Introduction
지난 30 년 이상 동안, 면역 억제제의 발전으로 인해 급성 거부 반응으로 이식 거부 반응을 감소했지만 만성 거부 반응은 주요 과제로 남아. 만성 심장 이식 거부의 주요 증상은 이식 동맥 경화증 (TA) 1, 2입니다. 이 조건은 내막 증식증과 동종 동맥 혈관 운동 기능 장애를 특징으로하는 수신자 면역계 내피 및 평활근 세포의 표적화 면역의 결과로 발전된다. 호스트 선박 3을 살려주는 동안 때문에 외국 펩타이드 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)의 인식에 이식 혈관의 구체적인 타겟팅 독점적으로 이식 동맥 (TA)의 개발에 의해 강조된다. 이을 유지받는 사람이 기증자하거나받는 사람이 T 세포와 B 세포 (4) 부족에 유 전적으로 동일한 경우 TA를 실험적으로 발생하지 않습니다 관측이다. 면역 매개 성 혈관 손상 및 dysfunctioN은 TA 5, 내막의 비후 및 섬유증의 개발뿐만 아니라, 지질 및 ECM 단백질의 비정상적 축적을 야기한다. 내막의 비후는 전체 동맥 트리 전체에 동심 4-6지는 경향이있다. 그라프 손실 및 사망은 보통 동종 이식 혈관 내강 (4)의 폐색으로 인한 시브 허혈의 결과로서 발생한다.
1991 년 Mennander 등. 7 TA를 모델 쥐의 대동맥 개재 모델을 개척했다. 몇몇 그룹은 이후 마우스에 사용하기 위해이 절차를 적용했다. 이 모델에서, 동종 이식 대동맥 세그먼트 (TA)에 필적하는 기능은 임상 이식에서 관찰이 병변을 개발한다. 이 부드러운 근육과 같은 세포와받는 사람 백혈구 (7)의 축적에 의해 특징 내막의 비후를 포함한다. 지난 20 년 동안이 모델 혈관 손상, 제거 및 TA의 기전에 중요한 통찰력을 생성하는 데 사용되어왔다. 그것은 우리가 될 수 있습니다발기 부전은 동맥 병리 동안 면역 및 혈관 반응에 관련된 질문을 검사합니다. 항원 불일치에 미치는 영향의 선택은 적절하게 이러한 문제를 해결 할 수있는 능력.
완전한 MHC 장벽 걸쳐 이식 장기 이식 거부 반응에 관여하는 것으로 알려진 면역 반응의 종합 평가를 허용한다. 이것은 그래프트 유래 세포에 의해 제시 직접 CD4 및 CD8 T 세포 인식과 외래 펩티드 MHC 표적화를 포함 간접 CD4 (및 CD8) T 세포 인식과 제시 세포받는 항원 제시 그래프트 유래 alloantigens 표적화 및 항체 혈관 세포 표면 8 alloantigens의 매개 인식. 그러나 완전한 MHC-일치하지 않는 실험에서 부상으로 혈관 반응은 임상 적 관찰과 다를 수 있습니다. 존슨 등. 9 보여, 그 대부분의 완전한 MHC 불일치 장벽에 걸쳐 이식 대동맥 개재 이식에신생 내막 세포는받는 사람의 기원이 아닌 기증자의 기원이다. 이것은 대부분의 내막 평활근 세포는 공여체 유래의 9,10- 또한 인간 이식에서 관찰 된 것보다 다르다. 이러한 제한 사항을 고려하기 위해, 작은 조직 적합성 항원 불일치 걸쳐 이식 것을 포함 대체 실험 모델은 더 가깝게 임상 이식 11에 관찰 된 것과 유사한 반응을 유발 혈관 개발되었다. 이러한 대체 모델이 중요한 결론을 허용하면서 TA 완전히 임상 환경에서 발생하는 것들 다시 굴복하지 않는 부 조직 적합성 항원이 일치하지 않는 이식 혈관 거부 반응을 일으키는 면역 과정의 개발을 이용시 혈관 반응에 대하여 이루어질 수있다. 예를 들어, 작은 조직 적합성 항원 이식 반응 항체 (12)에 의해 제대로 인식하고 있습니다. 위의 고려 사항을 감안할 때, 그것은 병적 인 questi를 고려하는 것이 중요하다대동맥 개재 모델에 사용 된 항원 불일치의 종류를 선택하는 경우에 조사된다. 여기에서 우리는 쥐의 대동맥 개재 이식에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 완전한 MHC-일치하지 않는 마우스하지만 같은 프로토콜이 다른 항원 일치하지 않는 마우스 변종에 걸쳐 이식에 사용되는 사이에 개재 이식에 대해 설명합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
본 연구의 모든 프로토콜을 검토하고 사이먼 프레이저 대학 동물 관리 윤리위원회에 의해 승인되었다. 사용을 Balb / cYJ (H2의 d) 공여 마우스 및 C57BL / 6 (H2의 b)받는 마우스 동종 반응을 조사. 마우스는 8-12주 세 사이의 실험에 사용된다. 여성 또는 남성 어느 마우스를 사용합니다. 동계 컨트롤 C57BL / 6 수신자에 C57BL / 6 기증자로부터 대동맥 세그먼트로 구성되어 있습니다.
