Langsigtet kulturperler interferon-γ enzymbundet immunospot assay anvendes som et mål for centrale hukommelse svarene og korrelerer med beskyttende anti-mycobakterielle vaccine reaktioner. Med dette assay er perifere mononukleære blodceller stimuleret med mycobakterielle antigener og interleukin-2 i 14 dage, muliggør differentiering og udvidelse af centrale hukommelse T-celler.
Effektor og memory T-celler genereres gennem udviklingsmæssige programmering af naive celler efter antigen anerkendelse. Hvis infektionen styres op til 95% af T-cellerne genereres under ekspansionsfasen elimineres (dvs.., Sammentrækning fase) og hukommelses-T-celler forbliver, undertiden for en levetid. Hos mennesker har to funktionelt forskellige undergrupper af memory-T-celler blevet beskrevet baseret på ekspressionen af lymfeknude homing receptorer. Central memory T-celler udtrykker CC kemokinreceptor 7 og CD45RO og er primært placeret i T-celle områder af sekundære lymfoide organer. Effektor memory T-celler udtrykker CD45RO, mangler CCR7 og vise receptorer associeret med lymfocytmålsøgning til perifere eller betændt væv. Effektor-T-celler udtrykker ikke hverken CCR7 eller CD45RO men ved møde med antigen producere effektor cytokiner, såsom interferon-γ. Interferon-γ frigivelse assays anvendes til diagnose af bovin og human tuberkulose ogdetektere primært effektor og effektor memory T-celle responser. Centrale hukommelse T-cellereaktioner ved CD4 + -T-celler til vaccination, på den anden side kan anvendes til at forudsige vaccineeffektivitet, som demonstreret med abeimmundefektvirus infektion af ikke-menneskelige primater, tuberkulose hos mus, og malaria hos mennesker. Adskillige studier med mus og mennesker samt upublicerede data om kvæg, har vist, at interferon-γ ELISPOT-analyser måler centrale hukommelse T-celle responser. Med dette assay, perifere mononukleære celler dyrkes i faldende koncentration af antigen til 10 til 14 dage (langvarig kultur), så effektor responser til at toppe og aftage; lette centrale hukommelse T-celler til at differentiere og udvide inden for kulturen.
Effektor og hukommelses-T-celler genereres gennem udviklingsmæssige programmering af naive CD4 + -T-celler efter antigengenkendelse. Differentiering af naive CD4 + T-celler i cytokin celler kræver patogen genkendelse af medfødte immunceller, antigen præsentation til T-celler, co-stimulering og transkriptionelle ændringer resulterer i polariseret cytokinproduktion. For eksempel: antigenpræsenterende celler producerer interleukin (IL) -12 som reaktion på intracellulære patogener, som sammen med antigengenkendelse, fremmer differentiering af T-celler i T-hjælper 1 (Th1) -celler 1,2 ved signalering via signal transducer og aktivator af transkription 4 (STAT4) og T-box udtrykt i T-celler (T-bet), hvilket fører til celleaktivering, IL-2-produktion, klonal ekspansion og interferon (IFN) -γ produktion 3,4. Hvis infektionen er under kontrol, er op til 95% af T-cellerne genereres under ekspansionsfasen elimineres (dvs. sammentrækningfase) og hukommelse T-celler tilbage, nogle gange i en menneskealder 5. Sallusto et al. 6, afslørede to funktionelt forskellige undergrupper af hukommelse T-celler i mennesker baseret på ekspressionen af lymfeknude homing receptorer. Centrale memory T-celler (TCM) udtrykker CC kemokinreceptor (CCR) -7 og CD45RO og er primært placeret i T-celle områder af sekundære lymfoide organer. TCM har begrænset effektorfunktion, en lav tærskel aktivering og bevare høj IL-2-produktion og proliferativ kapacitet. Effektor memory T-celler (TEM) udtrykker CD45RO mangler CCR7 og vise receptorer for målsøgende til perifere eller betændte væv. Effektorceller udtrykker ikke hverken CCR7 eller CD45RO men straks producere effektor cytokiner, såsom IFN-γ, ved antigengenkendelse.
