Summary

Musemodel for alloimmune-induceret vaskulær Afvisning og Transplant åreforkalkning

Published: May 17, 2015
doi:

Summary

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Abstract

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

Introduction

Gennem de sidste 30 + år, har fremskridt i immunosuppressive lægemidler formindsket graftafstødning grundet akut afstødning, men kronisk afstødning er fortsat en største udfordring. Det vigtigste manifestation af kronisk hjerte afstødning er transplantation åreforkalkning (TA) 1,2. Denne tilstand er karakteriseret ved intimal hyperplasi og vasomotorisk dysfunktion af allotransplantat arterier og udvikles som følge af immunologisk målretning af endotelceller og glatte muskelceller af modtageren immunsystemet. Den specifikke målretning af graft kar grundet indregning af udenlandske peptid-hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) er fremhævet af udviklingen af TA udelukkende graft arterier, mens besparende vært fartøjer 3. I overensstemmelse med dette er den iagttagelse, at TA ikke forekommer eksperimentelt når modtageren er genetisk identisk til donoren eller når modtageren mangler T- og B-celler 4. Immun-medieret vaskulær beskadigelse og dysfunction forårsager udviklingen af intimal fortykkelse og fibrose, såvel som den afvigende akkumulering af lipider og ECM-proteiner, i TA 5. Intimafortykkelse tendens til at være koncentrisk i hele arterielle træ 4-6. Graft tab og død normalt opstår som et resultat af progressiv iskæmi som følge af luminale okklusion af allotransplantat arterier 4.

I 1991 Mennander et al. 7 banebrydende en aorta indskydning i rotter til model TA. Adskillige grupper har efterfølgende tilpasset denne fremgangsmåde til anvendelse i mus. I denne model allotransplantat aorta segmenter udvikler læsioner, der har funktioner svarende til TA observeret i kliniske transplantationer. Dette omfatter intimafortykkelse kendetegnet ved akkumulering af glatte muskelceller-lignende celler og modtagende leukocytter 7. Løbet af de sidste 2 årtier denne model er blevet anvendt til at generere vigtig indsigt i mekanismerne i vaskulær beskadigelse, afvisning og TA. Det kan være osed til at undersøge spørgsmål vedrørende immun- og vaskulære reaktioner under arteriel patologi. Valget af antigen mismatch påvirker evnen til korrekt behandle disse spørgsmål.

Transplantation tværs komplette MHC barrierer tillader en omfattende evaluering af immunreaktioner, der er kendt for at være involveret i organtransplantation afstødning. Dette omfatter direkte CD4 og CD8 T-celle genkendelse og målretning af fremmed peptid-MHC præsenteret af graft-afledte celler, indirekte CD4 (og muligvis CD8) T-celle genkendelse og målretning af graft-afledte alloantigener præsenteret af modtageren antigen-præsenterende celler, og antistof- medieret anerkendelse af alloantigener på vaskulære celleoverflader 8. Den vaskulære respons på skade i komplette MHC-uoverensstemmende forsøg kan dog være anderledes end observeret klinisk. Johnson et al. 9 viste, at aorta indskydning transplantater transplanteret over et komplet MHC mismatch barriere, de fleste afde neointimale celler er af modtagerens oprindelse og ikke af donor oprindelse. Dette er anderledes end observeret i humane transplantationer, hvor de fleste intimale glatte muskelceller er af donor oprindelse 9,10. At tage højde for denne begrænsning, har alternative forsøgsmodeller, der involverer podning tværs mindre histokompatibilitetsantigen uoverensstemmelser blevet udviklet, som udløser vaskulære reaktioner, der ligger tættere observeret i klinisk transplantation 11. Mens disse alternative modeller giver mulighed for vigtige konklusioner, der skal foretages med hensyn til de vaskulære reaktioner, der driver udviklingen af ​​TA, de immunologiske processer, der forårsager vaskulær afvisning i mindre histokompatibilitetsantigen forkerte transplantater ikke fuldstændig re-kapitulere dem, der forekomme i kliniske omgivelser. For eksempel, er mindre histokompatibilitetsantigener genkendes dårligt af graft reaktive antistoffer 12. I betragtning af de ovenstående betragtninger, er det vigtigt at overveje den patologiske questipå at blive undersøgt, når du vælger den type antigen mismatch anvendes i en aorta indskydning model. Her beskriver vi en detaljeret protokol for murine aorta indskydning podning. Vi beskriver indskydning podning mellem komplette MHC-fejlparrede mus, men den samme protokol bruges til podning på tværs af andre antigen fejlparrede musestammer.

Protocol

Alle protokollerne i denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af Simon Fraser University dyr pleje etiske udvalg. Brug Balb / cYJ (H2 d) donormus og C57BL / 6 (H2 b) recipientmus at undersøge allogene reaktioner. Mus anvendes til forsøg i alderen 8 til 12 uger. Brug enten kvindelige eller mandlige mus. Syngene kontroller består af aorta segmenter fra C57BL / 6 donorer i C57BL / 6 modtagere. 1. Donor og Modtager Forberedelse Bemærk: Både donor og modta…

Representative Results

I denne model er den abdominale aorta fra en Balb / cYJ mus indskudt i den infrarenale aorta af en C57BL / 6 modtager. Dette tillader en omfattende evaluering af alloimmune reaktioner, der er målrettet allotransplantat arterier. Immun-medieret vaskulær beskadigelse i denne model initierer vaskulære reparative reaktioner, der kulminerer i intimafortykkelse, luminal indsnævring og rekruttering af immunceller (figur 1 og 2). Disse kriterier således anvendes som udlæsning til alvorlig…

Discussion

Vi har beskrevet en protokol for aorta indskydning podning på mus, som er nyttigt til undersøgelse immun-medieret vaskulær afstødning og TA. Denne model kan anvendes til at undersøge årsagerne til TA samt udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier. Det er blevet anvendt i fortiden for at etablere en væsentlig rolle adaptiv immunitet, cytotoksiske T-celle-responser, cytokin-medieret CD4 T-celle effektor reaktioner og antistof-medieret skade på transplantatet i TA 14,17-21. Artery transplantation …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research og Heart and Stroke Foundation of BC & Yukon (JCC).

Materials

Name  Company Catalogue Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/mL Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/mL Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/mL Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28G 1/2 BD REF 309309
25G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1×2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 – Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection–graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Play Video

Cite This Article
Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

View Video