Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Anvendelse af Langsigtet kulturperler Interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay til Vurdering Effektorceller og Memory T celle responser i Cattle

doi: 10.3791/52833 Published: July 11, 2015

Summary

Langsigtet kulturperler interferon-γ enzymbundet immunospot assay anvendes som et mål for centrale hukommelse svarene og korrelerer med beskyttende anti-mycobakterielle vaccine reaktioner. Med dette assay er perifere mononukleære blodceller stimuleret med mycobakterielle antigener og interleukin-2 i 14 dage, muliggør differentiering og udvidelse af centrale hukommelse T-celler.

Abstract

Effektor og memory T-celler genereres gennem udviklingsmæssige programmering af naive celler efter antigen anerkendelse. Hvis infektionen styres op til 95% af T-cellerne genereres under ekspansionsfasen elimineres (dvs.., Sammentrækning fase) og hukommelses-T-celler forbliver, undertiden for en levetid. Hos mennesker har to funktionelt forskellige undergrupper af memory-T-celler blevet beskrevet baseret på ekspressionen af ​​lymfeknude homing receptorer. Central memory T-celler udtrykker CC kemokinreceptor 7 og CD45RO og er primært placeret i T-celle områder af sekundære lymfoide organer. Effektor memory T-celler udtrykker CD45RO, mangler CCR7 og vise receptorer associeret med lymfocytmålsøgning til perifere eller betændt væv. Effektor-T-celler udtrykker ikke hverken CCR7 eller CD45RO men ved møde med antigen producere effektor cytokiner, såsom interferon-γ. Interferon-γ frigivelse assays anvendes til diagnose af bovin og human tuberkulose ogdetektere primært effektor og effektor memory T-celle responser. Centrale hukommelse T-cellereaktioner ved CD4 + -T-celler til vaccination, på den anden side kan anvendes til at forudsige vaccineeffektivitet, som demonstreret med abeimmundefektvirus infektion af ikke-menneskelige primater, tuberkulose hos mus, og malaria hos mennesker. Adskillige studier med mus og mennesker samt upublicerede data om kvæg, har vist, at interferon-γ ELISPOT-analyser måler centrale hukommelse T-celle responser. Med dette assay, perifere mononukleære celler dyrkes i faldende koncentration af antigen til 10 til 14 dage (langvarig kultur), så effektor responser til at toppe og aftage; lette centrale hukommelse T-celler til at differentiere og udvide inden for kulturen.

Introduction

Effektor og hukommelses-T-celler genereres gennem udviklingsmæssige programmering af naive CD4 + -T-celler efter antigengenkendelse. Differentiering af naive CD4 + T-celler i cytokin celler kræver patogen genkendelse af medfødte immunceller, antigen præsentation til T-celler, co-stimulering og transkriptionelle ændringer resulterer i polariseret cytokinproduktion. For eksempel: antigenpræsenterende celler producerer interleukin (IL) -12 som reaktion på intracellulære patogener, som sammen med antigengenkendelse, fremmer differentiering af T-celler i T-hjælper 1 (Th1) -celler 1,2 ved signalering via signal transducer og aktivator af transkription 4 (STAT4) og T-box udtrykt i T-celler (T-bet), hvilket fører til celleaktivering, IL-2-produktion, klonal ekspansion og interferon (IFN) -γ produktion 3,4. Hvis infektionen er under kontrol, er op til 95% af T-cellerne genereres under ekspansionsfasen elimineres (dvs. sammentrækningfase) og hukommelse T-celler tilbage, nogle gange i en menneskealder 5. Sallusto et al. 6, afslørede to funktionelt forskellige undergrupper af hukommelse T-celler i mennesker baseret på ekspressionen af lymfeknude homing receptorer. Centrale memory T-celler (TCM) udtrykker CC kemokinreceptor (CCR) -7 og CD45RO og er primært placeret i T-celle områder af sekundære lymfoide organer. TCM har begrænset effektorfunktion, en lav tærskel aktivering og bevare høj IL-2-produktion og proliferativ kapacitet. Effektor memory T-celler (TEM) udtrykker CD45RO mangler CCR7 og vise receptorer for målsøgende til perifere eller betændte væv. Effektorceller udtrykker ikke hverken CCR7 eller CD45RO men straks producere effektor cytokiner, såsom IFN-γ, ved antigengenkendelse.

