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Medicine

अग्नाशय के कैंसर नई उपचार रणनीतियों के विकास के लिए सेल के लक्षण स्टेम का अध्ययन

Published: June 20, 2015 doi: 10.3791/52801
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 3, 1,3
1Stem Cells & Cancer Group, Molecular Pathology Program, Spanish National Cancer Research Center, 2Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona), 3Center for Stem Cells in Cancer & Ageing, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London

Abstract

अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता (PDAC) ट्यूमर दीक्षा, मेटास्टेसिस और प्रतिरोध रेडियो के लिए और कीमोथेरेपी ड्राइव करने के लिए दिखाया गया है, जो विशेष रूप से tumorigenic कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) के सबसेट होते है। यहाँ हम लंगर स्वतंत्र परिस्थितियों में ट्यूमर क्षेत्रों के रूप में प्राथमिक मानव अग्नाशय सीएससी संवर्धन के लिए एक विशिष्ट पद्धति का वर्णन। कोशिकाओं को उनके अधिक विभेदित संततियों और जीवित रहने के एकल कक्षों के बोने निम्नलिखित प्रारंभिक चरण के दौरान पैदा करना नहीं है, जबकि सीएससी के लिए समृद्ध करने के क्रम में सीरम मुक्त, गैर पक्षपाती परिस्थितियों में बड़े हो रहे हैं। यह परख ट्यूमर कोशिकाओं की आबादी में मौजूद सीएससी के प्रतिशत का अनुमान किया जा सकता है। का गठन ट्यूमर क्षेत्रों के दोनों (35 से 250 माइक्रोमीटर से लेकर कर सकते हैं), जो आकार और संख्या सुसंस्कृत कैंसर कोशिकाओं के थोक आबादी या हौसले से काटा और पच ट्यूमर 1,2 या तो में शरण सीएससी गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस परख का उपयोग करना, हम हाल ही में मेटफार्मिन चुनिंदा pancreat ablates पाया किआईसी सीएससी; बाद में आगे pluripotency जुड़े जीन / सतह मार्करों के कम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन से मंडित और मेटफार्मिन इलाज कोशिकाओं के vivo tumorigenicity में कम हो गया था कि एक खोज है। पूर्व नैदानिक ​​विकास के लिए अंतिम कदम के रूप में हम मेटफार्मिन के साथ स्थापित ट्यूमर असर चूहों का इलाज किया है और काफी लंबे समय तक जीवित रहने पाए। PDAC के साथ रोगियों में मेटफार्मिन के प्रयोग का परीक्षण नैदानिक ​​अध्ययन वर्तमान में चल रहे हैं (उदाहरण के लिए, NCT01210911, NCT01167738, और NCT01488552)। Mechanistically, हम मेटफार्मिन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को बढ़ाने और mitochondrial transmembrane क्षमता को कम करने से सीएससी में एक घातक ऊर्जा संकट को प्रेरित करता है कि पाया। इसके विपरीत, गैर सीएससी मेटफार्मिन उपचार से सफाया कर दिया, बल्कि प्रतिवर्ती सेल चक्र गिरफ्तारी कराना पड़ा नहीं थे। इसलिए, हमारे अध्ययन संभावित सीएससी कि लक्ष्य यौगिकों की पहचान करने के लिए एक प्रदर्शन उपकरण के रूप में इन विट्रो क्षेत्र के गठन की क्षमता के लिए एक सफल उदाहरण के रूप में कार्य करता हैहै, लेकिन इस तकनीक को झूठे खोजों को खत्म करने के लिए इन विट्रो में और vivo सत्यापन में आगे की आवश्यकता होगी।

Introduction

अग्नाशय नलीपरक ग्रंथिकर्कटता (PDAC) सबसे आक्रामक ठोस ट्यूमर में से एक है। यह वर्तमान में पश्चिमी समाज में 4 वें सबसे आम कैंसर से संबंधित मृत्यु है और (~ दुनिया भर में प्रति वर्ष 400,000 लोगों की मृत्यु) अगले एक दशक के भीतर 2 एन डी सबसे लगातार कारण करने के लिए उपस्थित रोगियों के निदान के 90% के 3 .at समय वृद्धि की भविष्यवाणी की है कम से कम 5% की एक 5 साल की उत्तरजीविता है जो उन्नत रोग, के साथ। यह जीवित रहने की दर निराश के साथ तेजी से गहन अनुसंधान गतिविधियों 4 के बावजूद पिछले 50 वर्षों में अपरिवर्तित बनी हुई है। शल्य लकीर के माध्यम से संभावित 'इलाज' की बीमारी है, जो मरीजों की शेष 10% की, 80% 5 साल के भीतर पुनरावृत्ति से मर जाएगा। कई सालों के लिए उन्नत रोग के लिए देखभाल के मानक gemcitabine monotherapy कर दिया गया है, लेकिन यह केवल एक मामूली अस्तित्व लाभ 5 प्रदान करता है। इसके अलावा द्वारा हासिल किया गया है अल्पकालिक अस्तित्व में छोटे सुधारerlotinib 6 या केपेसिटाबाइन 7 की, फिर भी उत्तरजीविता लाभ मंझला समग्र अस्तित्व अभी भी ~ 6 महीनों के साथ सप्ताह के क्रम में है। हाल ही में, अधिक उत्साहजनक परिणाम gemcitabine / NAB -paclitaxel 8 और FOLFIRINOX संयोजन शासन 9,10 के लिए उभरा है। इन उपचारों को क्रमश: एक मामूली 2 और 4 महीने से मंझला अस्तित्व में सुधार है, लेकिन बेहद जहरीला है और लंबे समय तक जीवित बचे लोगों को अभी भी एक दुर्लभ अपवाद नहीं हैं कर रहे हैं। इलाज के सुधार के लिए क्षमता प्रदान करता है, इनमें से कई मरीजों को जवाब या केवल समग्र अस्तित्व में वृद्धिशील सुधार नहीं दिखा है, जो करने के लिए विषाक्त शासनों हैं। एक परिणाम के रूप में, वर्तमान उपचारों के पूरक के लिए और उपन्यास, सबसे अधिक संभावना बहुविध चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक तत्काल आवश्यकता है।

ट्यूमर विविधता

यह कैंसर विविधता ही अलग विकासवादी subclones ढंग से करने के लिए ही सीमित नहीं है कि तेजी से स्पष्ट होता जा रहा हैएन प्रत्येक ट्यूमर 11 है, लेकिन यह भी एक subclone 12 भीतर प्ररूपी और कार्यात्मक विविधता और plasticity द्वारा संचालित। तथाकथित कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) या ट्यूमर को बढ़ावा देने कोशिकाओं intraclonal विविधता 13-16 के लिए जिम्मेदार हैं। विशेष रूप से, सीएससी वे एक कैंसर subclone 17 के भीतर सभी विभेदित संततियों को जन्म देने से रोग की जड़ का प्रतिनिधित्व करते हैं, और हम दूसरों एकल कक्ष के लिए नीचे, निर्णायक सबूत प्रदान की है, जिसके लिए कैंसर सेल के एक सबसेट का प्रतिनिधित्व करते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं को मेटास्टेटिक व्यवहार के लिए आवश्यक हैं और यह भी, यहां तक कि प्रारंभिक ट्यूमर प्रतिगमन (उदाहरण के लिए, एनएबी -paclitaxel) 15,18-20 उत्प्रेरण में सक्षम अपेक्षाकृत प्रभावी दवाओं के साथ, इलाज के बाद रोग पतन के लिए एक महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह सीएससी जरूरी सदाशयी स्टेम कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करते, न ही वे कई मामलों में ऊतक स्टेम कोशिकाओं से पैदा होती है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि वे ACQ हैस्टेम कोशिकाओं की कुछ विशेषताएं uired। उदाहरण सीएससी अनिश्चितकालीन आत्म नवीकरण क्षमता पारंपरिक कीमोथेरेपी के लिए उन्हें प्रतिरोधी बनाने के साथ लैस कर रहे हैं, और मेटास्टेटिक गतिविधि को बढ़ावा देता है जो invasiveness वृद्धि हुई इस शो के लिए इनमें से अधिकांश कार्यात्मक रूप में परिभाषित कर रहे हैं।

