Abstract
Bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) inneholder et delsett av utelukkende tumorigene kreft stamceller (cscs) som har vist seg å kjøre startfasen, metastaser og motstand mot radio- og kjemoterapi. Her beskriver vi en bestemt metodikk for dyrking primære humane bukspyttkjertelen cscs som kreftkuler i forankringsuavhengig forhold. Celler dyrkes i serum-fri, ikke-heftende forhold for å berike for cscs mens deres mer differensierte progenies ikke overlever og sprer i den innledende fasen etter såing av enkeltceller. Denne analysen kan brukes til å anslå andelen av cscs er tilstede i en populasjon av tumorceller. Både størrelsen (som kan variere 35-250 mikrometer) og antallet tumor sfærer dannes representerer CSC aktivitet holdes i enten bulk populasjoner av dyrkede cancerceller eller nyhøstede og spaltet tumorer 1,2. Ved hjelp av denne analysen, vi nylig funnet ut at metformin selektivt ablates pancreatic cscs; et funn som senere ble ytterligere bekreftet ved å demonstrere redusert uttrykk for pluripotency assosierte gener / overflatemarkører og redusert in vivo tumorigenicity av metformin-behandlede celler. Som det siste trinnet for preklinisk utvikling vi behandlet mus med etablerte svulster med metformin og fant signifikant forlenget overlevelse. Kliniske studier teste bruk av metformin hos pasienter med PDAC er for tiden i gang (f.eks NCT01210911, NCT01167738, og NCT01488552). Mekanistisk, fant vi at metformin induserer en fatal energikrise i cscs ved å styrke reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon og redusere mitokondrie transmembrane potensial. I motsetning til dette, var ikke-cscs ikke elimineres ved behandling metformin, men snarere gikk reversible cellesyklus-stans. Derfor serverer vår studie som et vellykket eksempel på potensialet for in vitro sfære formasjon som et screeningverktøy for å identifisere stoffer som potensielt er rettet mot CSCs, men denne teknikken vil kreve ytterligere in vitro og in vivo validering for å eliminere falske funn.
Introduction
Bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) er en av de mest aggressive solide tumorer. Det er i dag den 4. vanligste kreftrelaterte dødsfall i vestlige samfunn, og er spådd å stige til 2 nd hyppigste årsaken løpet av det neste tiåret (~ 400.000 dødsfall per år på verdensbasis) 3 .På diagnosetidspunktet 90% av pasientene til stede med langt fremskreden sykdom, som har en 5 års overlevelse på mindre enn 5%. Denne overlevelsesraten har skuff uendret de siste 50 årene til tross for stadig mer intensive forskningsvirksomhet 4. Av de resterende 10% av pasienter som har potensielt 'herdbare' sykdom gjennom kirurgisk reseksjon, vil 80% dø av tilbakefall i løpet av 5 år. For mange år standard vare for avansert sykdom har vært gemcitabin monoterapi, men dette bare ensidige marginal overlevelse fordel 5. Små forbedringer i kortsiktig overlevelse er oppnådd ved tilsettingav erlotinib 6 eller kapecitabin 7, men overlevelsesgevinst er i størrelsesorden uker med median total overlevelse still ~ 6 måneder. Nylig har flere oppmuntrende resultater dukket opp for gemcitabin / nab -paclitaxel 8 og FOLFIRINOX kombinasjon regime 9,10. Disse behandlingene forbedre median overlevelse ved en beskjeden 2 og 4 måneder henholdsvis, men er svært giftige og langsiktige overlevende er fortsatt et sjeldent unntak. Selv om behandling tilbyr muligheter for forbedring, disse er giftige regimer som mange pasienter ikke responderer eller bare viser trinnvis forbedring i total overlevelse. Som en konsekvens av dette, er det et sterkt behov for å supplere dagens behandlingsformer og for å utvikle nye, mest sannsynlig multimodale terapeutiske tilnærminger.
Tumor Heterogenitet
Det blir stadig tydeligere at kreft heterogenitet er ikke bare begrenset til distinkte evolusjonære subkloner within hver tumor 11, men også drevet av fenotypiske og funksjonell heterogenitet og plastisitet i hver subklon 12. Såkalte kreft stamceller (cscs) eller tumor fremme cellene er ansvarlige for intraclonal heterogenitet 13-16. Nærmere bestemt cscs representerer en undergruppe av kreftcelle, som vi og andre har gitt bevis, ned til én celle, at de representerer roten av sykdommen ved å gi opphav til alle differensierte progenies innenfor hver kreft subklon 17. Enda viktigere, disse cellene er viktig for metastatisk atferd og også representerer en viktig kilde til sykdom tilbakefall etter behandling, selv med relativt effektive legemidler som kan indusere initial tumor regresjon (f.eks nab -paclitaxel) 15,18-20. Det er viktig å merke seg at cscs ikke nødvendigvis representerer bona fide stamceller, heller ikke de oppstår fra vev stamceller i mange tilfeller, men heller de har ACQuired visse funksjoner på stamceller. De fleste av disse er funksjonelt definert, for eksempel cscs er utstyrt med ubestemt selvfornyelse kapasitet som gjør dem motstandsdyktige mot konvensjonell kjemoterapi, og viser økt invasivitet som fremmer metastatisk aktivitet.
Funksjonelle Cancer Stem Cell fenotyper
Den funksjonelle fenotypen cscs er basert på deres evne til å fornye seg selv, som kan testes in vitro ved å bruke serielle kuledannelse og kolonidannelse assays respektivt. Enda viktigere er cscs stand til selvfornyelse bear in vivo tumordannelse som kan testes ved begrensende fortynning in vivo, som det endelige funksjonelle avlesning, fortrinnsvis i løpet av serietransplantasjon indikativt for eks langvarig tumorgenisitet. Videre er det heterogenitet innenfor CSC rommet, med en distinkt undergruppe cscs bærer den eksklusive evne til å gi opphav til metastaser som ikke bare er endirekte konsekvens av deres eksklusive in vivo tumorgenisitet. Faktisk metastastitic cscs få muligheten til å unndra den primære svulsten, overlever anoikis og til slutt translocate og frø sekundære områder. Disse avanserte funksjonsevne kan testes in vitro ved bruk av modifiserte invasjon analyser og in vivo ved hjelp av metastase analyser.
Målretting kreftstamceller
Vi og andre har gitt overbevisende bevis for at behandlinger med fokus på bulk svulst differensierte PDAC celler, også i kombinasjon med stromaceller målretting midler, ikke har en stor innvirkning på tumorprogresjon og påfølgende utfall med mindre kombinert med en CSC-målrettingsstrategien 21, 22. Således, basert på den avgjørende funksjoner av cscs i sykdomsprogresjon og motstand mot behandling, bør disse cellene betegne en essensiell komponent for en hvilken som helst ny behandling tilnærming 18,20, men vil kreve en mye mer grundig forståelse of regulatoriske maskineri av cscs. Selv cscs og deres mer differensierte progenies bære identiske genetiske grunntilstander med hensyn til genetiske endringer, cscs utviser tydelig og dermed epigenetiske bestemt genuttrykk profiler som deler moduler med pluripotente stamceller. De fleste av de gener som er involvert i å generere induserte pluripotente stamceller (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) har ikke bare vært knyttet til kreft, men deres uttrykk er stort sett begrenset til cscs rommet. Dessuten har den funksjonelle relevansen av cscs ved tap-av-funksjon eksperimenter ved hjelp av genetiske verktøy for målretting cscs nå godt etablert CSC konsept for flere krefttyper 23-25. Mens de fleste av disse metodene er basert på musemodeller og dermed ikke er lett overførbar til klinikken, gir de proof-of-concept for den potensielle kliniske relevansen av målretting cscs i kombinasjon med bulk tumorceller.
Studere kreftstamceller i Vitro å identifisere sine akilleshæl
For å identifisere nye og klinisk relevante metoder for målretting cscs, er deres egenskaper regelmessig undersøkt in vitro, og sfære dannelse er mye brukt i denne sammenheng. Opprinnelig utviklet for å studere normal stilk cellebiologi, inkludert selvfornyelse og differensiering kapasitet, ble dette assay senere tilpasset for å studere cscs in vitro, og har vært brukt for å undersøke cscs isolert fra PDAC 20. Vi har funnet ut at kreftkuler dannet fra primære humane PDAC celler bære alle de forskjellige funksjonene i cscs, derfor angir de inneholder bona fide bukspyttkjertelen cscs 21. Dermed representerer svulsten sfære analysen et kraftig verktøy for å skjerm for mer effektive behandlinger in vitro, men resultatene må vurderes nærmere i strengere in vivo. Faktisk, bør data generert med denne in vitro analysen behandles med stor forsiktighet som the assay kan bli utsatt for betydelige feil. Standardiserte protokoller, inkludert automatisert telling av dannet kuler, bør etableres for å sikre reproduserbare og prediktive data.
I denne sammenheng har vi nylig brukte denne analysen for å screene pancreatic cscs avledet fra et variert sett av primære humane PDACs og viste at disse cellene er svært sårbare for metabolsk omprogrammering av antidiabetisk forbindelse metformin. Tidligere metformin blitt demonstrert å hemme kreftcelle ekspansjon ved indirekte aktivering av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) signalering og påfølgende inhibisjon av mTOR 26, noe som resulterer i redusert proteinsyntese og 27 celleproliferasjon. I tillegg til disse effekter på tumordelen populasjonen, har vi og andre funnet at metformin er i stand til å målrette og faktisk eliminere cscs subpopulasjon i en rekke faste tumorer så som bryst, spiserørskreft, glioblastom og kreft i bukspyttkjertelen 28-31 </ Sup>. Dermed representerer metformin en lovende og trygg ny terapeutisk strategi for flere kreftformer med tiden udekket medisinsk behov. Videre bruker sfære formasjon som en måte å berike for cscs, vi viste at metformin primære effekt på bukspyttkjertel cscs var uavhengig av AMPK aktivering og stolte for det meste på sin beskjedne mitokondrietoksisitet (via hemming av komplekse I), som tilsynelatende var dødelig for den delen av cscs bare. For sistnevnte kunne vi vurdere sin cellulær oksygenforbruk og mitokondrielle ROS produksjon som indikatorer på stoffets giftighet på cellenivå. Deretter kan disse in vitro data valideres i prekliniske musemodeller og faktisk resulterte i signifikant forlenget overlevelse 31. Metodikken som presenteres her gir mulighet for rask generasjon av narkotika følsomhets profiler for cscs, inkludert studier på deres virkninger på CSC metabolisme. Vi tilbyr nå utvidet eksperimentelle detaljer om den benyttede comleggs in vitro og in vivo fremgangsmåter.
Protocol
Menneskelige PDAC svulster ble oppnådd med skriftlig informert samtykke (Comunidad de Madrid, Spania (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantasjon av menneskelige bukspyttkjertelen svulster i immunodeficient mus krever godkjenning av Institutional Review Board samt Institutional . Animal Care og bruk Committee (IACUC) Prosedyrene av xenograft pankreas tumor musemodeller må gjennomføres i samsvar med de institusjonelle og nasjonale bestemmelser (her Ethics Committee av Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spania; Protocol PA 34_2012).
1. Kultur Media
- Forbered Komplett Medium.
- Supplement RPMI medium med 10% FBS, 100 enheter / ml penicillin / streptomycin. Til 500 ml av RPMI legge 55 ml varmeinaktivert FBS og 6 ml penicillin / streptomycin (10 000 U / ml, 100X).
- Oppbevar fullstendig medium ved 4 ° C.
- Forbered cscs Medium.
- Supplere serum-free DMEM / F12 medium med 100 enheter / ml penicillin / streptomycin og 2 mM glutamin.
- Oppbevar CSC medium ved 4 ° C. B27 (01:50) og 20 ng / ml bFGF er ferskt tilsatt til mediet før hvert eksperiment.
MERK: Tilsetning av B27 har vist seg å øke tumor sfære dannelse og for å opprettholde flere passasjer for en kule 32 kulturer. Mediet sammensetningen er et viktig trinn, og må derfor kontrolleres for hver celletype i kultur. Vi anbefaler testing selvfornyelse og differensiering kapasitet på kuler og analysere uttrykk for CSC markører ved flowcytometri (dvs. CD133 + og CD44 +).
- Forbered Ekstracellulær Flux prøvemedium.
- Denne spesifikke mediet er basal DMEM 5030 som inneholder vitaminer, aminosyrer og andre kosttilskudd, men mangler glutamin, glukose, pyruvat og bikarbonat.
- For nåværende analysen supplere medium med 2 mM glutamin, 8 mM glukose og 2 mM natriumpyruvat til en full mitokondrie metabolsk aktivitet.
MERK: Fravær av natriumbikarbonat er nødvendig for å nøyaktig måle ekstracellulær surgjøring av celler som vokser i kultur, ettersom faste medium inneholdende bikarbonat-buffer pH vil variasjoner i løpet av analysen. I tillegg tillater bruken av en basal medium en streng kontroll av konsentrasjonen av L-glutamin (som L-alanyl-glutamin) glukose, eller natriumpyruvat nødvendig for forskjellige analysebetingelser og / eller programmer.
2. Sphere Forming analyse og analyse
MERK: Alle vevskulturstudier protokoller og manipulasjoner må utføres ved hjelp av sterile teknikker med stor oppmerksomhet med ren, vaskemiddel-fri, sterile glass. Før bruk, pre-varm hele medium og løsning i en 37 ° C vannbad (som et alternativ, kan du bruke medium og løsninger forvarmet ved RT). Skaff Menneskelig PDAC svulster som tidligere beskrevet 21.
- Isolering av cscs fra Menneskelig PDAC (figur1)
- I et sterilt biosikkerhet kabinett overføre PDAC humant vev til et 60 x 15 mm kulturskål inneholdende 1 ml sterilt 1X fosfatbufret saltvann (PBS). Hakk tumor i små biter (1-5 mm) under anvendelse av en steril skalpell og pinsetter.
- Legg 1 ml steril 1X PBS til kultur fatet og gjenta utgnidning trinnet til vevet er fullstendig dissosiert, regelmessig krever 3-4 runder. Overfør vevet suspensjonen (topp opp til et sluttvolum på 5 ml med 1 x PBS) inn i et sterilt rør og mekanisk homogenisere det med et dissociator som gentleMACS.
- Inkuber den homogeniserte vev med collagenase (bruke 2,5 mg / ml kollagenase i 1 x PBS) i 60 minutter ved 37 ° C og deretter sentrifuger i 5 minutter ved 900 x g. Dekanter supernatanten og resuspender cellepelletene i 10 ml fullstendig medium. Filtrer cellesuspensjonen gjennom et 40 um sil og sentrifuger i 5 minutter ved 900 x g.
- Dekanter supernatanten og resuspenderpellet med 5 ml av røde blodceller lyseringsbuffer (ammonium-klorid-kalium, ACK), og inkuber
- Resuspender pellet i cscs medium, plate på en gelatin-belagte fatet, og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Dette trinnet vil fjerne det meste av fibroblastceller som raskt festes til platen.
- Fjern platen fra inkubatoren og nøye gjenopprette cellesuspensjon og kvantifisere antallet levedyktige (trypanblått-negative) celler ved hjelp av et hemocytometer. For dette formål, forsiktig blande suspensjonen og pipettere 20 mL av suspensjonen inn i et Eppendorf-rør. Tilsett 20 ul (1: 1 forhold) av trypan blått til cellene i mikrosentrifugerør og bland godt. Pipetter ca. 10 pl av blandingen på hemocytometer.
- Telle alle klare celler i de fire hjørne kvadrantene av tellekammer for levedyktige celletall. Merk: levedyktighet og utbytte av celler kan variere betydelig mellom vevsprøver. For PDAC prøver levedyktighet regelmessig spenner between 45 til 70%, og vev stykker fra et makroskopisk tumorprøve med en diameter på 3 - 5 mm skulle gi etter ca. 6 5x10 levedyktige celler.
- Sphere Dannelse analysen og Metformin Treatment
- Ta det nødvendige antall celler og tilsett passende volum av cscs medium for å fremstille en cellekonsentrasjon på 2000 celler / ml. Ikke holde cellesuspensjonen på is, men ikke lenger enn 1t og blandes godt før plating.
- Legg 500 mL av 1X PBS til den første og siste raden av en 24-brønns plate for fukting for å minimere medium fordampning. Seed cellene i ultralave feste celler plater ved en tetthet på 2000 celler per brønn i 1 ml av tumor sfære medium (2000 celler / ml).
MERK: Antall celler som brukes for tumor sfære formasjons analyser kan variere mellom tumortyper. - Unn minst fire brønner med kjøretøy (negativ kontroll) og fire brønner med hver tildelt behandling, f.eks., 3 mm metformin. Pless cellene i en inkubator innstilt på 37 ° C og forsyne cellene med 5% CO2 i en uke.
MERK: Mediet bør ikke endres for å tillate uforstyrret dannelse av tumor kuler, men kan fylles opp med vekstfaktorer på en daglig basis som de ikke er stabile i kulturmedium. - Annenhver dag legge behandling, f.eks., 3 mM av metformin eller kjøretøy til hver av brønnene. Vurdere antall dannet tumor kuler etter 5 og / eller 7 dager ved bruk av en automatisert celleteller som gjør det mulig for telling av større strukturer (figur 2).
MERK: Bare kreft kuler med minst 40 mikrometer bør vurderes og kan kategoriseres som liten (40 - 80 mikrometer) eller stor (80-120 mikrometer), henholdsvis. Resultatene kan illustreres som prosentandelen av tumor kuler dividert med det opprinnelige antall celler sådd (for eksempel 2000 celler).
- Serieaging av First Generation Tumor Spheres
- Dissosiere pellet av tumor kulene til enkeltceller ved hjelp av trypsin, og deretter utvider det oppnådde enkeltcellelegemer suspensjon igjen i ytterligere 7 dager som beskrevet ovenfor (se 2.2).
3. Metabolism Analysis (ROS Produksjon og oksygenforbruk)
- ROS Produksjon
- I denne protokollen, har vi brukt karboksv-DCFDA som et eksempel for å måle ROS produksjon siden det er en rimelig, rask og mye brukt sonde for ROS deteksjon. Det er imidlertid flere andre sonder og metoder som kan anvendes for denne analysen.
- Behandle tumor kuler med metformin, som beskrevet i 2.2 for den tildelte tid. Ved slutten av behandlingen, høste tumor kuler ved hjelp av et 40 um celle sil, sentrifuger cellene ved 900 xg i 5 minutter og resuspender pelleten i 1 ml Trypsi. Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C.
- Når cellene er singularized, sentrifuger ved 900 xg og resuspender cellene i HBSS inneholdende 2,5 uM karboksy-DCFDA. Cellene inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C i mørket.
- Før flowcytometri analyse beskytte fargede celler fra lys som karboksv-DCFDA kan være foto-oksidert gi falske positive resultater. Plasser rørene på is inntil analyse.
MERK: karboksy-DCFDA er fluorescerende etter reaksjon med en rekke reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser, blir detektert i FL1 (ex 488nm, 520nm em..).
- Oksygenforbruk Measurement
- For denne protokollen, vil vi bruke Ekstracellulær Flux Analyzer system fra Seahorse biovitenskap, som et eksempel. Belegge det ønskede celledyrkingsplate med en løsning av 22,4 ug / ml av celle og vev klebemiddel i 20 minutter ved RT. Skyll brønnene med vann 2-3 ganger før såing cellene.
- På slutten av behandlingen, høste kreftkuler med en 40 mikrometer celle sil, sentrifuger cellene ved 900 xg i 5 minutter og resuspender pelleten i 1 ml trypsin. Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C.
- Plate singularized celler i cellekulturplate i en tetthet på 30.000 celler / brønn på en 96 brønners plate (sluttvolum: 150 mikroliter). Resuspender cellene i Oksygenforbruket analysemedium inneholdende 8 mM glukose og 2 mM natriumpyruvat.
- Sentrifuger cellene til bunnen av brønnen ved sentrifugesentrifugering av brønner, til 100 xg er nådd, og deretter la sentrifugen stopp med brems. Reversere retningen av platen og gjenta prosessen. Overfører platene til en 37 ° C inkubator uten tilsetning av CO 2 i 30 min.
- I mellomtiden forbereder patronen for analysen. Hver brønn har 4 forskjellige dyser å laste (25 mL / port):
- Port A: metformin. For å oppnå en sluttkonsentrasjon på 3 mM i brønnen, fremstille en 8x-løsning (24 mM) som det endelige volum blir 175ul etter injeksjon av port A.
- Port B: metformin. For å legge til 3 mm og oppnå en sluttkonsentrasjon på 6 mm i brønnen, fremstille en 9x løsning (27 mM) som det endelige volum blir 200 ul etter injeksjon av porten B.
- Port C: metformin. For å legge til 3 mm og oppnå en sluttkonsentrasjon på 9 mM i brønnen, fremstille en 10x løsning (30 mM) som det endelige volum blir 225 ul etter injeksjon av port C.
- Port D: 11 uM rotenon, for å oppnå 1 uM som sluttkonsentrasjon i brønnen (11x). Merk: rotenon helt hemmer eventuell rest mitokondrie aktivitet.
- Kalibrere kassetten og legg i cellekultur plate. Utføre analysen med standardprotokollen til blanding og måling.
- Beregn prosentvise inhibering av den totale mitokondriell respirasjon oppnås ved metformin som den prosentvise inhibering som oppnås med rotenon (angitt som 100%).
4.Xenotransplantat Modell for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen hos immunsupprimerte mus
MERK: Bestill tilstrekkelig antall kvinnelige atymiske nakne eller andre, mer immunsupprimerte musemodeller som NOD-SCID, SCID-Beige, eller NSG til eksperimentene 33. Autoklav alle kirurgiske instrumenter før eksperimentet og tillate dem å avkjøles til romtemperatur før bruk. For subkutane svulster brukte vi minst fire mus per tilstand med en svulst per flanke for totalt 8 svulster.
- Xenotransplantat Transplantasjon
- Forbered kreft stykker fra menneskebukspyttkjertelkreft vevsprøver. Overfør tumor i en petriskål og dissekere vev i små stykker (2 mm i diameter, ~ 8 mm 3) ved hjelp av en skalpell og pinsetter for å holde vevet. Dypp de oppnådde bitene inn geléaktig proteinblanding løsningen holdt på is.
- Anesthetize mus bruker 1 - 3% isofluorane eller andre inhalativ eller injiserbare bedøvelse.
MERK: Før du starter noen kirurgisk procedure, sørge for at musene har helt mistet bevisstheten ved å stimulere abdominal hud eller tauer med et par utbryter tang. Påfør øye salve for å hindre tørrhet. - Når bedøvelsen har virket, tørk baksiden av musene med etanol holdig huden antiseptisk. Administrere buprenorfin (0,05 mg / kg kroppsvekt) før kirurgi for å sikre postoperativ analgesi.
- Løfte av huden med pinsett, gjør en 0,7 til 1,0 cm langt snitt med steril mikro saks og deretter rett ut forberede en liten subkutan lomme, i hvilken en del av pasient-avledet kreft i bukspyttkjertelen vev settes inn (~ 8 mm 3).
- Lukke såret med 1 - 2 hud stifter. Fjerne dem etter 7 dager. Returnere musene til sine bur og holde dem på en varmepute eller under en varmelampe til de er fullt aktiv igjen.
- Etter tumorimplanteringen, overvåke musene minst to ganger ukentlig for tumorvekst og generelle tegn på oppstår morbiditet slik som rusket pels, hunched holdning, og immobilitet.
- Når tumorer har nådd en gjennomsnittlig størrelse på 200 mm 3, blir musene randomisert til de respektive behandlinger. Administrere kjøretøy eller metformin daglig via ip injeksjoner (150 mg / kg kroppsvekt) eller via drikkevann (150 mg / kg kroppsvekt) med sammenlignbare behandlingseffekter.
- Overvåke tumorbyrde ved hjelp av en caliper og beregne tumor volum gang i uken (måling av tumorvolumet = 1/2 lengde × pusten × bredde).
- Ofre mus når svulster har nådd 1 cm i diameter eller mus begynner å vise noen tegn til alvorlig smerte eller sykdom som angitt ovenfor.
Representative Results
Metformin Selektivt Targets bukspyttkjertelen cscs
Vi først undersøkte funksjonelle effekter av metformin behandling på in vitro selvfornyelse kapasitet på cscs. For dette formålet har vi gjennomført sfære formasjons analyser ved hjelp av primære humane kreft i bukspyttkjertelen celler isolert fra PDAC vev resected under operasjonen. Vi observerte at metformin sterkt reduserte størrelsen på dannede sfærer (figur 1A). Dette var mest sannsynlig ved å hemme ekspansjonen av etterkommere av CSC, som fortsatt representerer hoveddelen av celler som finnes i områder som de er bare anriket for cscs. Ja, de lengre kulene blir dyrket uten aging jo mer omfattende utbygging av mer differensierte progenies vil bli. Således har vi funnet metformin til å betydelig redusere antall sfærer faktisk dannet uavhengig av deres størrelse, som forekommer på en doseavhengig måte antyder sterk hemming av den selvfornyelse kapasiteten CSC'er (data ikke vist). Vi fant at metformin på 3 mM betydelig redusert antall kuler dannet (figur 1B). For å strengere studere de langsiktige virkningene av metformin på selvfornyelse kapasitet på cscs, senere passaged vi dannet primære kuler til sekundære og tertiære sfærer. Selv om bare foretrukne sfærer ble behandlet med metformin, ble dannelsen av kuler i den andre og tredje passasjer drastisk og i økende grad redusert, impliserer metformin behandling hadde faktisk irreversibelt fjernet mesteparten av cscs (figur 1C). Således våre data viste signifikant behandlingseffekt for metformin på selvfornyelse kapasitet av primære pancreatic cscs og dermed oppmuntret oss til å utføre ytterligere mekanisk så vel som in vivo studier.
Metformin Hemmer mitokondrie oksygenforbruk og induserer ROS Produksjon
Siden metformiN ble vist å virke som en gift av mitokondriell delvis inhibering kompleks I-aktivitet, vi neste undersøkte de akutte effekter av metformin på cellulær oksygenforbruk i sfære-avledede celler. For dette formål har vi valgt celler avledet fra to representative PDAC primære tumorer og målte oksygenforbruket over tid etter sekvensiell injeksjon av 3 mM metformin (tre injeksjoner) og 1 uM rotenon (en injeksjon). Som vist i figur 2A, metformin injeksjon induserte en hurtig og doseavhengig reduksjon i oksygenforbruk, som varierte betydelig mellom de forskjellige tumorer. Vi beregnet rest mitokondrielle aktivitet ved metformin behandling ved injeksjon av rotenon, et potent kompleks I-inhibitor, som er i stand til fullstendig å inhibere mitokondriell oksygenforbruk. Følsomhet overfor metformin i form av mitokondrieoksygenforbruk korrelert med sin evne til å indusere ROS produksjon definert som en forskyvning av gjennomsnittet for befolkning etter metformin behandling (figur 2B, venstre panel), som lett kan kvantifiseres (figur 2B, høyre panel). Som ventet, viste de primære cellene som var mest sensitive for hemning av oksygenforbruk også den sterkeste økning i ROS-produksjon ved behandling metformin. Dermed disse metabolske in vitro forsøk viser at metformin er rettet mot cscs ved å hemme deres avhengighet av mitokondriefunksjon, noe som resulterer i en påfølgende økning i mitokondrie ROS produksjon og til slutt induksjon av apoptose.
Metformin Stalls PDAC Progresjon I Vivo
Vi endelig studert effekten av metformin in vivo ved hjelp vev xenografts avledet fra forskjellige pasienter med PDAC. Vi observerte en tydelig reduksjon i tumorprogresjon for metformin-behandlede mus sammenlignet med kontrollgruppen, men tumorene aldri helt disappeared (figur 3). Senere, under langsiktige oppfølgings alle svulster slutt tilbakefall tyder metformin motstand av celler som overlever den tidlige fasen av behandlingen. Likevel metformin behandling, selv når den brukes som monoterapi, betydelig utvidet overlevelse i alle mus.
Figur 1. Metformin selektivt rettet mot de cscs. (A) Metformin redusert størrelsen på kulene. Representative bilder av kuler som ble oppnådd etter behandlingen med de angitte doser av metformin i 7 dager (høyre panel). Kvantifisering av sfære størrelse (n≥6) (venstre panel), de angitte tallene i abscissene aksen representerer individuelle tumor. (B) Sphere dannelse kapasitet i nærvær eller fravær av metformin i 7 dager (n≥6), de angitte tall i abscisseneaksen representerer individuelle tumor. (C) Representant graf av CSC selvfornyelse kapasitet i sekundære og tertiære sfærer av primære kreft i bukspyttkjertelen celler. Kulene ble kun behandlet i løpet av første generasjon sfære formasjon for totalt 7 dager (n = 6). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Metformin Behandling hemmer oksygenforbruk og induserer ROS Production. (A) Metformin tillegg hemmer oksygenforbruk (OCR) av sfære-deriverte celler. To forskjellige PDAC sekundære kuler ble behandlet med metformin og OCR endringer ble målt ved ekstracellulære flux analyse. Rotenon injeksjon ble brukt som en kontroll for total mitokondriell OCR forbruket.X-aksen representerer den oksygenforbrukshastighet i pmol av oksygen / time normalisert med proteininnholdet i hver brønn. (B) PDAC kuler brukes i A ble behandlet i 8 timer med metformin og ROS produksjonen ble vurdert ved flowcytometri hjelp karboksv-DCFDA. Venstre, representative flowcytometri plott. Høyre, sammendrag av data fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Metformin Stalls PDAC progresjon i Vivo. To forskjellige PDAC xenograft vev ble implantert i immunkompromitterte mus og behandling ble tildelt etter første tumor take ble bekreftet. Mus ble behandlet med metformin (Met) tilsettes til drikkevann (150 mg / kg kropps weight; basert på 5 ml av vannforbruket per dag). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Med fremveksten og påfølgende validering av CSC konsept for mange svulster, har feltet narkotika utvikling fått ny giv, med potensial for å utvikle mer effektive kreft behandlinger og deretter redusere risiko for sykdom tilbakefall. Imidlertid er CSC-feltet fortsatt i en tidlig stat og mer må gjøres i form av forståelse CSC opprinnelse og utbredelse, og deres rolle i utformingen av svulsten arkitektur og fremme metastaser.
I denne sammenheng er bruken av reproduserbare og meningsfylte CSC assays samt informert tolkningen av oppnådde data er en viktig komponent for å fremme forståelsen av CSC biologi. Fra mange biologiske perspektiver, har sfære formasjon dukket opp som en svært verdifull analyse; likevel brukere bør være klar over sine begrensninger for å tolke sine eksperimentelle resultater. Et viktig aspekt å vurdere selv før evaluering av sfæren formasjon data er opprinnelsen til den undersøkte prøven, siden resultatene som oppnås fra ferske pasientavledet prøver kan bli betydelig forskjellig fra de som oppnås fra etablerte kreftcellelinjer.
Klassiske sfære formasjons analyser involverer såing celler ved klonal tetthet i ultralav-festeplater og evaluering av kuledannelse i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og / eller basisk fibroblast vekstfaktor (b-FGF) anriket, men serumfritt medium 21, 34. Dyrkingsmediumet sammensetning er også en viktig sak å vurdere. Etter vår erfaring har vi funnet at DMEM / F12 supplert med B27, bFGF og glutamin i fravær av serum var en optimal medium til å vokse, utvide og opprettholde CSC i udifferensierte forhold. Vi fant ut at i denne kulturen tilstand (medium og suspensjon) cellene uttrykker store mengder kreftstamcellemarkører (inkludert CD133 +, CD44 + og CD24 +) og uttrykker ikke differensieringsassosierte proteiner (CK-20 Og CK-19).
En av de grunnleggende forutsetningene for disse analysene er at hver sfære er klonal, dvs. resulterer en sfære fra utvidelsen av en enkelt stamcelle. Men kulene er egentlig dynamiske strukturer som er tilbøyelige til å smelte selv ved lav seeding tetthet 35. Plating celler er et kritisk trinn i protokollen og tettheten av en celle / brønn kan sikkert omgå problemet aggregering. Men selv for prospektivt sortert stamfedre, dette regelmessig resulterer i svært lav sfære dannelse på grunn av lav indre sfære dannelse aktivitet og kan også tilskrives begrenset autocrine stimulering på grunn av utvanningseffekter. Etter vår erfaring er observert at bare 30% av cellene sådd er i stand til å danne kuler. Vi anbefaler å bruke minst 100 celler / brønn for å oppnå konsistente og reproduserbare resultater.
Andre metoder for vekst dyrknings CSC er basert på fast eller halvfast 3D kulturer (f.eks, basert på matrigel, kollagen eller metylcellulose). Disse metoder er blitt brukt for å begrense cellemobilitet og påfølgende celle 36 aggregering. Imidlertid bærer hver av disse matriser sine egne begrensninger. For eksempel, er en oppløselig matrigel basalmembran isolert fra Engelbreth-Holm-Swan (HMS) tumor, og selv om ekstraktet ligner den komplekse ekstracellulære tumor miljø som finnes i mange vev, kan det inneholde flere mer eller mindre definerte vekstfaktorer som ofte gjengir mekanistisk studier for spesifikke regulatoriske elementer meget vanskelig. En annen vurdering er at sfære dannende kapasitet og stamcelle funksjoner er ikke utskiftbare termer 34. Mens visse stamceller og forløperceller har vist seg å oppvise sfære-dannende evne 37, manglende evne til å generere sfærene in vitro utelukker ikke in vivo stammen / progenitor funksjon. For eksempel kan stille stamceller rett og slett ikke svare på de ekstracellulære signaler gitt avselektert in vitro dyrkningsbetingelser. Dermed langsiktig in vitro og in vivo selvfornyelse kapasitet på rensede cellepopulasjoner, fortrinnsvis i løpet av serieaging, bør vurderes for å bevise eller motbevise stamcellefunksjon. I denne sammenheng, er evnen til å prospektivt og samtidig forplante forskjellige populasjoner av stamceller og forløperceller et viktig aspekt av sfæren dannende analyse og gjør denne analysen svært verdifull for CSC felt; så lenge dens begrensninger holdes i tankene for tolkningen av de oppnådde data.
Sphere dannende analyser har blitt mye brukt til å retrospektivt identifisere stamceller basert på deres evne til selvfornyelse og differensiering på celle-nivå in vitro. Oppdagelsen av markører som tillater den potensielle isolering av stamceller og deres avkom fra deres in vivo nisje kan de funksjonelle egenskapene til rensede populasjoner som skal defineres. Combination av sfære formasjon analysen og FACS er en vellykket strategi for å isolere celler fra solid vev eller berike spesifikke subpopulasjoner av PDAC i kultur. For eksempel, samtidig ekspresjon av EpCAM, CD24 og CD44 definerer en subpopulasjon av cscs kunne: selvfornyelse, differensiere og initiere en tumor, som reflekterer heterogeniteten av den opprinnelige tumor. Hermann et al. viste at CD133 + celler besatt augmented proliferativ kapasitet og CSC har 15. Andre markører har også vært anvendt for karakterisering av cscs: ALDH- 1 (aldehyd dehydrogenase-1) ekspresjon er assosiert med høyt tumorigene celler i bukspyttkjertelen 38; cellene i stand til å utelukke DNA dye Hoechst 33342, oppkalt side befolkningen (SP) celler, har bevist kapasitet til å initiere svulster 39. Nylig viste vi at en subcellulære autofluorescence rommet karakteriserer en distinkt populasjon av humane celler med eksklusive CSC trekk på tvers av ulike krefttyper40. Selv om ingen av disse markørene virker til selektivt å karakterisere en ren populasjon av cscs, mer og mer komplekse kombinasjoner av markører må brukes for å rense FACS mer raffinerte populasjoner av celler.
Mange spørsmål gjenstår om den nøyaktige rollen cscs i opprinnelse, progresjon, og stoffet motstand av svulster. For eksempel, en måte å løse spørsmålet om klonal evolusjon definere om og hvordan en enkelt CSC initierer en svulst, kan være å analysere pasientprøver ved forskjellige stadier av sykdommen, og spesielt å følge antallet cscs under og etter behandling. Ved å svare på disse spørsmålene, kan vi gjøre menings fremdriften av vår kunnskap om cscs i solide svulster og utvikle medisinsk behandling til slutt hindre tumorprogresjon og tilbakefall.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesse å avsløre.
Acknowledgments
Den nåværende forskningen ble støttet av en ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233 460), Det europeiske fellesskap syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) under tilskuddsavtalen No 256974 (EPC-TM-NET) og No 602783 (CAM-PAC ), den Subdirección General de Evaluación y Fomento de la INVESTIGACION, Fondo de INVESTIGACION Sanitaria (PS09 / 02129 og PI12 / 02643), og Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de economía y Competitividad, Spania). E. Lonardo ble støttet av Roche Fellowship. M. Cioffi ble støttet av La Caixa Predoctoral Fellowship Programme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
| GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
| 24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
| 100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 15-ml polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50-ml polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
| 26 G needles | BD Falcon | 300600 | |
| 100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
| Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
| RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
| Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
| Metformin | Sigma | D150959-5G | |
| L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| 100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
| Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
| BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
| Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
| B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
| Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
| Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
| Rotenone | Sigma | R8875 | |
| Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
| Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
| Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
| XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
| Incubator with CO2 input | |||
| Micro scissors | |||
| Curved forceps | |||
| Splinter forceps | |||
| Caliper |
References
- Whipple, C. A., Young, A. L., Korc, M. A KrasG12D-driven genetic mouse model of pancreatic cancer requires glypican-1 for efficient proliferation and angiogenesis. Oncogene. 31 (20), 2535-2544 (2012).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Burris, H. A. 3rd, et al. Improvements in survival and clinical benefit with gemcitabine as first-line therapy for patients with advanced pancreas cancer: a randomized trial. J Clin Oncol. 15 (6), 2403-2413 (1997).
- Moore, M. J., et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. J Clin Oncol. 25 (15), 1960-1966 (2007).
- Cunningham, D., et al. Phase III randomized comparison of gemcitabine versus gemcitabine plus capecitabine in patients with advanced pancreatic cancer. J Clin Oncol. 27 (33), 5513-5518 (2009).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. N Engl J Med. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. N Engl J Med. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Gourgou-Bourgade, S., et al. Impact of FOLFIRINOX compared with gemcitabine on quality of life in patients with metastatic pancreatic cancer: results from the PRODIGE 4/ACCORD 11 randomized trial. J Clin Oncol. 31 (1), 23-29 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Garcia-Silva, S., Frias-Aldeguer, J., Heeschen, C. Stem cells & pancreatic cancer. Pancreatology. 13 (2), 110-113 (2013).
- Hermann, P. C., Mueller, M. T., Heeschen, C. Pancreatic cancer stem cells--insights and perspectives. Expert Opin Biol Ther. 9 (10), 1271-1278 (2009).
- Hermann, P. C., Huber, S. L., Heeschen, C. Metastatic cancer stem cells: a new target for anti-cancer therapy. Cell Cycle. 7 (2), 188-193 (2008).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Gallmeier, E., et al. Inhibition of ataxia telangiectasia- and Rad3-related function abrogates the in vitro and in vivo tumorigenicity of human colon cancer cells through depletion of the CD133(+) tumor-initiating cell fraction. Stem Cells. 29 (3), 418-429 (2011).
- Hermann, P. C., Bhaskar, S., Cioffi, M., Heeschen, C. Cancer stem cells in solid tumors. Semin Cancer Biol. 20 (2), 77-84 (2010).
- Mueller, M. T., et al. Combined targeted treatment to eliminate tumorigenic cancer stem cells in human pancreatic cancer. Gastroenterology. 137 (3), 1102-1113 (2009).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives self-renewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Li, C., et al. c-Met is a marker of pancreatic cancer stem cells and therapeutic target. Gastroenterology. 141 (6), 2218-2227 (2011).
- Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Shaw, R. J., et al. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in liver and therapeutic effects of metformin. Science. 310 (5754), 1642-1646 (2005).
- Martin-Castillo, B., Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J. A. Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena. Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).
- Honjo, S., et al. Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer. Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).
- Wurth, R., et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt. Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).
- Cufi, S., et al. Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts. Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).
- Lonardo, E., et al. Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells. PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).
- Gu, Y., et al. The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres. J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).
- Ishizawa, K., et al. Tumor-initiating cells are rare in many human tumors. Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).
- Seaberg, R. M., van der Kooy, D. Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors. J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Miranda-Lorenzo, I., et al. Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells. Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).