IFN-γ release assays (igra) anvendes til diagnosticering af bovin og human tuberkulose 7. Mycobacterium bovis er den vigtigste agent for kvægtuberkulose (BTB), mens den menneskelige cases af tuberkulose er hovedsageligt forårsaget af Mycobacterium tuberculosis. Med disse tests, fuldblod eller perifere mononukleære celler (PBMC) stimuleres med mycobakterielle antigener i 16 til 24 timer og IFN-γ produktion i supernatanten måles ved ELISA eller ved detektion af celler, der producerer IFN-γ hjælp ELISPOT teknikker. Som følge af den korte stimulationstidsrum (dvs.., 16 til 24 timer) og hurtig cytokinproduktion, ex vivo assays detektere primært effektor og Tem responser. Dette er blevet bekræftet ved flowcytometrisk analyse af cellepopulationer i disse kulturer 8-10.
Ex vivo IFN-γ responser rutinemæssigt indbefattet inden for immunrespons panel evaluering af tuberkulose vacciner, herunder dem, der anvendes til at evaluere responser fra kvæg. Mest effektive bovine tuberkulosevacciner fremkalde specifikke IFN-γ-responser, men ikke alle vacciner, som inducerer IFN-γ reaktioner er PROTECTIVEe. Også niveauer af IFN-γ fremkaldt ved vaccination, som målt før infektion, ikke nødvendigvis korrelerer med beskyttelse. For eksempel kan forskellige BCG-stammer har forskellige kapaciteter til at inducere ex vivo IFN-γ respons på trods af lignende niveauer beskyttelse 11. Således ex vivo IGRAs er værdifulde for tuberkulose diagnose og for adgang vaccine immunogenicitet; men deres anvendelse som prædiktorer for vaccineeffektivitet er begrænset. TCM reaktioner på vaccination, på den anden side kan anvendes til at forudsige vaccineeffektivitet, som demonstreret med simian immundefektvirus (SIV) infektion hos ikke-menneskelige primater 12,13, tuberkulose hos mus 14 og malaria hos mennesker 15,16.
Efter en reaktion resulterer i patogen clearance effektivt immunrespons, er Tcm vedligeholdt og yde beskyttelse til en eventuel anden infektion med det samme middel. En bemærkelsesværdig undtagelse til dette scenarie er M. tuberkulose infektion af mennesker, hvor patienter, der modtager helbredende anti-mycobakteriel terapi er modtagelige for reinfektion 17,18. Derudover events for immunologisk hukommelse under kroniske infektioner, hvor den antigen stimulering fortsætter, er ikke godt forstået 19. Under kroniske infektioner, såsom med human immundefekt virus (HIV) og tuberkulose, er en betydelig Tcm respons i forbindelse med et positivt resultat (f.eks latenstid med tuberkulose og subklinisk sygdom med HIV) 20,21. Adskillige studier med mus og mennesker har vist, at langsigtede dyrkede IFN-γ ELISPOT-analyser måler Tcm reaktioner 16,20-22. Med dette assay PBMC'er dyrkes i faldende koncentration af antigen til 10 til 14 dage, hvilket tillader effektor responser til at toppe og aftage; lette Tcm at differentiere og udvide inden for kulturen.
Langtids-dyrkede IFN-γ ELISPOT-analyser er også blevet anvendt i veterinær-forskning, men fænotypen af responderende celler har været vanskelig at vurdere på grund af mangel af kritiske reagenser, især et antistof mod CCR7. Effektive bovine tuberkulosevacciner [f.eks. ved anvendelse af en enkelt dosis af M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG efterfulgt af viral-vectored antigen 85A underenhedsvaccine, eller svækket M. bovis ΔRD1] fremkalde langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser efter vaccination, der korrelerer med beskyttelse (dvs. lavere mycobakteriel byrde og nedsat TB-associeret patologi) mod efterfølgende udfordring med virulent M. bovis 23,24. Endvidere er antallet af antigen-specifikke IFN-γ-udskillende celler i langsigtede PBMC kulturer er højere ved 12 måneder, men falde på 24 måneder efter BCG vaccination af neonatale kalve, korrelerer med graden af beskyttelse detekterbar indlæg M. bovis udfordring 25. I dette scenario den dyrkede IFN-γ ELISPOT er enn vigtigt redskab til at forudsige vaccine effektivitet, der giver et middel til at prioritere vaccine kandidater til høje omkostninger effektivitetsundersøgelserne. Derudover kan dyrkede ELISPOT teknikker tilpasses til forskellige værter, patogener og cytokiner ved at ændre antigener eller antistoffer til en række forskellige formål i forskellige forskningsområder.