कार्यात्मक कैंसर स्टेम सेल phenotypes

सीएससी के कार्यात्मक फेनोटाइप क्रमशः धारावाहिक क्षेत्र के गठन और कॉलोनी गठन assays का उपयोग इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है, जो स्वयं को नवीनीकृत करने की क्षमता पर आधारित है। इससे भी अधिक महत्वपूर्ण बात, अधिमानतः अनन्य लंबी अवधि के tumorigenicity का संकेत धारावाहिक प्रत्यारोपण के दौरान, परम कार्यात्मक readout के रूप में विवो assays में कमजोर पड़ने सीमित द्वारा परीक्षण किया जा सकता है, जो विवो tumorigenicity में आत्म नवीकरण भालू के लिए सक्षम सीएससी। इसके अलावा, सीएससी डिब्बे के भीतर विविधता सिर्फ एक नहीं है कि मेटास्टेसिस को जन्म देने के लिए विशेष क्षमता असर सीएससी की एक विशिष्ट उप-जनसंख्या के साथ, वहाँ हैविवो tumorigenicity में उनके अनन्य का सीधा परिणाम। दरअसल, metastastitic सीएससी, प्राथमिक ट्यूमर से बचने anoikis जीवित रहते हैं और अंत में सरकाना और माध्यमिक साइटों बीज के लिए क्षमता हासिल। इन उन्नत कार्यात्मक क्षमताओं मेटास्टेसिस assays का उपयोग संशोधित आक्रमण assays और vivo में प्रयोग करने के लिए इन विट्रो में परीक्षण किया जा सकता है।

कैंसर स्टेम कोशिकाओं का लक्ष्य निर्धारण

एक सीएससी-लक्ष्य रणनीति 21 के साथ संयुक्त जब तक हम और दूसरों को उपचार भी स्ट्रोमा-लक्ष्य एजेंटों के साथ संयोजन में, विभेदित PDAC कोशिकाओं के थोक ट्यूमर पर ध्यान केंद्रित कर रहा है कि ठोस सबूत उपलब्ध कराई है, ट्यूमर प्रगति और बाद के परिणाम पर एक बड़ा असर नहीं है, 22। इस प्रकार, रोग प्रगति और उपचार के लिए प्रतिरोध में सीएससी के महत्वपूर्ण कार्यों के आधार पर, इन कोशिकाओं को किसी भी उपन्यास उपचार दृष्टिकोण 18,20 के लिए एक आवश्यक घटक दर्शाता चाहिए, लेकिन एक और अधिक पूरी तरह से समझ ओ की आवश्यकता होगीसीएससी के नियामक मशीनरी च। सीएससी और उनके अधिक विभेदित संततियों आनुवंशिक परिवर्तन के संबंध में समान आनुवंशिक जमीन राज्यों सहन हालांकि, सीएससी अलग है और इस तरह epigenetically निर्धारित जीन अभिव्यक्ति स्टेम कोशिकाओं के साथ कि शेयर मॉड्यूल प्रोफाइल दिखा रहे हैं। सृजन प्रेरित स्टेम सेल (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) में शामिल जीनों में से अधिकांश केवल कैंसर से जुड़ा हुआ नहीं किया गया है, लेकिन उनकी अभिव्यक्ति ज्यादातर सीएससी कम्पार्टमेंट के लिए प्रतिबंधित है। इसके अलावा, सीएससी को लक्षित करने के लिए आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर नुकसान के समारोह प्रयोगों द्वारा सीएससी के कार्यात्मक प्रासंगिकता अब मजबूती से कई प्रकार के कैंसर 23-25 ​​के लिए सीएससी अवधारणा की स्थापना की है। इन तरीकों में से ज्यादातर के माउस मॉडल पर आधारित है और इस तरह आसानी से क्लिनिक में हस्तांतरणीय नहीं कर रहे हैं, वे थोक ट्यूमर कोशिकाओं के साथ संयोजन में सीएससी को निशाना बनाने का संभावित नैदानिक ​​प्रासंगिकता के लिए सबूत की अवधारणा प्रदान करते हैं।

छठी में कैंसर स्टेम कोशिकाओं का अध्ययनTRO उनकी दुखती रग को पहचानें

सीएससी को लक्षित करने के लिए नए और चिकित्सकीय लागू तरीकों की पहचान करने के लिए, उनकी सुविधाओं को नियमित रूप से इन विट्रो में अध्ययन कर रहे हैं और क्षेत्र के गठन के लिए व्यापक रूप से इस संदर्भ में प्रयोग किया जाता है। मूल रूप से आत्म नवीकरण और भेदभाव क्षमता सहित सामान्य स्टेम कोशिका जीव विज्ञान, अध्ययन के लिए विकसित की है, इस परख के बाद में इन विट्रो में सीएससी का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया था और PDAC 20 से पृथक सीएससी की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम इसलिए वे सदाशयी अग्नाशय सीएससी 21 होते हैं, यह दर्शाता प्राथमिक मानव PDAC कोशिकाओं से बनाई ट्यूमर क्षेत्रों सीएससी के सभी विशिष्ट सुविधाओं सहन कि मिल गया है। इस प्रकार, ट्यूमर क्षेत्र परख इन विट्रो में और अधिक प्रभावी उपचार के लिए स्क्रीन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन परिणाम आगे विवो assays में और अधिक कठोर में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। दरअसल, इस में इन विट्रो परख के साथ उत्पन्न डेटा वें के रूप में बड़ी सावधानी के साथ व्यवहार किया जाना चाहिएई परख महत्वपूर्ण त्रुटि के अधीन किया जा सकता है। का गठन क्षेत्रों के स्वचालित गिनती सहित अत्यधिक मानकीकृत प्रोटोकॉल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और भविष्य कहनेवाला डेटा सुनिश्चित करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए।

इस संदर्भ में, हम हाल ही में प्राथमिक मानव PDACs की एक विविध सेट से ली गई अग्नाशय सीएससी स्क्रीन करने के लिए इस परख के लिए इस्तेमाल किया और इन कोशिकाओं विरोधी मधुमेह यौगिक मेटफार्मिन द्वारा चयापचय reprogramming के लिए अत्यधिक जोखिम रहता है कि पता चला है। इससे पहले, मेटफार्मिन एएमपी सक्रिय प्रोटीन काइनेज (AMPK) संकेत और कम प्रोटीन संश्लेषण और सेल प्रसार 27 में जिसके परिणामस्वरूप mTOR 26 के बाद के निषेध के अप्रत्यक्ष सक्रियण द्वारा कैंसर सेल के विस्तार को बाधित करने के लिए प्रदर्शन किया गया था। थोक ट्यूमर आबादी पर इन प्रभावों के अलावा, और हम दूसरों मेटफार्मिन लक्ष्य है और वास्तव में इस तरह स्तन, कैंसर, ग्लियोब्लास्टोमा और अग्नाशय के कैंसर 28-31 <रूप में ठोस ट्यूमर की संख्या में सीएससी उप-जनसंख्या को खत्म करने में सक्षम है कि मिल गया है/ Sup>। इस प्रकार, मेटफार्मिन वर्तमान unmet की चिकित्सा की जरूरत के साथ कई तरह के कैंसर के लिए एक होनहार और सुरक्षित नई चिकित्सकीय रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, सीएससी के लिए समृद्ध करने के लिए एक रास्ते के रूप में क्षेत्र के गठन का उपयोग करते हुए, हम अग्नाशय सीएससी पर मेटफार्मिन का प्राथमिक प्रभाव AMPK सक्रियण के स्वतंत्र और ज्यादातर जाहिरा तौर पर सबसेट के लिए घातक था, जो (जटिल मैं के निषेध के माध्यम से) अपनी विनम्र माइटोकॉन्ड्रियल विषाक्तता पर भरोसा था कि पता चला सीएससी की ही। बाद के लिए हम सेलुलर स्तर पर दवा की विषाक्तता के संकेतक के रूप में उनके सेलुलर ऑक्सीजन की खपत और mitochondrial आरओएस उत्पादन का आकलन करने में सक्षम थे। इसके बाद इन में इन विट्रो डेटा क्लिनिक पूर्व माउस मॉडल में मान्य है और वास्तव में काफी अस्तित्व के 31 लंबे समय तक के परिणामस्वरूप किया जा सकता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत कार्यप्रणाली सीएससी चयापचय पर उनके प्रभाव पर अध्ययन सहित सीएससी के लिए दवा संवेदनशीलता प्रोफाइल, के तेजी से उत्पादन के लिए अनुमति देता है। अब हम उपयोग किया कॉम के बारे में प्रयोगात्मक विवरण बढ़ाया प्रदानplementary इन विट्रो में और vivo प्रक्रियाओं में।

Protocol

मानव PDAC ट्यूमर लिखित सूचित सहमति (कम्यूनिदाद डे मैड्रिड, स्पेन (सीपी CNIO-सीटीसी-11 के साथ प्राप्त किया गया -। सीआई 11/103-ई) immunodeficient चूहों में मानव अग्नाशय के ट्यूमर का आरोपण संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुमोदन की आवश्यकता है और साथ ही संस्थागत । पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) xenograft अग्नाशय के ट्यूमर माउस मॉडल की प्रक्रियाओं संस्थागत और राष्ट्रीय नियमों के अनुसार में आयोजित किया जाना चाहिए (; मैड्रिड, स्पेन, यहाँ आचार Instituto डी Salud कार्लोस III की समिति प्रोटोकॉल पीए 34_2012)।

1. संस्कृति मीडिया

  1. पूरा मध्यम तैयार करें।
    1. 10% FBS के, 100 इकाइयों / मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ RPMI मध्यम अनुपूरक। RPMI के 500 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल, 100x) की गर्मी निष्क्रिय FBS के 55 मिलीग्राम और 6 मिलीलीटर जोड़ने के लिए।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरा मध्यम स्टोर।
  2. सीएससी मध्यम तैयार।
    1. सीरम मुक्त DMEM / F12 के mediu अनुपूरक100 यूनिट / मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 मिमी glutamine के साथ मी।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर सीएससी मध्यम स्टोर। B27 (01:50) और 20 एनजी / एमएल bFGF के हौसले प्रत्येक प्रयोग से पहले मध्यम करने के लिए जोड़ रहे हैं।
      नोट: B27 के अलावा ट्यूमर क्षेत्र के गठन को बढ़ाने के लिए और क्षेत्र संस्कृतियों 32 में से कई मार्ग को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है। मध्यम रचना एक महत्वपूर्ण कदम है और संस्कृति में प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए परीक्षण किया जाना है। हम परीक्षण आत्म नवीकरण और क्षेत्रों के भेदभाव क्षमता की सलाह देते हैं और फ्लो द्वारा सीएससी मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण (यानी, CD133 + और ​​CD44 +)।
  3. कोशिकी फ्लक्स परख मध्यम तैयार।
    1. इस विशिष्ट मध्यम विटामिन, aminoacids और अन्य की खुराक से युक्त है, लेकिन glutamine, ग्लूकोज, पाइरूवेट और बाइकार्बोनेट कमी बेसल DMEM 5030 है।
    2. वर्तमान परख के लिए, एक पूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय क्रिया को 2 मिमी glutamine, 8 मिमी ग्लूकोज और 2 मिमी सोडियम पाइरूवेट के साथ मध्यम पूरक।
      नोट: नियमित रूप से मध्यम युक्त बाइकार्बोनेट परख के दौरान पीएच विविधताओं बफर जाएगा के बाद से सोडियम बाइकार्बोनेट के अभाव, सही संस्कृति में बढ़ कोशिकाओं के बाह्य अम्लीकरण को मापने के क्रम में आवश्यक है। इसके अलावा, एक बेसल माध्यम का प्रयोग (एल alanyl-glutamine के रूप में) एल glutamine ग्लूकोज, या अलग परख की स्थिति और / या अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक सोडियम पाइरूवेट की एकाग्रता के एक तंग नियंत्रण की अनुमति देता है।

2. क्षेत्र परख और विश्लेषण के गठन

नोट: सभी टिशू कल्चर प्रोटोकॉल और जोड़तोड़ साफ, डिटर्जेंट मुक्त, बाँझ कांच के बने पदार्थ का उपयोग करने के लिए महान ध्यान के साथ बाँझ तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उपयोग, पूर्व गर्म सभी मध्यम और समाधान से पहले (एक विकल्प के रूप में, आप मध्यम और समाधान आरटी पर पूर्व गरम उपयोग कर सकते हैं)। पहले से 21 विस्तृत रूप में मानव PDAC ट्यूमर प्राप्त करते हैं।

  1. मानव PDAC से सीएससी के अलगाव (चित्रा1)
    1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ 1X फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर युक्त एक 60 x 15 मिमी संस्कृति डिश के लिए मानव PDAC ऊतक हस्तांतरण। एक बाँझ स्केलपेल और संदंश का उपयोग - (5 मिमी 1) छोटे टुकड़ों में ट्यूमर कीमा।
    2. संस्कृति डिश के लिए बाँझ 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें और ऊतकों को पूरी तरह से अलग है जब तक विचूर्णन कदम दोहराने, यह नियमित रूप से 3-4 राउंड की आवश्यकता है। एक बाँझ ट्यूब में (शीर्ष 1X पीबीएस के साथ 5 एमएल की अंतिम मात्रा तक) ऊतक निलंबन स्थानांतरण और यंत्रवत् ऐसे gentleMACS के रूप में एक dissociator साथ यह homogenize।
    3. Collagenase के साथ homogenized ऊतक 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए (2.5 मिलीग्राम / 1X पीबीएस में collagenase के मिलीलीटर) का उपयोग करें और फिर 900 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेते हैं। सतह पर तैरनेवाला छानना और पूरा मध्यम के 10 एमएल में सेल छर्रों resuspend। 900 x जी पर 5 मिनट के लिए एक 40 माइक्रोन झरनी और सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर।
    4. सतह पर तैरनेवाला छानना और resuspendलाल रक्त कोशिका lysis बफर के 5 एमएल (अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम, एसीके) के साथ गोली, और सेते
    5. एक जिलेटिन लेपित पकवान पर सीएससी मध्यम, थाली में गोली Resuspend, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। यह कदम जल्दी से थाली के लिए देते हैं कि fibroblast कोशिकाओं के सबसे निकाल देंगे।
    6. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और ध्यान से सेल निलंबन की वसूली और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य (trypan नीले-नकारात्मक) कोशिकाओं की संख्या यों। इस प्रयोजन के लिए, धीरे निलंबन मिश्रण और एक Eppendorf ट्यूब में निलंबन के 20 μl विंदुक। Microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं को trypan नीले रंग की: (1 अनुपात 1) और मिश्रण अच्छी तरह से 20 μl जोड़ें। पिपेट hemocytometer पर इस मिश्रण के लगभग 10 μl।
    7. व्यवहार्य सेल गिनती के लिए गिनती चैम्बर के चार कोने चतुर्भागों के भीतर सभी स्पष्ट कोशिकाओं की गणना। नोट: कोशिकाओं की व्यवहार्यता और उपज ट्यूमर नमूनों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। PDAC के लिए नमूने व्यवहार्यता नियमित रूप से betwe पर्वतमाला45-70% एन, और 3 के एक व्यास के साथ एक macroscopic ट्यूमर नमूना से ऊतक टुकड़े - 5 मिमी लगभग 5x10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं को उपज चाहिए।
  2. क्षेत्रः गठन परख और मेटफोर्मिन उपचार
    1. कोशिकाओं के लिए आवश्यक संख्या ले लो और 2,000 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल एकाग्रता तैयार करने के लिए सीएससी माध्यम की उचित मात्रा में जोड़ें। 1H की तुलना में अब और नहीं के लिए बर्फ पर सेल निलंबन रखने के लिए और चढ़ाना करने के लिए अच्छी तरह से पूर्व मिश्रित मत करो।
    2. मध्यम वाष्पीकरण कम करने में मदद करने के क्रम में आर्द्रीकरण के लिए 24 अच्छी तरह से थाली की पहली और आखिरी पंक्ति को 1X पीबीएस के 500 μl जोड़ें। ट्यूमर क्षेत्र माध्यम से 1 मिलीलीटर (2,000 कोशिकाओं / एमएल) में अच्छी तरह से प्रति 2,000 कोशिकाओं के घनत्व पर अल्ट्रा कम लगाव कोशिकाओं प्लेटों में कोशिकाओं बीज।
      नोट: ट्यूमर प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं ट्यूमर क्षेत्र गठन assays के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या।
    3. वाहन (नकारात्मक नियंत्रण) और प्रत्येक आवंटित उपचार के साथ 4 कुओं, मेटफार्मिन का उदाहरण।, 3 मिमी के साथ कम से कम 4 कुओं समझो। Pl37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन सेट में कोशिकाओं ऐस और एक सप्ताह के लिए 5% सीओ 2 के साथ कोशिकाओं की आपूर्ति।
      नोट: मध्यम ट्यूमर क्षेत्रों की अबाधित गठन की अनुमति के क्रम में बदला नहीं जाना चाहिए, लेकिन वे संस्कृति के माध्यम में स्थिर नहीं कर रहे हैं के रूप में एक दैनिक आधार पर वृद्धि कारकों के साथ सबसे ऊपर जा सकता है।
    4. हर दूसरे दिन उपचार, कुओं में से प्रत्येक के लिए मेटफार्मिन या वाहन के उदा।, 3 मिमी जोड़ें। बड़े ढांचों (चित्रा 2) की गिनती के लिए अनुमति देता है कि एक स्वचालित सेल काउंटर के उपयोग के द्वारा 5 और / या 7 दिनों के बाद गठित ट्यूमर क्षेत्रों की संख्या का आकलन करें।
      नोट: क्रमश: - - (120 माइक्रोन 80) कम से कम 40 माइक्रोन के साथ केवल ट्यूमर क्षेत्रों पर विचार किया जाना चाहिए और छोटे रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है (40 से 80 माइक्रोन) या बड़े। परिणाम (उदाहरण के लिए, 2,000 कोशिकाओं) वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या से विभाजित ट्यूमर क्षेत्रों के प्रतिशत के रूप में समझा जा सकता है।
  3. पहली पीढ़ी के ट्यूमर क्षेत्रों के सीरियल Passaging ऊष्मायन के 7 दिनों के बाद एक 40 माइक्रोन सेल झरनी का उपयोग कर ट्यूमर क्षेत्रों फसल और आरटी पर 900 XG पर 5 मिनट के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र।
  4. ट्रिप्सिन का उपयोग कर एकल कक्षों के लिए ट्यूमर क्षेत्रों की गोली अलग कर देना, और फिर ऊपर वर्णित के रूप में एक और 7 दिनों (2.2 देखें) के लिए फिर से प्राप्त एकल कक्ष कोशिकाओं निलंबन का विस्तार करें।

3. चयापचय विश्लेषण (आरओएस उत्पादन और ऑक्सीजन की खपत)

  1. आरओएस उत्पादन
    1. यह आरओएस का पता लगाने के लिए एक सस्ती, तेज और व्यापक रूप से इस्तेमाल की जांच के बाद से इस प्रोटोकॉल में, हम आरओएस उत्पादन को मापने के लिए एक उदाहरण के रूप carboxy-DCFDA का इस्तेमाल किया है। हालांकि, इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कई अन्य जांच और तरीकों से कर रहे हैं।
    2. समय की आवंटित राशि के लिए 2.2 में वर्णित के रूप में मेटफार्मिन के साथ ट्यूमर क्षेत्रों समझो। उपचार के अंत में, एक 40 माइक्रोन सेल झरनी का उपयोग कर फसल ट्यूमर क्षेत्रों, 5 मिनट के लिए 900 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और tryps के 1 मिलीलीटर में गोली resuspendमें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. कोशिकाओं singularized कर रहे हैं एक बार, 900 XG पर अपकेंद्रित्र और 2.5 माइक्रोन carboxy-DCFDA युक्त HBSS में कोशिकाओं resuspend। अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    4. Carboxy-DCFDA फोटो ऑक्सीकरण झूठी सकारात्मक परिणाम दे रही है हो सकता है के रूप में प्रवाह cytometry विश्लेषण करने से पहले प्रकाश से दाग कोशिकाओं की रक्षा करना। विश्लेषण जब तक बर्फ पर ट्यूबों रखें।
      नोट: (।। पूर्व 488nm, उन्हें 520nm) प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों में से एक किस्म के साथ प्रतिक्रिया FL1 में पता लगाया जा रहा करने के बाद carboxy-DCFDA फ्लोरोसेंट है।
  2. ऑक्सीजन की खपत मापन
    1. इस प्रोटोकॉल के लिए, हम एक उदाहरण के रूप में, seahorse बायोसाइंसेज से कोशिकी फ्लक्स विश्लेषक प्रणाली का उपयोग करेगा। कोट आरटी पर 20 मिनट के लिए सेल और ऊतक चिपकने के 22.4 माइक्रोग्राम / एमएल के एक समाधान के साथ वांछित सेल संस्कृति की थाली। कोशिकाओं को बोने के लिए पहले 3 बार - पानी के साथ 2 कुओं कुल्ला।
    2. उपचार के अंत में, फसल ट्यूमर क्षेत्रों में एक 4 का उपयोग0 माइक्रोन सेल झरनी, अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 900 XG पर कोशिकाओं और trypsin के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. (: 150 μl अंतिम मात्रा) प्लेट / अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए 30,000 कोशिकाओं के घनत्व पर सेल संस्कृति की थाली में कोशिकाओं singularized। 8 मिमी ग्लूकोज और 2 मिमी सोडियम पाइरूवेट युक्त ऑक्सीजन की खपत परख मध्यम में कोशिकाओं Resuspend।
    4. 100 XG पर पहुँच गया है जब तक कुओं की स्पिन centrifugation द्वारा अच्छी तरह से नीचे करने के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और फिर ब्रेक के साथ बंद अपकेंद्रित्र बंद करो। थाली के उन्मुखीकरण उल्टा है और इस प्रक्रिया को दोहराएँ। 30 मिनट के लिए सीओ 2 के अलावा बिना एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली स्थानांतरण।
    5. इस बीच, परख के लिए कारतूस तैयार करते हैं। हर अच्छी तरह से लोड करने के लिए 4 अलग इंजेक्टर (25 μl / पोर्ट) है:
      1. पोर्ट एक: मेटफार्मिन। कुएं में 3 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 175 हो जाएगा अंतिम मात्रा के रूप में एक 8x समाधान (24 मिमी) तैयारμl बंदरगाह ए के इंजेक्शन के बाद
      2. पोर्ट बी: मेटफार्मिन। 3 मिमी जोड़ सकते हैं और अच्छी तरह से में 6 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, बंदरगाह बी के इंजेक्शन के बाद 200 μl होगा अंतिम मात्रा के रूप में एक 9x समाधान (27 मिमी) तैयार
      3. पोर्ट सी: मेटफार्मिन। 3 मिमी जोड़ सकते हैं और अच्छी तरह से में 9 एमएम की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, पोर्ट सी के इंजेक्शन के बाद 225 μl होगा अंतिम मात्रा के रूप में एक 10x समाधान (30 मिमी) तैयार
      4. पोर्ट डी: rotenone 11 माइक्रोन, अच्छी तरह से (11X) में अंतिम एकाग्रता के रूप में 1μM प्राप्त करने के लिए। नोट: rotenone पूरी तरह से किसी भी अवशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि को रोकता है।
    6. कारतूस ठीक करना और सेल संस्कृति प्लेट लोड। मिश्रण और माप के मानक प्रोटोकॉल के साथ परख प्रदर्शन करते हैं।
    7. (100% के रूप में सेट) rotenone के साथ प्राप्त निषेध के प्रतिशत के रूप में मेटफार्मिन द्वारा हासिल की कुल माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के निषेध के प्रतिशत की गणना।

4।Immunocompromised चूहों में मानव अग्नाशय के कैंसर के लिए xenograft मॉडल

नोट: आदेश प्रयोगों 33 के लिए इस तरह इशारा-SCID, SCID बेज, या एनएसजी के रूप में महिला athymic नग्न या अन्य, अधिक प्रतिरक्षा अक्षमता माउस मॉडल के लिए पर्याप्त संख्या। प्रयोग करने से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव और उन्हें इस्तेमाल करने के पहले आरटी को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं। चमड़े के नीचे ट्यूमर के लिए हम 8 ट्यूमर की कुल के लिए दिशा प्रति एक ट्यूमर के साथ हालत के प्रति 4 चूहों की एक न्यूनतम इस्तेमाल किया।

  1. Xenograft ट्रांसप्लांटेशन
    1. मानव अग्नाशय के कैंसर के ऊतकों के नमूनों से ट्यूमर के टुकड़े तैयार करें। एक पेट्री डिश में ट्यूमर स्थानांतरण और ऊतक धारण करने के लिए एक स्केलपेल और संदंश का उपयोग (~ 8 मिमी 3, व्यास में 2 मिमी) छोटे टुकड़ों में ऊतक काटना। पतला प्रोटीन मिश्रण समाधान में प्राप्त टुकड़े डुबकी बर्फ पर रखा।
    2. 3% isofluorane या अन्य inhalative या इंजेक्शन anesthetics - 1 का उपयोग चूहों anesthetize।
      नोट: किसी भी शल्य प्रक्रिया शुरू करने से पहलेedure, चूहों पूरी तरह से पेट की त्वचा उत्तेजक द्वारा चेतना खो दिया है या किरच संदंश की एक जोड़ी के साथ tows है कि सुनिश्चित करते हैं। सूखापन को रोकने के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
    3. संज्ञाहरण प्रभाव में ले लिया है एक बार, एंटीसेप्टिक इथेनॉल युक्त त्वचा के साथ चूहों के पीछे पोंछे। Buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा BW) से पहले पोस्ट ऑपरेटिव analgesia सुनिश्चित करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रशासन।
    4. एक 0.7 बनाने, संदंश के साथ वापस त्वचा लिफ्ट - बाँझ सूक्ष्म कैंची से 1.0 सेमी लंबा चीरा और फिर दो टूक रोगी व्युत्पन्न अग्नाशय के कैंसर ऊतक का एक टुकड़ा डाला जाता है, जिसमें एक छोटे से चमड़े के नीचे जेब, (~ 8 मिमी 3) तैयार करते हैं।
    5. 2 त्वचा स्टेपल - 1 का उपयोग कर घाव को बंद करें। 7 दिनों के बाद उन्हें हटा दें। उनके पिंजरों में चूहों लौटें और वे फिर से पूरी तरह से सक्रिय हैं जब तक एक हीटिंग पैड पर या एक हीटिंग दीपक के नीचे रहते हैं।
    6. ट्यूमर के आरोपण के बाद, hunche, ट्यूमर के विकास और इस तरह के लोगों में असंतोष बढ़ फर के रूप में रुग्णता उत्पन्न होने के सामान्य लक्षण के लिए कम से कम दो बार साप्ताहिक चूहों की निगरानीडी आसन, और गतिहीनता।
    7. ट्यूमर 200 मिमी 3 के एक औसत आकार तक पहुँच जाने के बाद, चूहों संबंधित उपचार के लिए बेतरतीब रहे हैं। आईपी ​​इंजेक्शन (150 मिलीग्राम / किग्रा BW) के माध्यम से या तुलनीय उपचार प्रभाव के साथ पीने के पानी (150 मिलीग्राम / किग्रा BW) के माध्यम से दैनिक वाहन या मेटफार्मिन प्रशासन।
    8. एक कैलीपर का उपयोग ट्यूमर बोझ मॉनिटर और ट्यूमर एक सप्ताह में एक बार मात्रा (ट्यूमर की मात्रा का माप = चौड़ाई × × सांस 1/2 लंबाई) की गणना।
    9. ट्यूमर व्यास में 1 सेमी तक पहुँच चुके हैं या ऊपर निर्दिष्ट के रूप में चूहों गंभीर दर्द या बीमारी के कोई लक्षण दिखा प्रारंभ करने के बाद चूहों बलिदान।

Representative Results

मेटफोर्मिन चुनिंदा अग्नाशय सीएससी लक्ष्य

हम पहले सीएससी की इन विट्रो में आत्म नवीकरण क्षमता पर मेटफार्मिन उपचार के कार्यात्मक प्रभाव की जांच की। इस प्रयोजन के लिए, हम सर्जरी के दौरान resected PDAC ऊतकों से अलग प्राथमिक मानव अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग कर क्षेत्र के गठन assays के आयोजन किया। हम मेटफार्मिन दृढ़ता का गठन क्षेत्रों (चित्रा 1 ए) के आकार में कमी आई कि मनाया। यह वे ही सीएससी के लिए समृद्ध कर रहे हैं के रूप में अभी भी क्षेत्रों में पाया कोशिकाओं के थोक का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो सीएससी के वंशज, के विस्तार में बाधा द्वारा सबसे अधिक संभावना थी। दरअसल, अब क्षेत्रों हो जाएगा और अधिक विभेदित संततियों का अधिक व्यापक विस्तार passaging बिना सुसंस्कृत हैं। इस प्रकार हम काफी सी के आत्म नवीकरण क्षमता के मजबूत निषेध का सुझाव एक खुराक पर निर्भर तरीके से होने वाली है, वास्तव में उनके आकार की परवाह किए बगैर गठन क्षेत्रों की संख्या में कमी करने के लिए मेटफार्मिन पायाअनुसूचित जातियों (डेटा) नहीं दिखाया। हम 3 मिमी कि मेटफार्मिन काफी (चित्रा 1 बी) का गठन क्षेत्रों की संख्या में कमी आई पाया। अधिक इसरो सीएससी की आत्म नवीकरण क्षमता पर मेटफार्मिन की लंबी अवधि के प्रभाव का अध्ययन करने के क्रम में, हम बाद में द्वितीयक और तृतीयक क्षेत्रों में गठित प्राथमिक क्षेत्रों passaged। केवल प्राथमिक क्षेत्रों मेटफार्मिन के साथ इलाज किया गया है, दूसरे और तीसरे मार्ग में क्षेत्रों के गठन के लिए तेजी से और तेजी से मेटफार्मिन उपचार वास्तव में अचल सीएससी (चित्रा 1C) के बहुमत का सफाया कर दिया था implicating, कम हो गया था। इस प्रकार, हमारे डेटा प्राथमिक अग्नाशय सीएससी की आत्म नवीकरण क्षमता पर मेटफार्मिन के लिए महत्वपूर्ण उपचार प्रभाव दिखाया है और इस प्रकार आगे यंत्रवत के साथ-साथ vivo अध्ययन में प्रदर्शन करने के लिए प्रोत्साहित किया।

मेटफोर्मिन Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत को रोकता है और आरओएस उत्पादन लाती है

Metformi के बादएन आंशिक रूप से जटिल मैं गतिविधि में बाधा से एक mitochondrial जहर के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया था, हम अगले क्षेत्र व्युत्पन्न कोशिकाओं में सेलुलर ऑक्सीजन की खपत पर मेटफार्मिन की तीव्र प्रभाव की जांच की। इस प्रयोजन के लिए, हम दो प्रतिनिधि प्राथमिक PDAC ट्यूमर से ली गई कोशिकाओं चयनित और 3 मिमी मेटफार्मिन (तीन इंजेक्शन) और 1 माइक्रोन rotenone (एक इंजेक्शन) के अनुक्रमिक इंजेक्शन के बाद समय के साथ ऑक्सीजन की खपत मापा जाता है। 2A चित्रा में दिखाया गया है, मेटफार्मिन इंजेक्शन विभिन्न ट्यूमर के बीच काफी विविध जो ऑक्सीजन की खपत में एक तेजी से और खुराक पर निर्भर कमी प्रेरित किया। हम पूरी तरह से माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत में बाधा के लिए सक्षम है जो rotenone, मैं अवरोध करनेवाला एक शक्तिशाली परिसर, इंजेक्शन लगाने के द्वारा मेटफार्मिन उपचार पर अवशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि गणना की थी। अपनी क्षमता के साथ सहसंबद्ध माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीजन की खपत के मामले में मेटफार्मिन के प्रति संवेदनशीलता लोकप्रियता का मतलब के विस्थापन के रूप में परिभाषित आरओएस उत्पादन के लिए प्रेरित करने के लिएआसानी से (चित्रा 2 बी, सही पैनल) की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जो मेटफार्मिन उपचार (चित्रा 2B, बाएं पैनल), के बाद आबादी। जैसी कि उम्मीद थी, ऑक्सीजन की खपत के निषेध के लिए सबसे अधिक संवेदनशील थे कि प्राथमिक कोशिकाओं को भी मेटफार्मिन उपचार पर आरओएस उत्पादन में मजबूत वृद्धि देखी गई। इस प्रकार, इन चयापचय में इन विट्रो प्रयोगों बाद में एक माइटोकॉन्ड्रियल आरओएस के उत्पादन में वृद्धि हुई है और apoptosis के अंत में प्रेरण, जिसके परिणामस्वरूप mitochondrial समारोह पर अपनी निर्भरता को रोकते हुए कि मेटफार्मिन लक्ष्य सीएससी प्रदर्शित करता है।

मेटफोर्मिन स्टालों PDAC प्रगति में विवो

हम अंत में PDAC के साथ विभिन्न रोगियों से ली गई ऊतक xenografts का उपयोग vivo में मेटफार्मिन के प्रभाव का अध्ययन किया। हम नियंत्रण समूह की तुलना में मेटफार्मिन इलाज चूहों के लिए ट्यूमर प्रगति में एक महत्वपूर्ण कमी मनाया, लेकिन ट्यूमर कभी नहीं पूरी तरह से ईंटppeared (चित्रा 3)। बाद में, लंबी अवधि के अनुवर्ती सभी ट्यूमर के दौरान अंत में उपचार के प्रारंभिक चरण में जीवित कोशिकाओं के मेटफार्मिन प्रतिरोध का सुझाव relapsed। फिर भी, मेटफार्मिन उपचार, एकल एजेंट के रूप में लागू किया जाता है, जब भी काफी सभी चूहों में अस्तित्व के लिए बढ़ा दिया।

