Abstract
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) indeholder en delmængde af udelukkende tumorgene cancer stamceller (CSCS), som har vist sig at drive tumor initiering, metastaser og modstandsdygtighed over for radio- og kemoterapi. Her beskriver vi en specifik metode til dyrkning af primære humane pancreas CSCS som tumor kugler i forankringsuafhængige betingelser. Celler dyrkes i serum-fri, ikke-adhærente betingelser for at berige for CSCS mens deres mere differentierede afkom ikke overlever og prolifererer i den indledende fase efter podning af enkeltceller. Dette assay kan anvendes til at estimere procentdelen af CSCS stede i en population af tumorceller. Både størrelse (som kan variere fra 35 til 250 mikrometer) og antallet af tumor dannede kugler repræsenterer CSC aktivitet nærede i enten bulk-populationer af dyrkede cancerceller eller friskhøstede og fordøjet tumorer 1,2. Anvendelse af dette assay for nylig fandt vi, at metformin selektivt ablaterer pancreatic CSCS; en konstatering af, at efterfølgende blev yderligere bekræftet ved at demonstrere formindsket udtryk for pluripotens-associerede gener / overflademarkører og reduceret in vivo tumorgenicitet for metformin-behandlede celler. Som det sidste skridt for præklinisk udvikling, vi behandlede mus med etablerede tumorer med metformin og fundet signifikant forlænget overlevelse. Kliniske undersøgelser afprøver brugen af metformin til patienter med PDAC er i øjeblikket i gang (f.eks NCT01210911, NCT01167738 og NCT01488552). Mekanistisk, fandt vi, at metformin inducerer en fatal energikrise i CSCS ved at forbedre reaktive ilt arter (ROS) produktion og reduktion af mitokondrie transmembranpotentiale. I modsætning hertil blev der ikke-CSCS ikke elimineres ved metformin behandling, men snarere undergik reversibel cellecyklusstandsning. Derfor vores undersøgelse tjener som et vellykket eksempel for potentialet i in vitro sfære dannelse som et screeningsværktøj til identifikation af forbindelser, der potentielt er målrettet mod CSCs, men vil denne teknik kræver yderligere in vitro og in vivo validering til at eliminere falske opdagelser.
Introduction
Pancreas ductal adenocarcinom (PDAC) er en af de mest aggressive solide tumorer. Det er i øjeblikket den 4. hyppigste kræftform dødsfald i det vestlige samfund og forventes at stige til 2. hyppigste årsag inden for det næste årti (~ 400.000 dødsfald om året på verdensplan) 3 .På diagnosetidspunktet 90% af patienterne er til stede med fremskreden sygdom, som har en 5-års overlevelse på mindre end 5%. Denne overlevelsesraten er skuffende uændret i de sidste 50 år på trods af stadig mere intensive forskningsaktiviteter 4. Af de resterende 10% af patienter, som har potentielt "helbredes sygdom gennem kirurgisk resektion, vil 80% dø af tilbagefald inden for 5 år. I mange år standarden for pleje af fremskreden sygdom har været gemcitabin monoterapi, men dette kun giver en marginal overlevelse fordel 5. Små forbedringer kortsigtet overlevelse er blevet opnået ved tilsætningaf erlotinib 6 eller capecitabin 7, men overlevelse fordel er i størrelsesordenen uger med mediane samlede overlevelse stadig ~ 6 måneder. For nylig har mere opmuntrende resultater opstået for gemcitabin / nab -paclitaxel 8 og FOLFIRINOX kombinationen regime 9,10. Disse behandlinger forbedrer median overlevelse ved en beskeden 2 og 4 måneder henholdsvis, men er meget giftige og langsigtede overlevende er stadig en sjælden undtagelse. Selvom behandling giver mulighed for forbedringer, disse er giftige regimer, som mange patienter ikke reagerer, eller kun vise trinvis forbedring i samlet overlevelse. Som en konsekvens heraf er der et presserende behov for at supplere de nuværende behandlinger og udvikle nye, mest sandsynlige multimodale behandlingsmetoder.
Tumor Heterogenitet
Det bliver stadig mere tydeligt, at kræft heterogenitet ikke kun begrænset til distinkt evolutionær subkloner within hver tumor 11, men også drevet af fænotypiske og funktionel heterogenitet og plasticitet inden for hver subklon 12. Såkaldte cancer stamceller (CSCS) eller tumorfremmende celler er ansvarlige for intraclonal heterogenitet 13-16. Konkret udgør CSCS en delmængde af kræftcelle, som vi og andre har givet afgørende bevis, ned til den enkelt celle, at de repræsenterer roden til sygdommen ved at give anledning til alle differentierede afkom inden for hver kræft subklon 17. Hvad vigtigere er, disse celler er afgørende for metastatisk adfærd og også udgør en vigtig kilde for sygdomstilbagefald efter behandling, selv med relativt effektive lægemidler stand til at inducere indledende tumorregression (f.eks nab -paclitaxel) 15,18-20. Det er vigtigt at bemærke, at CSCS ikke nødvendigvis repræsenterer bona fide stamceller, heller ikke de udspringer fra væv stamceller i mange tilfælde, men snarere de har ACQgendannes for visse funktioner i stamceller. De fleste af disse er funktionelt defineret, f.eks CSCS er udstyret med ubestemt selvfornyelse kapacitet, hvilket gør dem modstandsdygtige over for konventionel kemoterapi, og viser øget invasionsevne der fremmer metastatisk aktivitet.
Funktionelle Kræft stamceller fænotyper
Den funktionelle fænotype af CSCS er baseret på deres evne til at forny sig selv, som kan testes in vitro ved anvendelse af serielle sfære dannelse og kolonidannelse assays hhv. Endnu vigtigere, CSCS stand til selvfornyelse bear in vivo tumorgenicitet, der kan afprøves ved begrænsende fortynding in vivo-assays som den ultimative funktionelle udlæsning, fortrinsvis under seriel transplantation indikerer eksklusiv langsigtet tumorigenicitet. Desuden er der heterogenitet inden for CSC rummet, med en tydelig underpopulation af CSCS bærer den eksklusive mulighed for at give anledning til metastaser, der ikke blot er endirekte konsekvens af deres eksklusive in vivo tumorigenicitet. Faktisk metastastitic CSCS erhverve evnen til at unddrage sig den primære tumor, overlever anoikis og i sidste ende translokere og frø sekundære sites. Disse avancerede funktionsevne kan testes in vitro ved anvendelse af modificerede invasions assays og in vivo under anvendelse af metastase assays.
Målretning cancerstamceller
Vi og andre har tilvejebragt overbevisende dokumentation for, at behandlinger med fokus på hovedparten tumor af differentierede PDAC celler, selv i kombination med stroma-targeting agenter, ikke har en stor indvirkning på tumorprogression og efterfølgende resultat, medmindre kombineret med en CSC-targeting strategi 21, 22. Således er baseret på de afgørende funktioner CSCS i sygdomsprogression og modstandsdygtighed over for behandling, bør disse celler betyde et væsentligt element for enhver ny behandling tilgang 18,20, men vil kræve en langt mere grundig forståelse of de lovgivningsmæssige maskineri CSCS. Selvom CSCS og deres mere differentierede afkom bære identiske genetiske jorden stater med hensyn til genetiske ændringer, CSCS udviser tydelig og dermed epigenetisk beslutsom genekspression profiler som deler moduler med pluripotente stamceller. De fleste af de involverede i at generere inducerede pluripotente stamceller (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) gener er ikke kun været forbundet med kræft, men deres udtryk er for det meste begrænset til CSCS rum. Desuden har den funktionelle relevans CSCS ved tab-of-funktion forsøg med genetiske værktøjer til at målrette CSCS nu fast etableret CSC koncept for flere kræftformer 23-25. Mens de fleste af disse tilgange er baseret på musemodeller og derfor ikke let overføres til klinikken, de giver proof-of-concept for den potentielle kliniske relevans af målretning CSCS i kombination med bulk-tumorceller.
Studere Kræft stamceller i Vitro at identificere deres akilleshæl
For at identificere nye og klinisk relevante måder at målrette CSCS, er deres funktioner regelmæssigt undersøgt in vitro og sfære dannelse er meget udbredt i denne sammenhæng. Oprindeligt udviklet til at studere normal stamcelle biologi, herunder selv-fornyelse og differentiering kapacitet, blev denne analyse senere tilpasset til at studere CSCS in vitro og har været brugt til undersøgelse CSCS isoleret fra PDAC 20. Vi har fundet, at tumor kugler dannet af primære humane PDAC celler bærer alle distinkte funktioner i CSCS derfor indikerer de indeholder bona fide bugspytkirtlen CSCS 21. Således tumor sfære analysen er et effektivt redskab til screening for mere effektive behandlingsformer in vitro, men resultaterne skal evalueres yderligere i strengere in vivo assays. Faktisk bør data genereret med dette in vitro assay behandles med stor forsigtighed, da the assay kan gøres til genstand for væsentlige fejl. Meget standardiserede protokoller, herunder automatiseret optælling af dannede kugler, bør oprettes for at sikre reproducerbare og prædiktive data.
I denne sammenhæng har vi for nylig brugt denne analyse til at screene pancreas CSCS afledt af et bredt sæt af primære humane PDACs og viste, at disse celler er meget sårbare over for metabolisk omprogrammering af anti-diabetisk sammensatte metformin. Tidligere havde metformin blevet påvist at inhibere cancercelle ekspansion ved indirekte aktivering af AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) signalering og efterfølgende hæmning af mTOR 26, hvilket resulterer i reduceret proteinsyntese og celleproliferation 27. Ud over disse virkninger på kolben tumor befolkning, har vi og andre fundet, at metformin er i stand til at målrette og faktisk eliminere CSCS subpopulation i en række faste tumorer, såsom bryst-, esophageal cancer, glioblastom og pancreascancer 28-31 </ Sup>. Således metformin repræsenterer en lovende og sikker ny terapeutisk strategi for flere kræftformer med i øjeblikket udækket medicinsk behov. Desuden bruger kugle dannelse som en måde at berige for CSCS viste vi, at metformin primære virkninger på pancreas CSCS var uafhængig af AMPK aktivering og for det meste har påberåbt sig sin beskedne mitokondrietoksicitet (via hæmning af kompleks I), som tilsyneladende var dødelig for delmængde af CSCS alene. For sidstnævnte kunne vi vurdere deres cellulære ilt forbrug og mitokondrie ROS produktion som indikatorer for lægemidlets toksicitet på celleniveau. Efterfølgende kunne disse in vitro-data valideres i prækliniske musemodeller og faktisk resulterede i signifikant forlænget overlevelse 31. Den metode præsenteret heri muliggør hurtig generering af narkotika følsomhed profiler til CSCS, herunder undersøgelser af deres virkninger på CSC stofskifte. Vi har nu leverer udvidet eksperimentelle detaljer om de udnyttede complerende in vitro og in vivo procedurer.
Protocol
Humane PDAC tumorer blev opnået med skriftligt informeret samtykke (Comunidad de Madrid, Spanien (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) implantation af humane pancreas tumorer i immundefekte mus skal godkendes af Institutional Review Board samt Institutional . Animal Care og brug Udvalg (IACUC) Procedurerne for xenograft pancreas tumor musemodeller skal udføres i overensstemmelse med de institutionelle og nationale regler (her etiske komité af Instituto de Salud Carlos III Madrid, Spanien, Protokol PA 34_2012).
1. Kultur Medier
- Forbered komplet medium.
- Supplere RPMI-medium med 10% FBS, 100 enheder / ml penicillin / streptomycin. For 500 ml RPMI tilsættes 55 ml varmeinaktiveret FBS og 6 ml penicillin / streptomycin (10.000 U / ml, 100x).
- Opbevar komplet medium ved 4 ° C.
- Forbered CSCS Medium.
- Supplement serum-frit DMEM / F12 medium med 100 enheder / ml penicillin / streptomycin og 2 mM glutamin.
- Opbevar CSC medium ved 4 ° C. B27 (01:50) og 20 ng / ml bFGF er frisk til mediet før hvert forsøg.
BEMÆRK: Tilsætningen af B27 har vist sig at øge tumor sfære dannelse og gennemføre flere passager i sfære kulturer 32. Mediet præparat er et afgørende skridt og skal undersøges for hver celletype i kultur. Vi anbefaler test selvfornyelse og differentiering kapacitet af kugler og analysere udtryk for CSC markører ved flowcytometri (dvs. CD133 + og CD44 +).
- Forbered Ekstracellulær Flux assaymedium.
- Denne specifikke medie er basal DMEM 5030 indeholder vitaminer, aminosyrer og andre kosttilskud, men mangler glutamin, glucose, pyruvat og bikarbonat.
- For den nuværende assay supplere mediet med 2 mM glutamin, 8 mM glucose og 2 mM natriumpyruvat til en fuld mitokondrie metabolisk aktivitet.
BEMÆRK: Fraværet af natriumbicarbonat er afgørende for at præcist at måle ekstracellulær forsuring af celler, der vokser i kultur, idet regelmæssig medium indeholdende bicarbonat vil buffer pH-variationer under assayet. Derudover er anvendelsen af et basalt medium tillader en stram styring af koncentrationen af L-glutamin (som L-alanyl-glutamin) glucose eller natriumpyruvat nødvendig til forskellige assaybetingelser og / eller programmer.
2. Sphere Danner Assay og analyse
BEMÆRK: Alle vævskultur protokoller og manipulationer skal udføres ved hjælp af sterile teknikker med stor opmærksomhed med rent, vaskemiddel-fri, steril glas. Før brug, pre-varm hele medium og opløsning i en 37 ° C vandbad (som alternativ kan du bruge medium og løsninger forvarmet ved RT). Opnå Humant PDAC tumorer som tidligere beskrevet 21.
- Isolering af CSCS fra human PDAC (figur1)
- I en steril biosikkerhed kabinet overføre humane PDAC væv til en 60 x 15 mm kultur skål indeholdende 1 ml steril 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS). Hakke tumoren i små stykker (1 - 5 mm) under anvendelse af en steril skalpel og pincet.
- Der tilsættes 1 ml sterilt 1X PBS til dyrkningsskålen og gentag triturering trin, indtil vævet er fuldstændigt dissocieret, regelmæssigt kræver 3-4 runder. Overfør vævssuspension (øverst op til et endeligt volumen på 5 ml med 1X PBS) til et sterilt rør og mekanisk homogenisere det med en dissociator såsom gentleMACS.
- Inkubere den homogeniserede væv med collagenase (anvend 2,5 mg / ml collagenase i 1X PBS) i 60 minutter ved 37 ° C og centrifugeres i 5 minutter ved 900 x g. Dekanter supernatanten og resuspender cellepellets i 10 ml komplet medium. Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 um si og centrifugeres i 5 minutter ved 900 x g.
- Dekanteres og resuspenderpelletere med 5 ml røde blodlegemer lyseringsbuffer (ammonium-chlorid-kalium, ACK), og inkuberes
- Pellet resuspenderes i CSCS medium plade på en gelatineovertrukket skål og inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Dette trin vil fjerne de fleste af de fibroblastceller, der hurtigt fastgøres til pladen.
- Fjern pladen fra inkubatoren og omhyggeligt genvinde cellesuspension og kvantificere antallet af levedygtige (trypanblåt-negative) celler ved hjælp af et hæmocytometer. Til dette formål forsigtigt blande suspensionen og pipette 20 pi af suspensionen til et Eppendorf-rør. Tilsættes 20 pi (1: 1-forhold) af trypanblåt til cellerne i mikrocentrifugerør og bland godt. Pipette cirka 10 pi af blandingen på hæmocytometeret.
- Tælle alle klare celler inden for de fire hjørner kvadranter af optælling kammer til tælling af levedygtige celler. Bemærk: levedygtighed og udbyttet af celler kan variere betydeligt mellem tumor prøver. For PDAC prøver levedygtighed svinger jævnligt betweda 45-70%, og vævsstykker fra en makroskopisk tumor prøve med en diameter på 3 - 5 mm bør give til ca. 5x10 6 levedygtige celler.
- Sphere Dannelse Assay og Metformin behandling
- Tag det nødvendige antal celler og tilsæt passende volumen af CSCS medium at fremstille en cellekoncentration på 2.000 celler / ml. Må ikke holde cellesuspensionen på is i længere end 1 time og blandes godt før plating.
- Tilsættes 500 pi 1X PBS til den første og sidste række i en plade med 24 brønde til befugtning, for at hjælpe med at minimere medium fordampning. Pode celler i ultralave vedhæftede celler plader ved en densitet på 2.000 celler per brønd i 1 ml tumor sfære medium (2.000 celler / ml).
BEMÆRK: Antallet af celler til tumor sfære dannelse assays kan variere mellem tumortyper. - Behandle mindst 4 brønde med vehikel (negativ kontrol) og 4 brønde med hver tildelt behandling, f.eks., 3 mM af metformin. Place cellerne i en inkubator indstillet til 37 ° C og forsyne cellerne med 5% CO2 i en uge.
BEMÆRK: Mediet bør ikke ændres for at tillade den uforstyrrede dannelse af tumor kugler, men kan suppleres med vækstfaktorer på daglig basis, da de ikke er stabile i dyrkningsmedium. - Hver anden dag tilføje behandling, f.eks., 3 mM af metformin eller køretøj til hver af brøndene. Vurdere antallet af dannede tumor sfærer efter 5 og / eller 7 dage ved anvendelse af en automatiseret celletæller der muliggør tælling af større strukturer (figur 2).
BEMÆRK: Kun tumor kugler med mindst 40 um bør overvejes, og kan kategoriseres som små (40-80 um) eller store (80-120 um), hhv. Resultaterne kan illustreres som den procentdel af tumor kugler divideret med det oprindelige antal celler podet (f.eks, 2.000 celler).
- Seriepassage i Første Generation Tumor Spheres
- Dissociere pellet af tumor kugler til enkelte celler under anvendelse af trypsin, og derefter udvide den opnåede enkeltcelle-celler suspension igen for yderligere 7 dage som beskrevet ovenfor (se 2.2).
3. Metabolisme Analysis (ROS Produktion og Oxygen Forbrug)
- ROS Produktion
- I denne protokol, har vi brugt carboxy-DCFDA som et eksempel til at måle ROS produktionen, da det er en overkommelig, hurtig og udbredte sonde til ROS detektion. Men der er flere andre prober og metoder, der kan anvendes til dette assay.
- Forkæl tumor kugler med metformin, som beskrevet i 2.2 for den tildelte tid. Ved afslutningen af behandlingen, høst tumor kugler under anvendelse af en 40 um cellefilter, centrifugeres cellerne ved 900 x g i 5 min, og pellet resuspenderes i 1 ml trypsi. Der inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C.
- Når cellerne er singularized, centrifuger ved 900 xg og resuspender cellerne i HBSS indeholdende 2,5 pM carboxy-DCFDA. Inkubér cellerne i 20 minutter ved 37 ° C i mørke.
- Forud for flowcytometri analyse beskytte farvede celler fra lys som carboxy-DCFDA kan være foto-oxideret give falske positive resultater. Rørene anbringes på is indtil analyse.
BEMÆRK: carboxy-DCFDA er fluorescerende efter reaktion med en række reaktive oxygen og nitrogenforbindelser, der påvises i FL1 (ex 488 nm, em 520 nm..).
- Oxygen Forbrug Måling
- Til denne protokol, vil vi bruge de ekstracellulære Flux Analyzer system fra Seahorse Biosciences, som et eksempel. Coat den ønskede cellekultur plade med en opløsning af 22,4 ug / ml af celler og væv lim til 20 minutter ved stuetemperatur. Skyl brøndene med vand 2 - 3 gange før såning cellerne.
- Ved afslutningen af behandlingen, høst tumor kugler med en 40 um cellefilter, centrifugeres cellerne ved 900 x g i 5 min, og pellet resuspenderes i 1 ml trypsin. Der inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C.
- Plade singularized celler i cellekultur plade ved en tæthed på 30.000 celler / brønd i en plade med 96 brønde (slutvolumen: 150 pi). Resuspender cellerne i Oxygenforbrug assaymedium indeholdende 8 mM glucose og 2 mM natriumpyruvat.
- Centrifugeres cellerne til bunden af brønden ved spin centrifugering af brøndene indtil 100 xg er nået, og derefter lade centrifugen stoppet med bremse fra. Vende orienteringen af pladen og gentage processen. Overføre pladen til en 37 ° C inkubator uden tilsætning af CO2 i 30 min.
- I mellemtiden forberede patronen til assayet. Hver brønd har 4 forskellige injektorer at indlæse (25 ul / port):
- Port A: metformin. Til opnåelse af en slutkoncentration på 3 mM i brønden, fremstille en 8x opløsning (24 mM) som det endelige volumen vil være 175pi efter injektion af port A.
- Port B: metformin. At tilføje 3 mM og opnå en slutkoncentration på 6 mM i brønden, fremstille en 9x opløsning (27 mM) som det endelige volumen vil være 200 pi efter injektion af port B.
- Port C: metformin. At tilføje 3 mM og opnå en slutkoncentration på 9 mm i brønden, fremstille en 10x-opløsning (30 mM) som det endelige volumen vil være 225 pi efter injektion af port C.
- Port D: rotenon 11 uM til opnåelse af 1 uM som slutkoncentration i brønden (11x). Bemærk: rotenon fuldstændig hæmmer enhver resterende mitokondriel aktivitet.
- Kalibrere patronen og indlæse celledyrkningspladen. Udføre analysen med standardprotokollen for blanding og måling.
- Beregn procentdelen af inhibering af den samlede mitokondrielle respiration opnås ved metformin som procentdelen af inhibering opnået med rotenon (sat til 100%).
4.Xenograft Model for human kræft i bugspytkirtlen hos immunkompromitterede mus
BEMÆRK: Bestil tilstrækkeligt antal kvindelige athymiske nøgne eller andre, mere immunsvækkede musemodeller som NOD-SCID, SCID-Beige eller NSG for forsøgene 33. Autoklaver alle kirurgiske instrumenter forud for forsøget, og lad dem køle ned til stuetemperatur før brug. For subkutane tumorer anvendte vi et minimum af 4 mus pr tilstand med en tumor pr flanke for alt 8 tumorer.
- Xenograft Transplantation
- Forbered tumorstykker fra humane pancreas cancer vævsprøver. Overfør tumoren i en petriskål og dissekere vævet i små stykker (2 mm i diameter, ~ 8 mm 3) ved anvendelse af en skalpel og pincet til at holde vævet. Dyp de opnåede stykker i gelatinøse protein blandingsopløsning holdes på is.
- Bedøver mus under anvendelse 1 - 3 ud% isofluoran eller andre Inhalative eller injicerbare anæstetika.
BEMÆRK: Før du starter ethvert kirurgisk procedure, at musene fuldstændig har mistet bevidstheden ved at stimulere den abdominale hud eller blår med et par splinter pincet. Påfør øjensalve at forhindre tørhed. - Når bedøvelsen er trådt i kraft, skal du tørre bagsiden af mus med ethanol-holdige hud antiseptisk. Administrere buprenorphin (0,05 mg / kg legemsvægt) før operation for at sikre postoperativ analgesi.
- Løft bagsiden hud med pincet, lave en 0,7-1,0 cm langt indsnit med sterile mikro saks og derefter ligeud forberede en lille subkutan lomme, hvori et stykke af patient-afledt bugspytkirtelkræft væv indsættes (~ 8 mm 3).
- Lukke såret under anvendelse 1 - 2 hud hæfteklammer. Fjerne dem efter 7 dage. Retur musene til deres bure og holde dem på en varmepude eller under en varmelampe, indtil de er fuldt aktive igen.
- Efter tumor implantering, overvåge mus mindst to gange ugentligt til tumorvækst og generelle tegn på opstår morbiditet såsom pjusket pels, hunched kropsholdning, og immobilitet.
- Når tumorer har nået en gennemsnitlig størrelse på 200 mm3, er mus randomiseret til respektive behandlinger. Administrere køretøj eller metformin dagligt via ip injektioner (150 mg / kg kropsvægt) eller via drikkevandet (150 mg / kg legemsvægt) med sammenlignelige behandlingseffekt.
- Overvåg tumorbyrde anvendelse af en skydelære og beregne tumorvolumen gang om ugen (måling af tumorvolumen = 1/2 længde × ånde × bredde).
- Ofre musene, når tumorerne har nået 1 cm i diameter eller mus begynde at vise tegn på stærk smerte eller sygdom, som angivet ovenfor.
Representative Results
Metformin selektivt Mål Pankreatiske CSCS
Vi først undersøgt de funktionelle effekter af metformin behandling på in vitro selvfornyelse kapacitet CSCS. Til dette formål, gennemførte vi sfære dannelse analyser ved hjælp af primære humane bugspytkirtelkræftceller isoleret fra PDAC væv reseceret under operationen. Vi observerede, at metformin faldt kraftigt på størrelse med dannede kugler (figur 1A). Dette var sandsynligvis ved at hæmme udbygningen af afkom af CSC, som stadig udgør størstedelen af celler, der findes i områder, da de kun er beriget for CSCS. Faktisk er de længere kugler dyrkes uden passage af mere omfattende udvidelse af mere differentierede afkom vil være. Således fandt vi metformin væsentligt reducere antallet af faktisk dannet uanset størrelse kugler, der forekommer i en dosisafhængig måde tyder stærk hæmning af selvfornyelse kapacitet CSC'er (data ikke vist). Vi fandt, at metformin ved 3 mM faldt betydeligt antallet af sfærer dannet (figur 1B). For at strengere studere de langsigtede virkninger af metformin på selvfornyelse kapacitet CSCS, vi efterfølgende passeret de dannede primære sfærer i sekundære og tertiære sfærer. Selvom kun primære sfærer blev behandlet med metformin, blev dannelsen af kugler i den anden og tredje passager drastisk og i stigende grad reduceret, implicerer metformin behandlingen var faktisk irreversibelt fjernet størstedelen af CSCS (figur 1C). Således er vores data viste signifikante behandling virkninger for metformin på selvfornyelse kapacitet af primære pancreas CSCS og opmuntret dermed os til at udføre yderligere mekanistisk samt in vivo studier.
Metformin Hæmmer mitokondrie Oxygen Forbrug og inducerer ROS Produktion
Da metformin blev vist at virke som en mitokondrisk gift ved delvist at inhibere kompleks I-aktivitet, vi undersøgte dernæst de akutte virkninger af metformin på cellulær iltforbrug i sfære-afledte celler. Til dette formål valgte vi celler afledt fra to repræsentative delprøver PDAC tumorer og målte oxygenforbrug over tid efter sekventiel injektion af 3 mM metformin (tre injektioner) og 1 uM rotenon (én injektion). Som vist i figur 2A, metformin injektion inducerede en hurtig og dosisafhængigt fald i oxygenforbrug, som varierede betydeligt mellem de forskellige tumorer. Vi beregnede resterende mitokondrielle aktivitet ved metformin behandling ved injektion af rotenon, en potent kompleks I-inhibitor, som er i stand til fuldstændigt at inhibere mitokondrisk iltforbrug. Følsomhed over for metformin i form af mitokondrie iltforbrug korreleret med dets evne til at inducere ROS produktion defineret som en forskydning af middelværdien af den pning efter metformin behandling (figur 2B, venstre panel), som let kan kvantificeres (figur 2B, højre panel). Som forventet de primære celler, der var mest følsom for inhibering af oxygenforbruget viste også den stærkeste stigning i ROS produktion ved metformin behandling. Således er disse metaboliske in vitro eksperimenter viser, at metformin mål CSCS ved at hæmme deres afhængighed af mitokondrisk funktion, hvilket resulterer i en efterfølgende stigning i mitokondrie ROS produktion og til sidst induktion af apoptose.
Metformin Stalls PDAC Progression in vivo
Vi endelig undersøgt virkningerne af metformin in vivo under anvendelse af væv xenografter afledt fra forskellige patienter med PDAC. Vi observerede en signifikant reduktion i tumor progression for metformin-behandlede mus i sammenligning med kontrolgruppen, men tumorer aldrig helt DISAppeared (figur 3). Efterfølgende under langvarige opfølgende alle tumorer med tiden tilbagefald tyder metformin modstand af celler overlever den tidlige fase af behandlingen. Ikke desto mindre, metformin behandling, selv når den anvendes som enkeltstof, betydeligt udvidet overlevelse i alle mus.
Figur 1. Metformin selektivt Mål den CSCS. (A) Metformin faldt størrelsen af kugler. Repræsentative billeder af kugler opnået efter behandlingen med de angivne doser af metformin i 7 dage (højre panel). Kvantificering af kugle størrelse (n≥6) (venstre panel), repræsenterer de angivne numre i abscissen akse individuelle tumor. (B) Sphere dannelse kapacitet i nærvær eller fravær af metformin i 7 dage (n≥6), de angivne numre i abscissenaksen repræsenterer individuelle tumor. (C) Repræsentant graf over CSC selvfornyelse kapacitet i sekundære og tertiære sfærer af primære bugspytkirtelkræftceller. Kuglerne blev kun behandlet i løbet af første generation sfære dannelse for i alt 7 dage (n = 6). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Metformin behandling inhiberer Oxygen Forbrug og inducerer ROS Production. (A) Metformin tilføjelse hæmmer iltforbrug (OCR) af kugle-afledte celler. To forskellige PDAC sekundære sfærer blev behandlet med metformin og OCR ændringer blev målt ved ekstracellulær flux analyse. Rotenon injektion blev anvendt som kontrol for total OCR forbrug mitokondrie.X-aksen repræsenterer oxygenforbrugshastigheden i pmol oxygen / time normaliseret ved proteinindholdet i hver brønd. (B) PDAC sfærer anvendes i A blev behandlet i 8 timer med metformin og ROS-produktion blev vurderet ved flowcytometri under anvendelse carboxy-DCFDA. Venstre, repræsentativ flowcytometri plots. Right, sammenfatning af data fra tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Metformin Stalls PDAC Progression In Vivo. To forskellige PDAC xenograft væv blev implanteret i immunkompromitterede mus og behandling blev tildelt efter første tumor tage blev verificeret. Mus blev behandlet med metformin (Met) tilsat til drikkevand (150 mg / kg legemsvægt weiGHT; baseret på 5 ml vand forbrug per dag). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Med fremkomsten og efterfølgende validering af CSC begreb for mange tumorer, har inden for lægemiddeludvikling fået ny fremdrift, med mulighed for at udvikle mere effektive kræftbehandling og efterfølgende reducere risikoen for sygdom tilbagefald. Men CSC feltet er stadig på et tidligt stat og mere skal nås i form af forståelse CSC oprindelse og udbredelse, og deres rolle i udformningen af tumor arkitektur og fremme metastaser.
I denne sammenhæng er anvendelsen af reproducerbare og meningsfulde CSC assays samt den informerede fortolkning af opnåede data repræsenterer en afgørende komponent for at fremme vores forståelse af CSC biologi. Fra mange biologiske perspektiver har sfære dannelse opstået som en særdeles værdifuld assay; alligevel brugere bør være opmærksomme på dens begrænsninger med henblik på korrekt fortolke deres eksperimentelle resultater. Et vigtigt aspekt at overveje endnu før evalueringen af kugle formation data er oprindelsen af den undersøgte prøve, da de opnåede resultater fra friske patient-afledte prøver kan være væsentligt forskellige fra dem, der opnås fra etablerede cancercellelinier.
Klassiske sfære formation assays involverer podning celler ved klonal densitet i ultralav-fastgørelsesplader og evaluering sfære dannelse i nærvær af epidermal vækstfaktor (EGF) og / eller basisk fibroblastvækstfaktor (b-FGF) beriget, men serum-frit medium 21, 34. Dyrkningsmediet sammensætning er også et vigtigt spørgsmål at overveje. Vores erfaring fandt vi, at DMEM / F12 suppleret med B27, bFGF og glutamin i fravær af serum var et optimalt medium at vokse, udvide og vedligeholde CSC i udifferentierede betingelser. Vi fandt, at i denne kultur tilstand (medium og suspension) cellerne udtrykker høje mængder af kræft stamceller markører (herunder CD133 +, CD44 + og CD24 +) og udtrykker ikke differentiering-associerede proteiner (CK-20 Og CK-19).
En af de grundlæggende forudsætninger for disse analyser er, at hver kugle er klonal, dvs en kugle skyldes udvidelsen af en enkelt stamcelle. Men kugler er uløseligt dynamiske strukturer, der er tilbøjelige til at smelte, selv ved lav udsåningstæthed 35. Plating celler er et afgørende skridt i protokollen og tætheden af en celle / brønd kan helt sikkert omgå sammenlægning spørgsmålet. Men selv for fremadrettet sorteret progenitorer, dette resulterer jævnligt i meget lav sfære dannelse på grund af lav iboende sfære dannelse aktivitet og kan også tilskrives begrænset autokrin stimulering grund fortyndingsvirkninger. Vores erfaring observerede vi, at kun 30% af celler udpladet er i stand til at danne sfærer. Vi anbefaler at bruge mindst 100 celler / brønd for at opnå konsistente og reproducerbare resultater.
Andre dyrkningsmetoder for vækst CSC er baseret på faste eller halvfaste 3D kulturer (f.eks, baseret på matrigel, collagen eller methylcellulose). Er blevet anvendt disse metoder til begrænsning celle mobilitet og efterfølgende celleaggregering 36. Men hver af disse matricer bærer, deres egne begrænsninger. For eksempel Matrigel er en opløselig basalmembran isoleret fra Engelbreth-Holm-Swan (EHS) tumor, og selvom ekstrakten ligner det komplekse ekstracellulære miljø tumor findes i mange væv, det indeholder flere mere eller mindre definerede vækstfaktorer, som ofte gør aftalen mekanistisk undersøgelser for specifikke regulatoriske elementer meget vanskelige. Et andet forhold er, at kugle-dannende kapacitet og stamceller funktioner er ikke udskiftelige vilkår 34. Selv om der er vist visse stamceller og progenitorceller at udvise kugle-dannende evne 37, manglende generere sfærer in vitro udelukker ikke in vivo stamceller / progenitor funktion. For eksempel kan hvilende stamceller simpelthen ikke reagere på de ekstracellulære signaler, som denudvalgte in vitro dyrkningsbetingelser. Således langsigtet in vitro og in vivo selvfornyelse kapacitet oprensede cellepopulationer, fortrinsvis under seriepassage, bør vurderes med henblik på at bevise eller modbevise stamcelle-funktion. I denne sammenhæng evnen til fremadrettet og samtidig udbrede forskelligartede populationer af stamceller og progenitorceller er et afgørende aspekt af kuglen-dannende assay og gør dette assay meget værdifuldt for CSC område; så længe dens begrænsninger holdes i tankerne for fortolkningen af de opnåede data.
Sphere-dannende assays er ofte blevet brugt til med tilbagevirkende kraft at identificere stamceller baseret på deres evne til selv at fornyelse og differentiering på enkelt celle niveau in vitro. Opdagelsen af markører, der tillader den potentielle isolering af stamceller, og deres afkom fra deres in vivo niche tillader de funktionelle egenskaber af oprensede populationer skal defineres. Combination af kugle dannelse assay og FACS er en vellykket strategi for at isolere celler fra fast væv eller berige specifikke subpopulationer af PDAC i kultur. For eksempel, samtidig udtryk for EpCAM, CD24 og CD44 definerer en subpopulation af CSCS kunne: selvfornyelse, differentiere og initiere en tumor, der afspejler heterogenitet af den oprindelige tumor. Hermann et al. viste, at CD133 + celler besad augmented proliferativ kapacitet og CSC har 15. Andre markører er også blevet anvendt til karakterisering af CSCS: ALDH- 1 (aldehyddehydrogenase-1) ekspression er forbundet med yderst tumorigene celler i pancreascancer 38; celler i stand til at udelukke DNA farvestof Hoechst 33342, opkaldt side befolkning (SP) celler, har bevist evne til at initiere tumorer 39. For nylig viste vi, at en subcellulære autofluorescens rum kendetegner et særskilt population af humane celler med eksklusive CSC træk på tværs af forskellige tumortyper40. Selv om ingen af disse markører tilsyneladende selektivt karakterisere en ren population af CSCS, mere og mere komplekse kombinationer af markører skal bruges til FACS oprense mere raffinerede populationer af celler.
Mange spørgsmål er stadig om den præcise rolle CSCS i oprindelse, progression, og lægemiddelresistens af tumorer. For eksempel er en måde at behandle spørgsmålet om klonal evolution at definere, om og hvordan en enkelt CSC indleder en tumor, kunne være at analysere patientprøver på forskellige stadier af sygdommen, og specifikt at følge antallet af CSCS under og efter behandling. Ved at besvare disse spørgsmål, kan vi gøre meningsfulde fremskridt i vores viden om CSCS i solide tumorer og udvikle lægemiddelterapier til i sidste ende forhindre tumor progression og tilbagefald.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesse at afsløre.
Acknowledgments
Den nuværende forskning blev støttet af et ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233.460), Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskudsaftale nr 256974 (EPC-TM-NET) og nr 602783 (CAM-PAC ), Den Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02643), og Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo blev støttet af Roche Fellowship. M. Cioffi blev støttet af La Caixa Predoctoral Fellowship Programme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
| 24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
| 100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 15-ml polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50-ml polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
| 26 G needles | BD Falcon | 300600 | |
| 100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
| Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
| RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
| Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
| Metformin | Sigma | D150959-5G | |
| L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| 100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
| Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
| Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
| B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
| Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
| Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
| Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
| Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
| XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Incubator with CO2 input | |||
| Micro scissors | |||
| Curved forceps | |||
| Splinter forceps | |||
| Caliper |
References
- Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis. Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Burris, H. A. 3rd, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).
- Moore, M. J., et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).
- Cunningham, D., et al. Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer. J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Gourgou-Bourgade, S., et al. Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial. J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. Stem cells & pancreatic cancer. Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).
- Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives. Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).
- Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy. Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Gallmeier, E., et al. Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction. Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).
- Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. Cancer stem cells in solid tumors. Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Li, C., et al. c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target. Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Shaw, R. J., et al. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).
- Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena. Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).
- Honjo, S., et al. Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer. Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).
- Wurth, R., et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt. Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).
- Cufi, S., et al. Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts. Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).
- Lonardo, E., et al. Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells. PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).
- Gu, Y., et al. The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres. J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).
- Ishizawa, K., et al. Tumor-initiating cells are rare in many human tumors. Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).
- Seaberg, R. M., van der Kooy, D. Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors. J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