IFN-γ-produktion i langtids-dyrkede ELISPOT-analyser er generelt skyldes Tcm hos mennesker, men hvor denne reaktion udvikler sig i kulturen er dårligt forstået. Hvorvidt Tcm er til stede i cirkulation og ekspandere in vitro, eller hvis TCM reaktioner skyldes differentiering af effektor og Tem celler i Tcm under dyrkning er ikke kendt. Imidlertid har undersøgelser med prøver fra mennesker fundet, at CD4 + T-celler fra ex vivo og langsigtede dyrket IFN-γ ELISPOT-analyser har ubeslægtede epitopspecificiteter, hvilket indebærer, at Tcm svarene ikke udvikle sig fra effektorceller 28. Naturligvis kan varigheden af respons varierer, men hvis patogen clearance opnås, vinder både ex vivo og Tcm responser falde. Også, reaktioner af langvarige kulturer målt tidligt og længe efter antigen priming (når effektor respons er lavere) er vist at korrelere, hvilket indikerer, at cirkulerende Tcm populationer tidligt og længe efter antigen-priming forbliver relateret in vivo. På den anden side, er størrelsen af den ex vivo respons ikke at være relateret til størrelsen af hukommelsen respons 29. Disse resultater antyder, at langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser resulterer fra in vitro-ekspansion af TCM og en tilhørende aftagende effektor responser i prøven, snarere end differentieringen af effektorceller i Tcm fænotype.
Med kvæg, er det relative bidrag effektor og memory delmængder til svar opdaget af de langsigtede IFN-γ ELISPOT-analyser ikke kendt. Nylige undersøgelser tyder på en korrelation mellem vaccine udløste langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser og beskyttelse mod efterfølgende eksperimentel infektion med M. bovis 23-24. Det er blevet rapporteret, at svage langsigtede IFN-γ-ELISpot reaktioner på vaccination er forbundet med den manglende beskyttelse 30. Både live og dræbeed vacciner inducerer lignende ex vivo IFN-γ-ELISpot-responser, men vaccination med levende BCG fremkalder stærkere langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser end lave dræbt vaccinepræparater. Interessant, levende vacciner er beskyttende, mens dræbte formuleringer undlader at yde beskyttelse mod udfordring med virulent tuberkuløse mykobakterier 31-32, 33.
Vurdering TCM reaktioner er også muligt ved at sortere disse celler fra PBMC. Direkte berigelse af Tcm fra PBMC, kræver imidlertid dyrt udstyr, højtuddannede personlig og er vanskelig, da disse celler ikke er talrige i blodet. Langsigtet kultur af PBMC giver berigelse af Tcm løbet Tem og effektor celler uden dyre udstyr; men fordi disse T-celle-populationer er ekspanderes in vitro kan de være mindre repræsentative for in vivo memory-responser. Det er muligt at få adgang IFN-γ memory-responser (ved hjælp af langvarig kultur eller Tcm slagsing strategier) af andre end ELISPOT assays, såsom: cytokin ELISA 34, cytokin perle arrays (CBA), intracellulær farvning (ICS), eller cytokin proteinarrays (CPA). Disse metoder; imidlertid er generelt mindre følsomme end ELISPOT-analyser 35.