चित्र 1
चित्रा 1. मेटफोर्मिन चुनिंदा सीएससी लक्ष्य। (ए) मेटफोर्मिन क्षेत्रों आकार कम किया है। क्षेत्रों के प्रतिनिधि छवियाँ 7 दिन (सही पैनल) के लिए मेटफार्मिन का संकेत खुराक के साथ इलाज के बाद प्राप्त की। क्षेत्र आकार (n≥6) (बाएं पैनल) की मात्रा का ठहराव, abscissas अक्ष में संकेत संख्या व्यक्ति ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) abscissas में 7 दिन (n≥6), संकेत दिया संख्या के लिए उपस्थिति या मेटफार्मिन के अभाव में क्षेत्र के गठन की क्षमताअक्ष व्यक्ति ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं। (सी) प्राथमिक अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं की द्वितीयक और तृतीयक क्षेत्रों में सीएससी आत्म नवीकरण क्षमता के प्रतिनिधि ग्राफ। क्षेत्रों के केवल 7 दिनों के कुल के लिए पहली पीढ़ी के क्षेत्र गठन के दौरान इलाज किया गया (एन = 6)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. मेटफोर्मिन उपचार रोकता ऑक्सीजन की खपत और लाती आरओएस उत्पादन। (ए) मेटफोर्मिन इसके अलावा क्षेत्र व्युत्पन्न कोशिकाओं की ऑक्सीजन की खपत (ओसीआर) को रोकता है। दो अलग अलग PDAC माध्यमिक क्षेत्रों मेटफार्मिन के साथ इलाज किया गया और ओसीआर परिवर्तन बाह्य प्रवाह विश्लेषण द्वारा मापा गया। Rotenone इंजेक्शन कुल माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर की खपत के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।X- अक्ष प्रत्येक कुएं में प्रोटीन सामग्री द्वारा सामान्यीकृत ऑक्सीजन / घंटा की pmol में ऑक्सीजन की खपत दर का प्रतिनिधित्व करता है। एक में इस्तेमाल किया (बी) PDAC क्षेत्रों मेटफार्मिन के साथ 8 घंटे के लिए इलाज किया गया और आरओएस उत्पादन carboxy-DCFDA का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया था। भूखंडों cytometry, वाम, प्रतिनिधि प्रवाह। ठीक है, तीन स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा का सारांश। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Vivo में मेटफोर्मिन स्टालों PDAC प्रगति। दो अलग अलग PDAC xenograft ऊतकों immunocompromised चूहों में प्रत्यारोपित किया गया और प्रारंभिक ट्यूमर ले सत्यापित किया गया था के बाद उपचार आवंटित की गई थी। चूहे मेटफार्मिन (मेट) के साथ इलाज पीने के पानी के लिए जोड़ा गया था (150 मिलीग्राम / किग्रा शरीर वीght; प्रति दिन पानी की खपत) के 5 मिलीलीटर पर आधारित है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

कई ट्यूमर के लिए सीएससी अवधारणा के उद्भव और बाद के सत्यापन के साथ, नशीली दवाओं के विकास के क्षेत्र में और अधिक कुशल कैंसर के उपचार विकसित करने और बाद में बीमारी पतन के लिए जोखिम को कम करने के लिए क्षमता के साथ, नई रफ्तार पकड़ ली है। हालांकि, सीएससी क्षेत्र समझ सीएससी मूल और प्रसार, और ट्यूमर वास्तुकला को आकार देने और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका के संदर्भ में प्राप्त किया जा करने के लिए एक प्रारंभिक राज्य और अधिक करने की जरूरत पर अब भी है।

इस संदर्भ में, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सार्थक सीएससी assays के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से प्राप्त आंकड़ों के बारे में सूचित व्याख्या सीएससी जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करता है। कई जैविक दृष्टिकोण से, गोला गठन एक बहुत ही मूल्यवान परख के रूप में उभरा है; फिर भी उपयोगकर्ताओं को ठीक से उनके प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या करने के क्रम में अपनी सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए। एक महत्वपूर्ण पहलू भी क्षेत्र प्रपत्र के मूल्यांकन से पहले विचार करने के लिएताजा रोगी व्युत्पन्न नमूनों से प्राप्त परिणामों की स्थापना कैंसर कोशिका लाइनों से प्राप्त उन लोगों से काफी अलग हो सकता है के बाद से tion के डेटा की जांच नमूने का मूल है।

क्लासिक क्षेत्र गठन assays के ultralow लगाव प्लेटों में प्रतिरूप घनत्व में कोशिकाओं को बोने और epidermal वृद्धि कारक की उपस्थिति (EGF) और / या समृद्ध बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (ख FGF) में क्षेत्र के गठन का मूल्यांकन, लेकिन सीरम मुक्त माध्यम से 21 शामिल 34। संस्कृति के माध्यम रचना भी विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा है। हमारे अनुभव में हम सीरम के अभाव में B27, bFGF और glutamine के साथ पूरक DMEM / F12 समान परिस्थितियों में सीएससी, बढ़ने का विस्तार करने और बनाए रखने के लिए एक इष्टतम मध्यम था पाया। हम इस संस्कृति हालत (मध्यम और निलंबन) में कोशिकाओं (CD133 + CD44 + और CD24 + सहित) कैंसर स्टेम सेल मार्कर की उच्च मात्रा में व्यक्त करते हैं और (सी के भेदभाव से जुड़े प्रोटीन व्यक्त नहीं कर पाया-20 और सी -19)।

इन assays के लिए मौलिक मान्यताओं में से एक प्रत्येक क्षेत्र यानी, एक क्षेत्र में एक ही स्टेम सेल के विस्तार का परिणाम है, प्रतिरूप है। हालांकि, क्षेत्रों कम बोने घनत्व 35 की उम्र में भी फ्यूज होने का खतरा है कि गतिशील संरचनाओं आंतरिक रूप से कर रहे हैं। चढ़ाना कोशिकाओं प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है और निश्चित रूप से एकत्रीकरण मुद्दे को दरकिनार कर सकते हैं अच्छी तरह से एक सेल / का घनत्व है। लेकिन फिर भी भावी छाँटे गए पूर्वज के लिए, यह नियमित रूप से कम होने के कारण आंतरिक क्षेत्र गठन गतिविधि के लिए बहुत कम क्षेत्र के गठन में परिणाम और भी कारण कमजोर पड़ने के प्रभाव को सीमित autocrine उत्तेजना के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। हमारे अनुभव में हम चढ़ाया कोशिकाओं का केवल 30% क्षेत्रों के रूप में सक्षम हैं कि मनाया। हम लगातार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से कम से कम 100 कोशिकाओं / का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

विकास सीएससी के लिए दूसरे की संस्कृति के तरीकों मीटर पर आधारित है, जैसे ठोस या अर्द्ध ठोस 3 डी संस्कृतियों (के आधार पर कर रहे हैंatrigel, मज्जा या methylcellulose)। इन विधियों सेल गतिशीलता और बाद में सेल एकत्रीकरण 36 सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन matrices के प्रत्येक अपनी सीमाओं भालू। उदाहरण के लिए, Matrigel एक घुलनशील तहखाने Engelbreth-होल्म-हंस (EHS) से अलग झिल्ली ट्यूमर है और निकालने के कई ऊतकों में पाया जटिल कोशिकी ट्यूमर वातावरण जैसा दिखता है, हालांकि, यह अक्सर यंत्रवत renders जो कई और अधिक या कम परिभाषित वृद्धि कारकों को नियंत्रित करता है बहुत मुश्किल विशिष्ट नियामक तत्वों के लिए अध्ययन करता है। विचार का एक और मुद्दा क्षेत्र बनाने की क्षमता और स्टेम सेल कार्यों विनिमेय शर्तों 34 नहीं हो रहा है। कुछ स्टेम और मूल कोशिकाओं में vivo स्टेम / पूर्वज समारोह बाहर नहीं है इन विट्रो में क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए क्षेत्र के गठन की क्षमता 37, विफलता प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है जबकि। उदाहरण के लिए, मौन स्टेम कोशिकाओं बस द्वारा प्रदान की कोशिकी संकेतों का जवाब नहीं हो सकता हैइन विट्रो संस्कृति की स्थिति में नहीं चुना गया। इस प्रकार, इन विट्रो में और अधिमान्यतया धारावाहिक passaging के दौरान शुद्ध सेल आबादी के विवो आत्म नवीकरण क्षमता में लंबे समय तक, साबित या स्टेम सेल समारोह का खंडन करने के क्रम में मूल्यांकन किया जाना चाहिए। इस संदर्भ में, भावी और साथ ही स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के विविध आबादी का प्रचार करने की क्षमता क्षेत्र के गठन परख का एक महत्वपूर्ण पहलू है और सीएससी क्षेत्र के लिए अत्यधिक मूल्यवान इस परख renders; के रूप में लंबे समय से अपनी सीमाओं को प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या के लिए ध्यान में रखा जाता है।

क्षेत्र के गठन assays के लिए व्यापक रूप से पूर्वव्यापी इन विट्रो में एकल कोशिका के स्तर पर आत्म नवीकरण और भेदभाव के लिए अपनी क्षमता के आधार पर स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उनके इन विवो आला से भावी स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और उनकी संतान की अनुमति है कि मार्कर की खोज के शुद्ध आबादी के कार्यात्मक संपत्तियों परिभाषित करने की अनुमति देता है। सीक्षेत्र के गठन की परख की ombination और FACS ठोस ऊतकों से कोशिकाओं को अलग या संस्कृति में PDAC के विशिष्ट उप-जनसंख्या को समृद्ध करने के लिए एक सफल रणनीति है। मूल ट्यूमर की विविधता को दर्शाती है, आत्म नवीकरण, अंतर और एक ट्यूमर आरंभ: उदाहरण के लिए, EpCAM, CD24 और CD44 के एक साथ अभिव्यक्ति करने में सक्षम सीएससी की एक उप-जनसंख्या को परिभाषित करता है। हरमन एट अल। CD133 + कोशिकाओं संवर्धित proliferative क्षमता के पास थी और सीएससी 15 कि सुविधाओं दिखाया। अन्य मार्करों भी सीएससी के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया गया है: ALDH- 1 (एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज-1) अभिव्यक्ति अग्नाशय के कैंसर के 38 में अत्यधिक tumorigenic कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है; डीएनए डाई Hoechst 33342 बाहर करने के लिए सक्षम कोशिकाओं, नामित पक्ष आबादी (सपा) की कोशिकाओं, ट्यूमर 39 आरंभ साबित हुई क्षमता है। हाल ही में हम एक subcellular autofluorescence डिब्बे अलग ट्यूमर प्रकार भर में विशेष सीएससी लक्षण के साथ मानव कोशिकाओं की एक विशिष्ट जनसंख्या की विशेषता है कि पता चलाइन मार्करों में से कोई भी चुनिंदा सीएससी की एक शुद्ध आबादी चिह्नित करने के लिए प्रकट होता है हालांकि कोशिकाओं के और अधिक परिष्कृत आबादी को शुद्ध 40।, मार्कर का अधिक से अधिक जटिल संयोजन FACS के लिए इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है।

कई सवाल अभी भी ट्यूमर की उत्पत्ति, प्रगति, और नशीली दवाओं के प्रतिरोध में सीएससी की सटीक भूमिका के बारे में रहते हैं। उदाहरण के लिए, एक सीएससी एक ट्यूमर शुरू की अगर और कैसे परिभाषित करने के लिए क्लोनल विकास के सवाल को संबोधित करने के लिए एक ही रास्ता है, रोग के विभिन्न चरणों में रोगी के नमूने का विश्लेषण है, और विशेष रूप से के दौरान और बाद में इलाज सीएससी की संख्या का पालन करने के लिए हो सकता है। इन सवालों का जवाब देने के द्वारा, हम ठोस ट्यूमर में सीएससी के हमारे ज्ञान का सार्थक प्रगति बनाने के लिए और अंततः ट्यूमर प्रगति और पतन को रोकने के लिए दवा के उपचारों का विकास कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा दिलचस्पी नहीं है।

Acknowledgments

वर्तमान अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया एक ईआरसी उन्नत अन्वेषक अनुदान (पा-सीएससी 233,460), अनुदान समझौता नहीं 256,974 (ईपीसी टीएम-नेट) और कोई 602,783 (सीएएम-पीएसी के तहत यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7 / 2007-2013) ), Subdirección जनरल डी Evaluación Y FOMENTO डे ला Investigación, Fondo डे Investigación SANITARIA (PS09 / 02,129 और PI12 / 02,643), और Programa नैशनल डे Internacionalización डे ला मैं + डी, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio डे अर्थशास्त्र Y Competitividad, स्पेन)। ई Lonardo रॉश फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। एम Cioffi ला Caixa predoctoral फैलोशिप कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Counting Chamber/Hemocytometer  Hausser Scientific Co 3200
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement Roche Innovatis AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Dissociator  Miltenyi Co 130-093-235
GentleMACS C Tubes  Miltenyi Co 130-093-237
24-well Ultra-low Attachment Plates  Corning 3474
100-mm tissue culture dishes  BD Falcon 353803
Cell strainer  BD Falcon 352350
15-ml polypropylene conical tube  BD Falcon 352097
50-ml polypropylene conical tube  BD Falcon 352070
1.5 ml sterile tubes  Eppendorf 0030 120.086
50 ml centrifuge tubes  Corning 430828
Sterile petri dishes, 10 cm dishes  Corning 353003
26 G needles  BD Falcon 300600
100 ul Hamilton Syringe  Hamilton Syringe Co 81075
Collagenase type IV  Stem Cell Technologies 7909
RPMI Medium 1640  Life technologies 11875-085
Penicillin/Streptomycin solution, 100X  Life technologies SV30010
Metformin  Sigma D150959-5G
L-glutamine, 200 mM, 100X  Life technologies 25030-081
D-Glucose  Sigma G8270
100mM Sodium Pyruvate solution  Life technologies 11360-070
Seahorse Assay medium  Seahorse Bioscience 100965-000
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive  BD Biosciences 354240
Trypsin solution, 0.05%  Life technologies 25300054
B27 Supplement 50x  Life technologies 17504-044
Basic Fibroblast Growth Factor  Sigma F0291
Bovine Serum Albumin  Sigma A9576
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12  Sigma D8437
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Sigma D8537
Trypan Blue  Life technologies 15250-061
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate)  Life technologies C-369
Rotenone Sigma R8875
Ethanol 70% (vol/vol)  Sigma 459844
Isofluorane IsoVet, Braun 571105.8
Matrigel BD Biosciences 35620
Sterile Cotton tipped applicator  Puritan medical
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges Seahorse Bioscience 102416-100
XF96e Extracellular Flux analyzer Seahorse Bioscience
Incubator with CO2 input 
Micro scissors
Curved forceps
Splinter forceps
Caliper

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References

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Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. J. Vis. Exp. (100), e52801, doi:10.3791/52801 (2015).

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