1. 기증자와받는 사람 준비
참고 : 기증자와받는 사람 모두 마취 이식의 허혈을 최소화하기 위해 수술 전에 준비가되어 있습니다. 주 사용 마취제는 흡입 마취제의 전달을 위해 필요한 장치에 의해 동물의 폐색을 방지하기 위해 프로토콜에 사용된다. 그러나, 원하는 경우, 흡입 마취제는 적절한 대안이다. 마취제의 초기 주입에서 전체 절차를 완료하는 데 약 90 분 소요됩니다. 이식의 허혈 시간이 덜 그쪽입니다N 30 분.
- 케타민의 복강 내 주사로 마우스를 마취 (100 ㎎ / ㎏를 10 ㎎ / ㎖)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏, 1 ㎎ / ㎖). 마우스는 10 ~ 15 분 이내에 진정 될 것입니다. 동물 풋 패드의 지방산 부분을 협지함으로써 마취 깊이를 평가한다. 필요에 따라 동물이 철수 반사가 발생하지 않을 때까지, 마취 칵테일의 원래 용량의 1/3을 관리합니다. 모든 칵테일 투여 밀접 후 호흡 속도를 모니터링합니다. 수술하는 동안, 포셉 한 쌍의 전방 복벽을 곤란하게하여 마취의 레벨마다 15 분을 평가. 마우스는 깊이 60 ~ 90 분 동안 마취를 유지한다.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 안과 연고와 마우스의 눈을 윤활.
- 치골에 중반 흉부에서 복부 복부 영역에 가능한 한 피부에 가깝게 머리를 면도. 피부에 닉에 특히 조심하지합니다. 그것이 내가 흡수 될 수 있기 때문에 제모 크림을 사용하지 마십시오피부를 NTO 염증이 될 수 있습니다.
- 가열 테이블이나 패드 위에 수건에 앙와위에서 동물을 놓습니다.
- 2 % 클로로 헥와 예비 스크럽 수술 부위를 청소합니다. 수술 필드를 극대화하기 위해 큰 작업 영역을 준비합니다. 수술 부위의 중앙에서 시작하여 세정 선형 또는 원형 방식으로 외부로 이동한다. 거즈 폐기하십시오. 이 절차를 적어도 5 번 이상 반복합니다. 같은 지역에 알코올 준비 패드를 적용합니다. 알코올이 건조되면, 멸균 거즈와 Betadine 솔루션과 드레이프와 청소 영역을 준비합니다.
2. 엔드 - 투 - 엔드 문합 절차
- 기부자 운영
- 조작에 걸쳐 무균 기술을 유지한다. 사용하기 전에 0.5 % 가속 과산화수소 모든 카운터 및 수술 테이블 표면을 청소합니다. 싸서 사용하기 전에 모든 수술기구, 거즈, 드레이프와 가운을 압력솥. 증기와 악기의 불임을 확인각 팩에 배치 살균기 표시 스트립. 무균 수술 장갑 사용과 수술 사이의 배치된다. 여러 실용 핫 유리 비드와 함께 살균 용도 사이 수술기구 소독.
- 8-30X 배율에서 운영 현미경으로 멸균 드레이프와 포장 깨끗하고 얇은 유리 야 보드에 앙와위에서 기증자 마우스를 놓습니다.
- 1.1 절에 설명 된대로 적절한 수술 마취를 확인한 후 수술을 진행합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 xyphoid 과정 치골에서, 하나의 중간 선 낮은 종 복부 절개를합니다.
- , 복부 벽을 작은 트랙터를 열고 사용하면 구멍을 노출.
- 애플리케이터를 멸균면 스쳐 사용하여 부드럽게 우량 동물의 왼쪽에있는 창자를 철회하고 생리 식염수에 적신 거즈 커버. 하방 생식 기관을 이동하고 infrarenal 대동맥과 하대 정맥 (IVC)을 찾습니다. Mois주기적으로 생리 식염수와 열 노출 된 조직.
- 의료 5 호 집게를 사용하여, 분기점 좌측 신장 동맥의 수준에서, IVC에서 대동맥의 분리. 대동맥 근처의 작은 가지를 결찰하는 10-0 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 사용합니다.
- 기증자의 대동맥이 IVC에서 분리되면, 적신 거즈에 노출 된 캐비티를 포함, 식염수로 용기를 포화 및 멸균 영역에 따로 기증자를 설정합니다. 기증자 (호흡과 심장 혈관 기능, 마취의 깊이) 매 15 분의 상태를 확인합니다. (단계 2.2.7 2.2.1) 후술 대동맥을 단리, 수신자에서 작동 시작.
- 수신자 대동맥 IVC로부터 분리하여 별도로되면 현미경 도너를 반환한다. 크로스 클램프 (근위 관심 세그먼트에 원위부) 기증자의 대동맥, 두 4mm 미세 혈관 클램프와 떨어져 약 5mm,.
- Vannas-튀빙겐의 microscissors를 사용하여,복부 대동맥의 작은 이식 세그먼트 (길이 3-4mm)를 가로로 쪼개다.
- 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 사용하여 5/8, 헤파린 (100 U / ㎖) 식염수와 절제 대동맥 플러시. 용기와 접촉하지 않는 바늘의 끝을 확인합니다.
- 헤파린에 넣어 대동맥 (100 U / ㎖) 식염수 얼음에 솔루션을 따로 설정합니다. 여전히 깊은 마취, 미세 혈관 클램프를 해제하는 동안. 방혈하여 기증자를 안락사.
- 절제 후 30 분 이내에 도너 용기 임플란트. 이 대동맥의 큰 길이를 절개하여 여러 수신자에 대해 하나의 도너 용기를 사용하는 것이 가능하지만, 30 분 미만에 허혈 시간을 유지한다.
- 받는 사람 운영
- 도너 동작으로, 동작에 걸쳐 무균 기술을 유지한다.
- 8-30X 배율에서 운영 현미경으로 멸균 드레이프와 포장 얇은 플렉시 글라스 보드에 앙와위에서받는 사람 마우스를 놓습니다.
- AF동물이 철수 반사가 발생하지 않는 경우 적절한 마취를 보장 ter에게, 수술을 진행합니다.
- 멸균 가위를 사용하여 xyphoid 과정 치골에서, 하나의 중간 선 낮은 종 복부 절개를합니다.
- , 복부 벽을 작은 트랙터를 열고 사용하면 구멍을 노출.
- 애플리케이터를 멸균면 스쳐 사용하여 부드럽게 우량 동물의 왼쪽에있는 창자를 철회하고 생리 식염수에 적신 거즈 커버. 하방 생식 기관을 이동하고 infrarenal 대동맥과 IVC를 찾습니다. 식염수로 주기적으로 노출 된 조직을 적 십니다.
- 분기에 왼쪽 신장 동맥의 수준에서, IVC에서 대동맥을 분리합니다. 필요한 경우, 대동맥 근처 작은 지점을 결찰 할 10-0 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 사용한다.
- 크로스 클램프 (근위 관심 세그먼트에 원위부) 대동맥, 두 4mm 미세 혈관 클램프와 떨어져 약 5mm,.
- Vannas-튀빙겐 microscissors를 사용하여, 하나의 수평 aortotomy을하고 도너 대동맥 이식술을 수용하기 위해 복부 대동맥의 작은 세그먼트 (이하, 0.5 mm)를 절제.
- 헤파린 (100 U / ㎖) 식염수와 절제 대동맥 플러시. 기증자의 대동맥 이식받는 사람의 횡단 대동맥 끝을 연결하는 적당한 길이이어야한다.
- 동 소성 위치에 기증자의 대동맥 이식을 놓고받는 사람의 그것과 각각의 이식 해부학 적 방향을 일치,받는 사람의 말에 기증자의 이식 끝을 문합.
- 조심스럽게 용기의 외막을 잡고 약간 의료 5 번 집게를 사용하여 에버트. 집게를 사용하여, 수신자의 절제된 용기 도너 대동맥 이식술을 확보하기 위해서, 용기 벽의 전체 두께를 통해 (10-0) 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사에 연결된 바늘을 구동한다. 용기 개방이 꺼져 인해 T 폐쇄되지 않도록주의하십시오선박의 뒤쪽 벽의 오 부주의 바느질.
- 연속 스티치를 들어, 이식의 상단과 하단 모두 9시에 숙박 봉합을 배치합니다. 3시 그래프트의 상단에서 시작, 2 실행 봉합과 절제 끝을 문합 및 숙박 봉합사로 봉합을 고정합니다.
- 이상 이식을 뒤집고 원점 숙박 봉합을 충족, 선박의 일부를 지느러미에 실행 봉합을 계속합니다. 용기에 많은 압력을 적용하지 않고 고정합니다. 낮은 문합의 봉합을 반복합니다.
주 : 단속 봉합 용기 체류 봉합 사이 세 분리 바늘 문합되는 것을 제외하고 연속 봉합사와 동일한 방식으로 시작한다. 문합 시간은 보통 20 분입니다.
- 이상 이식을 뒤집고 원점 숙박 봉합을 충족, 선박의 일부를 지느러미에 실행 봉합을 계속합니다. 용기에 많은 압력을 적용하지 않고 고정합니다. 낮은 문합의 봉합을 반복합니다.
- 문합이 완료되면, 역행 혈액 흐름과 문합 부위의 누출을 검사 할 수 있도록 말초 미세 혈관 클램프를 분리. 누설, immediatel가있는 경우Y는 결함이있는 사이트를 닫 스티치를 배치합니다. 현장에서의 번짐이없는 경우, 근위 클램프를 해제.
- 이식을 검토하고 이식에는 혈액 방해 및 근위과받는 사람의 혈관의 말단 부분이 없음을 확인합니다. 기증자의 사람과받는 사람의 두 배에 활발한 펄스 패턴은 혈액이 막힘없이 흐르는 지 기본 표시입니다. 집게의 쌍을 사용하여 부드럽게 체류 봉합사의 한쪽 끝을 잡고 약간 용기의 뒷벽을 검사 할 용기 에버트.
주 : 문합 부위의 양단에 용기 벽에는 퍼커이 없어야합니다. 클램프 제거한 후 불량한 혈액 흐름은 혈전증의 표시이다. - 스쳐면 애플리케이터를 사용하여, 복강 창자를 반환한다.
- Castroviejo 바늘 홀더와 Graefe 씨 집게로, 연속 스티치를 사용하여 5-0 폴리 프로필렌 봉합사와 복부 벽을 닫습니다. 와 같은 스킨 층을 닫고표피 하 폐쇄를 사용하여 봉합.
- 이식이 완료되면 즉시 Torbugesic (1 ㎎ / ㎏) 메신저를 관리합니다.
- 순서대로, 바로 Atipamezole (1 ㎎ / ㎏), 케토 프로 펜 (5 ㎎ / ㎏)을 수득 및 락 테이트 화 링거액 피하 가온.
- 즉시 수술 후, 물 담요 하룻밤 (12 시간)에서 가열 된 새장에 마우스를 놓습니다. 마취 회복 기간 동안, 깨끗하고 마른 탁 트인 지역에 단독으로 동물을 배치합니다. 라인 깨끗한 종이 타월로 (멸균) 케이지를 약 20 ° C ~ 22에 물 담요의 온도를 조절합니다. 케이지 바닥에 건식 및 습식의 kibbles 광고 무제한을 제공합니다.
주 : 수술 치료의 중요한 구성 요소는 수술 마취 및 회복 기간 동안, 필요에 따라, 동물 및 적절한 개입 관측이다. 모니터링의 필요 강도에 따라 다를 동물 및 CO와 같은 즉각적인 마취 회복 기간 동안 클 수도나중에 수술 후 회복에 mpared. - 지속적으로 그들이 완전히 회복 될 때까지 모니터링받은 마취를 가진 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 동물은 보조를받지 흉골 드러 누움을 유지할 수 있어야하며이 방치되기 전에 그것은 조용하고 고통의 무료 나타나야합니다.
- 두 피하 사흘 동안 부 프레 놀핀 (0.1 밀리그램 / kg BID) 및 케토 프로 펜 (5 ㎎ / ㎏ SID)를 얻었다.
- 삼일의 최소 마취에서 회복하는 동안 심장 혈관과 호흡 기능, 체온, 수술 후 통증이나 불편을 모니터링합니다. 추가 관리는 이러한 탈수 및 전해질 손실을 최소화 진통제 및 기타 약물, 및 비경 구 투여 유체로서 요구 될 수있다.
- 뒷다리의 운동 기능을 관찰함으로써 이식의 성공 여부를 평가한다. 이식의 완전한 성공은 ANIM의 회복에 따라 즉시해야 뒷다리와 꼬리에 방해받지 혈액의 흐름을 포함한다알, 두 번째 날에 뒷다리없이 마비와 완전한 회복
3. 조직 컬렉션
주 : 미리 결정된 종단점 원하는 분석의 유형과 불일치 항원의 성질에 따라 다양 3~60일. 일반적으로, 내막 비후가 완료 MHC 일치하지 않는 마우스 변종에 걸쳐 이식 후 하루 30에서 강력한이다.
- 케타민의 복강 내 주사로 마우스를 마취 (100 ㎎ / ㎏를 10 ㎎ / ㎖)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏, 1 ㎎ / ㎖). 동물 풋 패드의 지방산 부분을 협지함으로써 마취 깊이를 평가한다. 동물이 철수 반사가 발생하지 않는 경우에 수술을 진행합니다.
- 물과 70 % 알코올로 끝나는으로 수술 부위를 청소합니다.
- 흡수 패드 늘어서 트레이에 앙와위에서 동물을 놓습니다.
- 큰 중간 선 세로 절개로 복강을 엽니 다. 캐비티를 노출 자체 유지 견인기를 놓고, 하대 정맥복부 대동맥을 거라고.
- 부드럽게 의료 5 호 포셉 쌍을 사용하여 이웃하는 IVC에서 이식 공여자 대동맥 세그먼트를 분리한다. 이식 된 선박의 외막을 제거하지 않도록주의하시기 바랍니다.
- 모든 방법 흉부 입구에 흉추의 양쪽을 따라 갈비뼈를 통해 절단하여 흉강을 노출. 심낭을 노출하고 지혈 한 쌍의 흉곽을 확보하기 위해 우량 앞쪽에 가슴 벽을 반영한다.
- 심장이 노출되면, 25 G 5/8 좌심실로 (주사기에 부착) 바늘과 헤파린의 0.1 ㎖ (100 U / ㎖) 생리 식염수와 같은 높이를 삽입합니다.
- 가위를 사용하여, 혈액, 헤파린 염수 및 고정액을 관류 중에 몸을 남길 수 있도록 우심방을 제거한다. 4 % 파라 포름 알데히드를 5 ml의 액체 또는 실행 클리어까지 동물을 관류. 안락사를 보장하기 위해 마음을 제거합니다.
- 소비세 선박 세그먼트를 이식하고 4 % 파라에 몰입일시간보다 더 이상에 대한 포름 알데히드. 이식 된 OCT에서 용기 (최적의 절삭 온도) 매트릭스 및 플래시 동결을 설정합니다. 제 8 UM 두께로 설정하에 저온 유지 용기. 헤 마톡 및 에오신 및 / 또는 Verhoeff 밴 Gieson (반 Gieson) 탄성 얼룩 얼룩 부분.
이식 4. 형태 학적 분석
참고 : TA는 내막의 비후 (13)에 의해 특징입니다. 이 모델에서, 내막의 비후 및 내강의 크기 감소는 얻어진 면역 매개 혈관 손상의 정도를 반영한다. Syngraft 제어는 동종 면역 반응의 부재 하에서 선박의 기준선 특성을 결정하기 위해 사용된다. 이러한 제어는 또한 외과 수술의 결과로 발생 동맥 손상의 평가를 허용한다. syngrafts에는 내막의 비후가 없어야합니다.
- 내피 세포 내에서 면적을 측정, 내막의 비후 및 내강 폐쇄를 검토층, 내부 탄성 박판 (IEL) 및 이미지 분석 소프트웨어와 탄성 판 Gieson 염색 동맥 세그먼트 외부 탄성 박판 (EEL). 아래의 파라미터가 TA의 반사 동맥의 변화를 결정하는데 사용될 수있다.
- 절대 내막의 면적을 측정 : 내부 탄성 얇은 내의 지역 - 내피 세포 층 내의 영역을. 이 TA의 특징이다 내막 확장의 절대 측정을 제공합니다.
- 내부 탄성 얇은 내의 지역 - 지역 외부 탄성 얇은 내의 : 절대 중간 영역을 측정합니다. 이것은 때때로 혈관 벽의이 지역에 면역 매개 성 변화의 결과로 발생할 수있는 중간 저하 또는 성장의 절대 측정을 제공합니다.
- 외부 탄성 박판 내의 지역 전체 혈관 영역을 측정한다. 이는 면역 학적 손상의 결과로서 팽창 또는 동맥의 수축을 수반 혈관 리모델링의 측정을 제공한다.
- 측정(내부 탄성 얇은 내의 지역 - 내피 세포 층 내에서 면적) / (외부 탄성 얇은 내의 지역 - 내부 탄성 얇은 이내 지역) : 내막 / 미디어. 이 내막 확장의 상대 측정을 제공하며, 선박의 크기의 차이를 정상화.
- %의 내강이 좁아 측정 : [(내부 탄성 얇은 내의 지역 - 내피 세포 층 내 영역) 내부 탄성 얇은 판에 / 영역)] * 100. 이 내막 확장과 혈관 벽의 리모델링 (내부 또는 외부)의 조합의 결과 내강 폐색의 정도의 측정을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 모델에서의 Balb / cYJ 마우스에서 복부 대동맥은 C57BL / 6 수신자의 infrarenal 대동맥에 삽입된다. 이는 동종 이식 동맥을 대상으로 동종 응답의 포괄적 인 평가를 허용한다. 이 모델에서 면역 매개 성 혈관 손상은 내막의 비후, 내강이 좁아 및 면역 세포의 모집 절정에 달하다 혈관 수복 반응 시작합니다 (그림 1, 2). 이러한 기준은 동종 반응의 정도, 혈관 제거 및 TA에 대한 판독 역할을한다. 절차의 성공은 동종 동맥 세그먼트 강력한 내막의 비후의 개발 및 syngraft 컨트롤 내막 비후의 유무에 의해 평가 될 수있다. 임상 적으로 관련된 면역 억제는 임상 이식 더 가깝게 닮은 모델과 함께 사용될 수있다. 이 모델은 또한 동종 반응에서 특정 단백질 / 경로의 효과를 연구하는 트랜스 제닉 동물을 사용할 수있다S 우리는 14 일을했다.
동종 이식 대동맥 세그먼트는 내막의 비후를 개발
면역 매개 동종 이식 혈관 손상의 양은 하루 30 후 이식에서 이식 대동맥 세그먼트에서 내막의 비후 및 내강이 좁아을 정량화하여 조사 하였다. 동종 이식 동맥 세그먼트는 중요한 내막의 비후 및 내강 폐색을 개발하고 변경은 syngraft 제어 동맥 세그먼트 (그림 1)에서 관찰되지 않습니다.
동종 이식 대동맥 분야에서 백혈구의 축적.
동종 동맥 백혈구 축적은 CD4 T 세포, CD8 T 세포, 대 식세포 (맥 3) 면역 조직 15의 수를 정량함으로써 조사 하였다. 맥 -3- 이러한 F4 / 80과 같은 다른 마커는,도 16을 사용할 수 있지만, 본 연구에서 대 식세포에 대해 염색 하였다. CD4 T 세포는 CD8 T 세포 및 대 식세포에서 검출 동종 이식 동맥의 내막 (그림 2)
그림 1 : 이식 동맥의 조직 학적 분석 (A) 동계 및 동종 마우스의 복부 대동맥의 세그먼트가 C57BL / 6 마우스의 절제 복부 대동맥에 개재되었다.. 이식 동맥은 하루 30 이식 후 수확했다. 탄성 반 GIESEN 스테인드 동맥의 대표 현미경 사진이 표시됩니다. 스케일 바 = 0.1 mm = 100 선박의 다른 레이어가, L 측정하는 방법을 묘사 μm의 (B)도 : 루멘, E : 내피 층, I : 내막, M : 미디어 :..의 외막을 (C) 정량화 내막 / 미디어 비 및 30 일 동계에서 좁아 %의 내강 (N = 3)와 동종 (N = 6) 이식, * P <0.05.= "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 동종 이식 동맥에서 면역 세포의 축적. 동종 대동맥 세그먼트 대표 현미경은 면역 (A) CD4, (B) CD8, 및 (C) 3 맥 염색 도시되어 헤 마톡 실린으로 대조. 스케일 바 = 0.1 mm = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 면역 매개 성 혈관 거부와 TA를 연구하는 데 유용 쥐에 이식 대동맥 개재위한 프로토콜을 설명했다. 이 모델 TA의 요인뿐만 아니라, 신규 한 치료 전략의 개발을 조사하는데 사용될 수있다. 이것은 TA 14,17-21에서 후천성 면역, 세포 독성 T 세포 반응, 사이토 카인 - 매개 CD4 T 세포의 효과기 응답 및 항체 - 매개 그래프트 손상 중요한 역할을 확립하기 이전에 사용되어왔다. 마우스에서 동맥 이식 인해 동물의 명백한 소형화하는 것은 곤란하다; 그러나, 실제로는 실사와, 성공적인 수술은 달성 될 수있다. 성공은 선박의 개통에 따라 달라집니다. 이것은 그래프트 부적절, 혈관 내강의 집게 용기, 수축 처리 용기의 뒷벽과 동일한 위치의 반복적 봉합을 봉합에 의해 손상되지 않도록 포함한다. 용기의 누설도 문제가 전자에주의가 요구스티치의 수와 위치는 혈관 벽 주위 고르게 나누어 nsure. 이것은 그래프트 허혈 30 분 이하로 최소화하는 것도 필요하다. 이에 의해, 95 % 초과의 성공률을 얻을 수있다.
대동맥은 마우스에서 가장 큰 동맥이 때문에이 절차는이 모델 동물에서 혈관 거부 반응을 조사하기위한 간단한 미세 수술 방법입니다. 또한 대동맥 세그먼트는 생리 관련 위치에 그래프트되어, 정상 혈류를 경험과 내막의 비후가 빠르게 발생한다. 혈관 거부와 TA의 평가에 사용되는 다른 메인 모델은 관상 동맥 및 TA에 대한 가장 중요한 임상 시나리오 심장 이식의 컨텍스트에서 TA의 개발을 검토의 이점을 갖는다 이소성 심장 이식이다. 그러나, 이소성 심장 이식은 신체 내에서 비 생리 학적 위치에 배치됩니다 (일반적으로 대정맥에 anastamosed과복부 대동맥)과 심장 인해 이식 된 심장에 혈액 공급의 역행 성격 심실을 통해 혈액을 펌프하지 않습니다. 이와 같이, 관상 트리를 통해 혈류의 특성은 일반적으로 관상 동맥 혈관 (22, 23)에 의해 경험되는 것과 상이 할 수있다. 또한 전략은 심장의 급성 거부 반응은 동맥의 변화를 평가하기 위해 혼입 될 극복한다. 두 모델 모두에서, 신중 적절 혈관 거부 반응과 관련된 특정 TA 질문 해결할 수 있도록하기 위해 사용되는 항원 불일치의 종류를 선택하는 것이 중요하다.
요약하면, 대동맥 개재 이식은 면역 매개 성 혈관 손상 및 TA를 조사하기위한 강력한 기술이다. 그것은 정기적으로 연구원 측의 연습과 노력으로 마스터 할 수 있습니다. 일단 마스터,이 절차는 경동맥, 동맥 번째 다른 세그먼트의 개재 래프팅을 위해 변형 될 수있다AT는 추가적인 과학적 질문의 시험을 가능하게 할 수있다. 또한,이 모델의 사용은 이식 연구를 넘어 확장 될 수있다. 변형에서 동맥 개재 래프팅 동맥 세그먼트를 도입하는데 사용될 수있다 (예를 들어 트랜스 제닉 또는 지질 - 공급) 비 변형 대응으로 마우스, 또는 그 반대로, 비 동맥 벽 세포 24 대 동맥벽 세포 분자의 생물학적 효과를 격리 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 건강 연구 및 심장과 BC & 유콘의 스트로크 재단 (JCC)의 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/ml | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/ml | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25 G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27 G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 - Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