En fordel ved ELISPOT er dens evne til at detektere den øjeblikkelige indfangning af cytokinet kort efter dets frigivelse forhindrer fortynding i supernatanten og nedbrydning ved enzymatisk spaltning eller cytokin optagelse af andre celler. ELISPOT-analyser opdage enkelte celler, der producerer cytokiner der giver præcise resultater, selv i lavt signal til støj scenarier (dvs. lave specifikke svar) 35. Også med ICS, kan påvisning af cytokiner inden de ledes medføre falsk identifikation af celler, der producerer cytokiner (f.eks. På grund af posttranslationel modulering før eller under den sekretoriske proces) 34. Transport hæmmere ansat med ICS analyser at minimere cytokinsekretionunder antigenstimulering (kendt som Golgi stop-proteiner) begrænse varigheden af cellestimulering grund af celletoksicitet af disse proteiner i sidste ende påvirker cytokinproduktion 35.
Med det sagt – CBA, CPA og ICS er nyttige teknikker til måling af multiple cytokiner samtidigt og / eller til bestemmelse celleoverflademarkør ekspression (dvs. med ICS.). Derfor kan disse metoder anvendes i kombination med IFN-γ ELISPOT-analyse 36. Mens tidligere bovine TB vaccine virkningsundersøgelser målt Tcm svar via ELISPOT assay, vil påvisningen TCM reaktioner fra andre teknikker sandsynligvis giver sammenlignelige resultater. Vigtigere er det, ELISPOT assay er billigere og enklere at udføre end CBA, CPA og ICS analyseteknikker 34. Manuel tælling af SFC er et alternativ til automatiseret optælling og ELISPOT plader kan opbevares ved stuetemperatur i længere tid med minimal tab af kvalitet, før eller efter spot counting 37.
Den langsigtede kulturperler IFN-γ ELISPOT respons er blevet anvendt til at vurdere hukommelse reaktioner af mennesker, og kvæg, når de evaluerer tuberkulose vaccine reaktioner 14-16,31-32,33. TCM svar er også antages at spille en betydelig rolle i værtens respons til flere andre smitstoffer af kvæg, såsom:. Mycoplasma mycoider subsp mycoides 42, Anaplasma Marginale 38 og bovint respiratorisk syncytialvirus 39. Potentielt kan den langsigtede ELISPOT-analyse tilpasses til andre dyrearter, cytokiner og infektioner. Disse bredere applikationer vil især være nyttigt for veterinære immunologi applikationer på grund af nuværende begrænsede tilgængelighed af specifikke reagenser.
TCM svar er afgørende for beskyttelse mod flere infektioner, men måle dem tidligt efter infektion / immunisering (for resultatet sygdom forudsigelse eller vaccine effekt) may være besværligt. Analyse af immunresponset under ex vivo og korte antigene stimuleringsbetingelser vil oftere repræsenterer effektor responser, på grund af overlapningen af hukommelses- og effektor reaktioner, især i begyndelsen af immunologisk hukommelse formation. I forbindelse med kroniske sygdomme, hvor antigenet belastning er konstant, vil ex vivo responser vurdere effektor cellereaktioner eller en kombination af hukommelses- og effektor celleresponser. Den langsigtede dyrket IFN-γ ELISPOT assay beskrevet her, sandsynligvis muliggør måling TCM responser snarere end effektor T-celle eller kombinerede CD4 + T-cellereaktioner. Sammenfattende langsigtede dyrket IFN-γ ELISPOT assay tilvejebringer en værdifuld fremgangsmåde til estimering T-celle memory-responser og har været anvendt med succes til at evaluere hukommelse responser af flere arter til en række infektioner agenter 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen blev støttet af USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 og Landbrug og Fødevarer Research Initiative Konkurrencedygtige Grant nej. 2011-67015-30736 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi takker Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, og Tracy Porter for deres fremragende tekniske bistand samt Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers Robin Zeisness, og David Panthen for den fremragende pleje og håndtering af dyr.
Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
Citric acid (monohydrate) | Various | ||
Dextrose | Various | ||
ELISPOT PVDF plate | Various | ||
Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |