreten.
- Messen die gesamte Gefäßfläche als der Bereich innerhalb der äußeren elastischen Lamina. Dies stellt eine Messung des Gefäßumbau die Expansion oder Verengung der Arterie infolge der immunologische Schäden beinhaltet.
- Maßnahmedie Intima / Media-: (Gebiet innerhalb der Lamina elastica interna - Bereich innerhalb der endothelialen Zellschicht) / (Fläche innerhalb der externen elastischen Lamina - Bereich innerhalb der inneren elastischen Lamina). Dies liefert ein relatives Maß der intimalen Expansion und normalisiert auf Unterschiede in Gefäßgröße.
- Messung der% Lumeneinengung: [(Fläche innerhalb der Lamina elastica interna - Bereich innerhalb der endothelialen Zellschicht) / Fläche der internen elastischen Lamina)] * 100. Dies liefert ein Maß für das Ausmaß der luminalen Okklusion, die aus einer Kombination der intimalen Expansion und Umbau (innen oder außen) der Gefäßwand führt.
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Representative Results
In diesem Modell wird die Bauchaorta, die von einer Balb / CYJ Maus in der infrarenalen Aorta einer C57BL / 6-Empfänger angeordnet ist. Dies ermöglicht eine umfassende Bewertung der Alloimmune Reaktionen, Transplantat Arterien Ziel. Immunvermittelte Gefäßverletzung in diesem Modell initiiert Gefäß reparative Antworten, die in Verdickung der Intima, Lumeneinengung und die Rekrutierung von Immunzellen gipfeln (Abbildungen 1 und 2). Diese Kriterien dann als Auslese für die Schwere der Alloimmune Antworten, vaskuläre Abstoßung und TA zu dienen. Erfolg des Verfahrens kann durch die Entwicklung von robusten Intimaverdickung Allograft-Arterien-Segmente und die Abwesenheit von Intimaverdickung in syngraft Kontrollen bewertet. Klinisch relevante Immunsuppression kann mit diesem Modell verwendet werden, um stärker ähneln klinischen Transplantation werden. Dieses Modell kann auch mit transgenen Tieren verwendet werden, um die Wirkung von spezifischen Proteinen / Wege in Alloimmune Antworten studieren eins haben wir 14 getan.
Allograft Aortasegmente entwickeln Intimaverdickung
Die Menge des immunvermittelten Transplantatgefäßschäden wurde durch Quantifizierung Intimaverdickung und Lumeneinengung in gepfropft Aortasegmente am Tag 30 nach der Transplantation untersucht. Allograft Arteriensegmente entwickeln signifikante Verdickung der Intima und luminale Okklusion und keine Änderungen in syngraft Steuer Arterien-Segmente (Abbildung 1) beobachtet.
Akkumulation von Leukozyten in Allograft Aortasegmente.
Die Akkumulation von Leukozyten in Allotransplantat Arterien wurde durch Quantifizieren der Anzahl von CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen und Makrophagen (Mac-3) 15 durch Immunhistochemie untersucht. Mac-3 wurde verwendet, um Makrophagen in dieser Studie zu färben, obwohl auch andere Marker wie F4 / 80, 16 können auch verwendet werden. CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen und Makrophagen erfasst der Intima der Arterien Allotransplantat (Figur 2)
Abbildung 1: Die histologische Analyse von gepfropften Arterien (A) Abdominal Aorta Segmente syngene als auch allogene Mäuse wurden in der resezierten abdominale Aorta von C57BL / 6-Mäuse eingefügt ist.. Die gepfropften Arterien wurden am Tag 30 nach der Transplantation geerntet. Repräsentative Mikrophotographien von elastischen van Giesen befleckt Arterien gezeigt. Maßstabsbalken = 0,1 mm = 100 um (B) Schematische Darstellung, wie die unterschiedlichen Schichten der Gefäß gemessen, L:. Lumen, E: Endothelschicht, I: Intima, M: Medium A:. Adventitia (C) Quantifizierung der Intima / Media-Verhältnis und% luminalen Verengung von 30 Tage syngenen (n = 3) und allogene (n = 6) Transplantate, * P <0,05.= "_ Blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Immunzellakkumulation in Allograft Arterien. Repräsentative Mikrofotografien von Allotransplantat Aortasegmente immunhistochemisch auf (A), CD4, (B) CD8 und (C) Mac-3 gefärbt und mit Hämatoxylin gegengefärbt sind gezeigt. Maßstabsbalken = 0,1 mm = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben ein Protokoll für Aorten Zwischen Pfropfung bei Mäusen, die zur Untersuchung von immunvermittelten Gefäßabstoßung und TA beschrieben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Ursachen der TA als auch die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu untersuchen. Es hat in der Vergangenheit verwendet, um eine wesentliche Rolle der adaptiven Immunität, zytotoxische T-Zellreaktionen, Zytokin-vermittelte CD4 T-Zell-Effektor-Reaktionen und Antikörper-vermittelte Transplantatschäden TA 14,17-21 herzustellen. Arterientransplantation bei Mäusen ist schwierig aufgrund der offensichtlich geringen Größe des Tieres; aber mit der Praxis und Due Diligence, können erfolgreiche Operationen durchgeführt werden. Der Erfolg hängt von der Durchgängigkeit des Gefäßes. Dies wird darauf geachtet, dass das Transplantat nicht durch unsachgemäß Handhabung des Gefäßes mit einer Pinzette, Verengung des Gefäßlumens, Annähen der Rückwand des Behälters, und sich wiederholende Vernähung der gleichen Stelle beschädigt wird. Leckage des Schiffes ist ebenfalls problematisch und erfordert Sorgfalt, um ENsure, die die Anzahl und Position der Maschen gleichmäßig um die Gefäßwand unterteilt. Es ist auch wichtig, dass Transplantat Ischämie auf weniger als 30 Minuten, minimiert. Mit diesem kann eine Erfolgsquote von über 95% erreicht werden.
Die Aorta ist die größte Arterie in der Maus so dieses Verfahren ist die einfachste Ansatz zur Untersuchung der mikrochirurgischen Gefäßabstoßung bei diesem Modell Tier. Auch wird die Aortasegment in einer physiologisch relevanten Ort gepfropft erfährt normalen Blutfluss und Intimaverdickung schnell entwickelt. Die andere Hauptmodell für die Beurteilung der Gefäßabstoßung und TA verwendete heterotope Herztransplantation, die den Vorteil der Prüfung der Entwicklung der TA in Koronararterien und im Zusammenhang mit einer Herztransplantation, die am meisten relevanten klinischen Szenario für TA hat. Jedoch werden heterotopen Herztransplantationen in einem nicht-physiologischen Ort innerhalb des Körpers platziert (in der Regel an die Hohlvene anastamosed undAorta in den Bauch) und das Herz nicht Pumpe Blut durch die Herzkammern aufgrund der rückläufigen Art der Blutversorgung in den transplantierten Herzens. Als solches kann die Art der Blutfluss durch die Herzkranz Baum unterscheidet, was normalerweise durch die Koronargefäße 22,23 erlebt werden. Auch Strategien zur Überwindung akute Abstoßung der Herz muß, um arterielle Änderungen auszuwerten eingearbeitet werden. In beiden Modellen ist es wichtig, sorgfältig wählen Sie die Art der damit verwendeten Antigen Missverhältnis in der Lage, spezifische Fragen zu vaskuläre Abstoßung und TA Zusammenhang angemessen anzugehen.
Zusammenfassend ist Aortazwischen Pfropfen eine leistungsfähige Technik für die Untersuchung von immunvermittelten Arterienschädigung und TA. Es kann routinemäßig mit der Praxis und Sorgfalt von Seiten der Forscher bewältigen. Sobald sie beherrscht, kann dieses Verfahren für die Zwischen Pfropfen anderer Arteriensegmenten wie der Arteria carotis, TH modifiziert werdenan kann die Prüfung zusätzlicher wissenschaftlicher Fragestellungen ermöglichen. Auch kann die Verwendung dieses Modells über das Studium der Transplantation verlängert. Zwischen Pfropfung von Arterien verwendet werden, um arterielle Segmente einzuführen aus modifizierten (zB transgene oder Fetten gefütterten) Mäuse in nicht-modifizierten Gegenstücke, oder umgekehrt, um die biologischen Wirkungen der Moleküle an Arterienwandzellen im Vergleich zu nicht-arteriellen Wandzellen 24 zu isolieren, , 25.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes of Health Research und Herz-und Schlaganfall-Stiftung von BC & Yukon (JCC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/ml | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/ml | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25 G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27 G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 - Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
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References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