IFN-γ release assays (igra) anvendes til diagnosticering af bovin og human tuberkulose 7. Mycobacterium bovis er den vigtigste agent for kvægtuberkulose (BTB), mens den menneskelige cases af tuberkulose er hovedsageligt forårsaget af Mycobacterium tuberculosis. Med disse tests, fuldblod eller perifere mononukleære celler (PBMC) stimuleres med mycobakterielle antigener i 16 til 24 timer og IFN-γ produktion i supernatanten måles ved ELISA eller ved detektion af celler, der producerer IFN-γ hjælp ELISPOT teknikker. Som følge af den korte stimulationstidsrum (dvs.., 16 til 24 timer) og hurtig cytokinproduktion, ex vivo assays detektere primært effektor og Tem responser. Dette er blevet bekræftet ved flowcytometrisk analyse af cellepopulationer i disse kulturer 8-10.

Ex vivo IFN-γ responser rutinemæssigt indbefattet inden for immunrespons panel evaluering af tuberkulose vacciner, herunder dem, der anvendes til at evaluere responser fra kvæg. Mest effektive bovine tuberkulosevacciner fremkalde specifikke IFN-γ-responser, men ikke alle vacciner, som inducerer IFN-γ reaktioner er PROTECTIVEe. Også niveauer af IFN-γ fremkaldt ved vaccination, som målt før infektion, ikke nødvendigvis korrelerer med beskyttelse. For eksempel kan forskellige BCG-stammer har forskellige kapaciteter til at inducere ex vivo IFN-γ respons på trods af lignende niveauer beskyttelse 11. Således ex vivo IGRAs er værdifulde for tuberkulose diagnose og for adgang vaccine immunogenicitet; men deres anvendelse som prædiktorer for vaccineeffektivitet er begrænset. TCM reaktioner på vaccination, på den anden side kan anvendes til at forudsige vaccineeffektivitet, som demonstreret med simian immundefektvirus (SIV) infektion hos ikke-menneskelige primater 12,13, tuberkulose hos mus 14 og malaria hos mennesker 15,16.

Efter en reaktion resulterer i patogen clearance effektivt immunrespons, er Tcm vedligeholdt og yde beskyttelse til en eventuel anden infektion med det samme middel. En bemærkelsesværdig undtagelse til dette scenarie er M. tuberkulose infektion af mennesker, hvor patienter, der modtager helbredende anti-mycobakteriel terapi er modtagelige for reinfektion 17,18. Derudover events for immunologisk hukommelse under kroniske infektioner, hvor den antigen stimulering fortsætter, er ikke godt forstået 19. Under kroniske infektioner, såsom med human immundefekt virus (HIV) og tuberkulose, er en betydelig Tcm respons i forbindelse med et positivt resultat (f.eks latenstid med tuberkulose og subklinisk sygdom med HIV) 20,21. Adskillige studier med mus og mennesker har vist, at langsigtede dyrkede IFN-γ ELISPOT-analyser måler Tcm reaktioner 16,20-22. Med dette assay PBMC'er dyrkes i faldende koncentration af antigen til 10 til 14 dage, hvilket tillader effektor responser til at toppe og aftage; lette Tcm at differentiere og udvide inden for kulturen.

Langtids-dyrkede IFN-γ ELISPOT-analyser er også blevet anvendt i veterinær-forskning, men fænotypen af ​​responderende celler har været vanskelig at vurdere på grund af mangel af kritiske reagenser, især et antistof mod CCR7. Effektive bovine tuberkulosevacciner [f.eks. ved anvendelse af en enkelt dosis af M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG efterfulgt af viral-vectored antigen 85A underenhedsvaccine, eller svækket M. bovis ΔRD1] fremkalde langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser efter vaccination, der korrelerer med beskyttelse (dvs. lavere mycobakteriel byrde og nedsat TB-associeret patologi) mod efterfølgende udfordring med virulent M. bovis 23,24. Endvidere er antallet af antigen-specifikke IFN-γ-udskillende celler i langsigtede PBMC kulturer er højere ved 12 måneder, men falde på 24 måneder efter BCG vaccination af neonatale kalve, korrelerer med graden af beskyttelse detekterbar indlæg M. bovis udfordring 25. I dette scenario den dyrkede IFN-γ ELISPOT er enn vigtigt redskab til at forudsige vaccine effektivitet, der giver et middel til at prioritere vaccine kandidater til høje omkostninger effektivitetsundersøgelserne. Derudover kan dyrkede ELISPOT teknikker tilpasses til forskellige værter, patogener og cytokiner ved at ændre antigener eller antistoffer til en række forskellige formål i forskellige forskningsområder.

Protocol

1. Forbered følgende løsninger

  1. Forberede komplet RPMI (cRMPI) ved tilsætning af føtalt bovint serum (FBS) til en koncentration på 10% (volumen / volumen), glutamin (2 uM), natriumpyruvat (1 uM), ikke-essentielle aminosyrer (0,1 uM), penicillin -streptomycin (100 enheder / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin) og 2-mercaptoethanol (50 mM) i RPMI 1640.
  2. Forbered 2 X syrecitratdextrose, ved blanding af natriumcitrat (77 uM), citronsyre (38 uM) og dextrose (122 uM) i destilleret vand.
  3. Forbered Ca 2 + Mg2 + fri phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCI (2,7 mM), Na 2 HPO 4 (dibasisk, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobasisk, 2 mM) i destilleret vand; justere pH til 7,2.
  4. Forbered PBS 1% (PBS 1% BSA) ved tilsætning af bovint serumalbumin i PBS (volumen / vægt, 1 g / 100 ml PBS).
  5. Forbered PBS + 0,05% Tween 20(PBST) ved tilsætning af 0,05% Tween 20 i PBS (volumen / volumen, 500 pi Tween 20/1 L PBS).
  6. Forbered 100 mM Tris HCI pH 8,2 buffer ved blanding Tris (100 mM), HCI (0,50 mM) i destilleret vand.
  7. Forbered 35% ethanolopløsning ved fortynding ethylalkohol (renhed ≥99.5%) i destilleret vand (volumen / volumen, 35 ml ethylalkohol / 100 ml destilleret vand).
  8. Filtersteriliser cRPMI, 2 x syrecitratdextrose, PBS, PBS 1% BSA ved anvendelse af 0,22 um filtre.

2. Langsigtede dyrkede celler (14 Day Protocol)

(Dag ét)

  1. Forbered antigen løsninger på to gange slutkoncentrationen i cRPMI. Antigen valg er kritisk og bør tilpasses til formålet med undersøgelsen.
  2. Fortynd rekombinant M. tuberkulose antigener TB10.4 og antigen Ag85A til 2 ug / ml (af hvert antigen, den endelige koncentration 1 ug / ml).
  3. Fortyndet M. bovis oprenset proteinderivat(PPD-B, Prionics Ag) til 10 ug / ml (slutkoncentrationen er 5 ug / ml).
  4. Fortynd den rekombinante tidlig sekretorisk antigene mål 6 (ESAT-6) og kulturfiltratet protein 10 (CFP-10) fusionsprotein (Reşat-6: CFP10) til 2 ug / ml (slutkoncentration på 1 ug / ml).
    BEMÆRK: Disse antigener er immundominante IFN-γ inducerende antigener af tuberkuløs mykobakterier og kan inkluderes for at stimulere PBMC fra M. bovis-inficerede dyr. BCG eller M. bovis ΔRD1 vaccinerede dyr ikke svare Reşat-6: CFP10, som området, der koder disse antigener (dvs. RD1) udgår i disse stammer. Reşat-6: CFP10 anvendes i disse forsøg var en venlig gave fra Dr. C. Minion, Iowa State University. TB10.4 og antigen Ag85A er immundominante antigener til stede i virulent og vaccine M. bovis-stammer 37. PPDB, som et oprenset protein-derivat, er et kompleks af flere antigener, herunder antigener der deles med non-tuberkuløse mykobakterier. Infected dyr vil potentielt svare alle antigener (nemlig: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: CFP10 og PPDB), mens vaccinerede dyr ikke bør reagere på Reşat-6: CFP10 11.
  5. Plade 500 gl / brønd af antigen-opløsning i firdobbelte for hvert dyr i en 24 brønds plade. Til denne protokol, bruge antigener som en pulje; således bruge alle huller indeholder alle de antigener og ingen kontrol (såsom, null eller mitogen) dette trin. Inkuber plade ved 39 ° C / 5% CO2. Den normale temperatur kvæg er 39 ° C; dermed nogle forskere udnytter 39 ° C til dyrkning af bovine celler. Også i visse tilfælde med humane celler, tilvejebringer cellekultur ved 39 ° C ekstra fordel 26,30.
  6. Forbelastning sprøjter kombineret med 16 eller 18 G kanyler med 6 ml 2 X syre-citrat-dextrose; og indsamle 60 ml okseblod ved jugularis venepunktur.
  7. Isoler PBMC ved standard densitetsgradientcentrifugering af perifert blod buffy coat fraktionertilpasning cellekoncentration til 4 x 10 6 celler / ml som beskrevet af Maue et al. 27
  8. Tilføj celler (500 pl / brønd) i antigen forudinstalleret plade med 24 brønde, i fire eksemplarer for hvert dyr (trin 2.5). Inkuber plade ved 39 ° C / 5% CO2.

(Days tre og syv)

  1. Anvendelse af steril teknik fjernes forsigtigt 500 pi af supernatanten fra hver brønd uden at forstyrre cellelaget.
  2. Genopbygge godt volumen ved tilsætning 500 pl / brønd af cRPMI indeholdende IL-2 (30 U / pl, dvs. 15 U / brønd rekombinant humant IL-2 Sigma I7908). Inkuber plade ved 39 ° C / 5% CO2.

(Dage 10 og 12)

  1. Under anvendelse af steril teknik fjernes 750 pi supernatant fra hver brønd. Genopbygge volumen med 750 ul / hul cRPMI (uden IL-2). Inkuber plade ved 39 ° C / 5% CO2.

(Dag ét (12 th dag i Langsigtet kultur protokol))

  1. Mærk ELISPOT pladen ordentligt for hvert sæt af prøver, for at undgå fejl, når plating celler: langsigtede celler plus antigen-præsenterende celler (APC'er), langsigtede celler uden APCs og ex vivo / kortsigtede celler (figur 1). Replikater for hver behandling (dvs. antigen stimulering) bør ske i det mindste i to eksemplarer.
  2. Forbered capture antistofopløsning ved fortynding muse-anti-bovint IFN-γ antistof (MCA2112, klon CC330) i PBS (8 ug / ml).
  3. Under anvendelse af en multikanalpipette pre-befugte brøndene i ELISPOT plade med 15 pl / brønd af 35% ethanol i 1 min. For at undgå skader membran, må du ikke røre bunden af ​​brønde med pipettespidser på ethvert tidspunkt i løbet af analysen.
  4. Pladen vaskes seks gange med 300 pl / brønd PBS. Vask væske skal kasseres efter plade inversion. Vaske bør ske hurtigt, ikke tillader brønde at tørre.
  5. Tilsæt 100 gl / brønd af capture anti-IFN-γ antistof (fra trin 1 ovenfor). Der inkuberes ved 4 ° CO / N (holde pladen inde i en lynlås opbevaringspose).

(Dag to (13 th dag i den langsigtede kultur protokol))

  1. Forbered antigen løsninger på det dobbelte af den endelige koncentration. Behandlinger er: ingen stimulation (cRPMI), PPD-B (20 ug / ml, slutkoncentration: 10 ug / ml), protein cocktail af TB10.4 og Ag85A (2 ug / ml af hvert protein, slutkoncentration: 1 ug / ml af hvert protein), Reşat-6: CFP10 (for M. bovis infektion, 2 ug / ml, slutkoncentration: 1 ug / ml), og en positiv kontrol, såsom kermesbær (20 ug / ml, slutkoncentration: 10 ug / ml). Andre mitogen kan anvendes i stedet for PWM (f.eks Concanavalin A).
    BEMÆRK: til dette trin antigener komponere fire forskellige behandlinger og er not bruges som en pulje (som i trin 2.5). De fire behandlinger er: NS, PPDB, protein cocktail (TB10.4 og Ag85A udgør en behandling) og PWM.

4. Kortsigtede Cell Kultur og Adherent Cell (APC) Isolation

  1. Saml 60 ml blod fra de samme dyr blødte på dag 1 (under: langsigtede kultur, 14 dage protokol) og isolere PBMC'er som før.
  2. Juster cellekoncentration til 2 x 10 6 celler / ml. Label rør klart at forhindre fejlfordeling når plating celler. Disse celler vil blive anvendt til APC'er isolering og også som kortsigtet cellekultur (trin 6.5). Label rør med både dyret antallet og typen af kulturen (i dette tilfælde: ex vivo, kortsigtede eller friske celler).
  3. Fjern overskydende indfangende antistof fra ELISPOT ved pladen inversion. Pladerne vaskes 6 gange med 300 pi PBST.
  4. Fjern så meget som muligt PBST. Pipette 50 pi cellesuspensioner til brøndene mærket som langsigtede celler plus APC'erne. Block andre wells med 200 pl / brønd af cRPMI. Inkuber 90 minutter ved eller 39 ° C. Pre-varme cRPMI eller 39 ° C (nødvendige for efterfølgende trin). Friske PBMC'er ikke anvendes til vedhængende celle (APC) isolering vil være behov for i de efterfølgende trin, og skal opbevares.

5. dyrkede celler

  1. Under 90 minutters inkubation (trin 4.4, kortsigtede kultur og adhærent celle isolation trin), høst langtids-dyrkede celler.
  2. Brug 5 eller 10 gi pipetter, pipette medier med celler op og ned for at frigøre celler, kombinere fire eksemplarer replikater fra hvert dyr i en enkelt 15 ml rør. Centrifuger rørene i 5 minutter ved 400 g.
  3. Efter centrifugering kassere supernatanten ved røret inversion. Løsne cellepellet. Der tilsættes 5 ml PBS, forsigtigt igen suspendere pellet, hvis det er nødvendigt. Gentag centrifugering. Gentag vasketrin to gange. Kassér supernatanten ved røret inversion og forsigtigt igen suspendere cellerne i 1 ml cRPMI. Juster cellekoncentrationtil 2 x 10 5 celler / ml.

6. Belægning Frisk og Dyrkede PBMC'er

  1. Efter 90 minutters inkubation, ryste plader på pladeryster i 30 sek. Fjerne ikke-adhærente celler ved plade inversion. Pipette 150 gl / brønd af varm cRPMI (fra trin 4, under: Kortfristede celler og vedhængende celle (APC) isolation trin).
  2. Ryst plader og kassér vask væske. Gentag vask 3 gange. Tilsættes 100 gl / brønd af hvert antigen i passende brønde (præ-mærket).
  3. Til plade celler, pipette 100 pl / brønd af langsigtet dyrket cellesuspension (2 x 10 5 celler / ml) i brøndene mærket som langsigtede celler plus APC'er. Sikre, at de langsigtede celler tilsat i dette trin er fra samme dyr som APC er allerede i brønden. Bland ikke APC-og langsigtede dyrkede celler fra forskellige dyr.
  4. Tilsæt 100 gl / brønd af den langsigtede dyrket cellesuspension (2 x 10 5 celler / ml) i brønde uden APCs om vurdering af APC kravet til langtidsdyrkning respons.
  5. Tilsættes 100 gl / brønd af kortvarige celler (frisk isoleret og indstillet til 2 x 10 6 celler / ml) til ex vivo vurdering respons. Pladerne inkuberes O / N ved 39 ° C / 5% CO2-inkubator. Sørg for, at pladerne er ligger fladt og ikke stak plader.
    BEMÆRK: Hvis der ønskes analyse af cellefænotype, flowcytometri kan udføres som en accessorisk assay. Celler udplades i 96 brønds U-bundede plader (i stedet for ELISPOT plader) som beskrevet for ELISPOT assay. Indfangningsantistof adsorption (trin 3,4-3,5), bør springes over. Celler inkuberes derefter O / N ved 39 ° C / 5% CO2 og en standard celle farvningsprotokollen udføres. Celle farvningsreagenser er inkluderet i reagenserne tabel.

Dag tre (14 th dag i den Langsigtet kultur protokol)

  1. Fortynd påvisning antistof (muse-anti-bovint IFN-γ, klon CC302) til 5 ug / ml i PBS 1% BSA. Kassér fluider fra brønde og vask plader: seks gange med PBST (300 pl / brønd), anbringelse på rysteapparat hver gang i 10 sek før og i-mellem vaske, en gang med dH2O (300 pl / brønd), yderligere 6 gange med PBST (300 pl / brønd) og to gange med PBS (300 ul / brønd). Efter celler fjernes fra pladerne, og hvis der ikke biosikkerhed bekymringer gælder, procedurer kan udføres uden biologiske sikkerhedsskabe.
  2. Kassér vask væske. Fjern så meget vaskevæske som muligt ved at trykke plade på papirservietter. Tilføj påvisning antistof (100 pl / brønd).
  3. Pladerne inkuberes i 120 minutter ved eller 39 ° C. Under denne inkubering trin, forberede alkalisk phosphatase opløsning i overensstemmelse med producentens anvisninger. Tredive minutter før brug (dvs. 90 minutter efter tilsætning af detektionsantistof til brønde) fortyndes reagenset i PBST. Vend røret forsigtigt for at blande reagenser og inkuberet ved stuetemperatur.
  4. Efter 120 min inkubation kassere overskydende detektionsantistof ved plade inversion. Pladen vaskes 6 gange med PBST (300 pl / brønd). Fjern så meget vaskevæske som muligt ved at trykke plade på papirservietter.
  5. Tilsættes 100 gl / brønd af alkalisk phosphatase-opløsning (fra trin 3 ovenfor). Pladerne inkuberes i 45 minutter ved stuetemperatur. Kassér væske og vaske hver plade 6 gange med PBST (300 pl / brønd).
  6. Forbered substratopløsningen efter producentens anvisninger (Vector Blå AP substrat III): Fortynd reagenser i 100 mM Tris HCL pH 8,2 buffer. Pipetter 50 pl / brønd af substratopløsning.
  7. Inkuber ved stuetemperatur indtil blå farve begynder at udvikle (ca. 30 min). Kassér væske og vaske tallerkener med rigelige mængder dH 2 O. Fjerne bundplade at eksponere membranen, vaskes tilbage af brønde og lade pladen lufttørre.
  8. Læse plader på immunospot billedanalysator eller ELISPOT-læser (tabel 1), eller manuelt ved hjælp af et stereomikroskop. Alternativt holder pladeri mørke ved stuetemperatur indtil læsning. Grund af den høje stabilitet af reaktionen substratet, kvalitet bevares i flere år.
    BEMÆRK: Celler og antigenkoncentrationer blev optimeret for at undgå brønde med utallige spots 23,24,27,37. Det er muligt, at utallige pletter dannelse forekomme i forskellige indstillinger, eller på grund af biologisk variation. Hvis dette er tilfældet, bør cellekoncentration optimeres, så en læsbar spot optælling respons er opnået.

7. Plader Reading og Dataanalyse

  1. Udføre analyse som pr Cellular Technology Limited (CTL) ELISPOT pladelæser vejledning (tabel 1). Efter Pletterne tællinger opnået for hver af brøndene, beregne gennemsnit mellem dubletter. Den specifikke immunreaktion mod hvert antigenisk stimulus beregnes ved at trække det gennemsnitlige antal pletter i ikke-stimulerede brønde fra den i antigen-stimulerede brønde.

Representative Results

Ca. en måned efter aerosol-infektion med M. bovis (10 4 kolonidannende enheder), PBMC'er fra inficeret (n = 8) og kontroldyr (n = 8) blev dyrket i nærværelse af antigener og IL-2 i 13 dage. Udvikling af Tcm responser efter infektion blev bestemt ved anvendelse af IFN-γ ELISPOT assay. Repræsentant Tcm (i nærvær eller fravær af APC'er) og ex vivo IFN-γ-ELISpot-responser fra inficerede dyr (tre dyr) og en ikke-inficeret dyr (et dyr) er vist i figur 1. En vellykket langsigtet IFN-γ ELISPOT analyseresultaterne i celler, der producerer IFN-γ (Spot-dannende celler, SFC) under stimulerede forhold og i nærheden manglende svar fra ikke-inficerede dyr, og under ikke-stimulerede forhold. Desuden bør en stærk T-celle respons forekommer som respons på PWM. Specifikke reaktioner på M. bovis blev vurderet af PPD-B eller Reşat-6: CFP10 antigen stimulering. Som vist i figur1, robust Tcm og ex vivo responser på PPD-B og Reşat-6: CFP10 blev påvist fra alle tre M. bovis-inficerede dyr. Minimal til ingen Tcm og ex vivo responser blev detekteret fra kontroldyret. Desuden blev tilstedeværelsen af ​​APC kræves for optimale Tcm reaktioner fra smittede dyr, som det fremgår af stærkt reducerede responser af langsigtede celler dyrket i fraværet af autologe APC. IFN-γ reaktion fra PBMC'er fra M. bovis inficerede og ikke-inficerede dyr er vist i figur 2. Antallet af SFC'er fra hvert dyr blev beregnet som det gennemsnitlige antal SFC'er i dobbeltprøver som reaktion på PPD-B minus den respektive reaktion på medier alene. Responser blev anslået til 10 6 celler. Responser afveg (P <0,05) baseret på infektion status, tilstedeværelse eller fravær af APC'er og kultur varighed (dvs.., Langsigtet kultur versus ex vivo kultur).

Erhvervelse billede af plader
1. Tænd maskinen
2. Åben "Immuno Capture" Version 6.3 software.
3. Trin 1: Vælg pladetype.
4. Trin 2: load plade.
5. Trin 3: Vælg scanningsindstillinger.
6. Trin 4: starte scanningen.
7. Opnå overblik billede af pladen.
8. Skub pladen.
9. Afslut "Immuno Capture" software.
Counting stedet danner enheder
1. Åbn "Immuno Spot Capture" version 5.0 software.
2. Vælg målsæt t seværdighed: normal.
3. Vælg optælling modul: Smart tæller.
4. Trin 1: load plade.
5. Trin 2: definere tælle parametre: test nøjagtighed spot anerkendelse brønde med forskellige vinkler.
6. Start auto tæller.
Kvalitetskontrol
1. Åbn "immunospot Capture" version 5.0 software.
2. Vælg optælling modul: kvalitetskontrol.
3. Trin 1: load plade.
4. Trin 2: Analyser fremhævede brønde individuelt.
5. Afslut kvalitetskontrol.

Tabel 1 - Autoimmun Diagnostika ELISPOT læser billedoptagelse og celle tælle procedure.

ove_content "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 1
Figur 1. Billede af brønde fra en langsigtet dyrket IFN γ ELISPOT assay. Cultured IFN-γ ELISPOT assay blev udført approximatelyone måned efter udfordring med virulent M. bovis (tre dyr). Ikke-inficerede dyr blev inkluderet som kontroller (et dyr) Langsigtede cellelinjer blev genereret ved at stimulere PBMC med en cocktail af rekombinant Ag85A (1 pg / ml), TB10.4 (1 pg / ml), Reşat-6.: CFP10 (1 ug / ml) og PPD-B (5 ug / ml) i 13 dage efterfulgt af overførsel til ELISPOT plader i nærvær eller fravær af autolog APC. Kortsigtede celler bestod af PBMC isoleret på dag 13 og belagt direkte ind ELISPOT plader. Langsigtede og kortsigtede celler blev stimuleret med PPD-B (10 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 pg / ml), medium alene eller kermesbærmitogen (5 &# 956; g / ml) i 24 timer.

Figur 2
Figur 2. Repræsentative resultater fra en langsigtet kulturperler IFN γ ELISPOT respons på M. bovis oprenset proteinderivat (PPD-B). Cultured IFN-γELISPOT assay blev udført approximatelyone måned efter udfordring med virulent M. bovis (otte dyr). Ikke-inficerede dyr blev inkluderet som kontroller (otte dyr Langsigtede celler blev genereret ved at stimulere PBMC med en cocktail af rekombinant Ag85A (1 ug / ml), TB10.4 (1 ug / ml), Reşat-6: CFP10 (1 ug / ml) og PPD-B (5 ug / ml) i 13 dage efterfulgt af overførsel til ELISPOT plader i nærvær eller fravær af autologe APC'er. Kortsigtede celler bestod af PBMC isoleret på dag 13 og udpladet direkte i ELISPOT plade . Langsigtet og short sigt celler blev stimuleret med PPD-B (10 pg / ml) eller medium alene i 24 timer. Specifikke svar fra hvert dyr (SFC / 10 6 celler) præsenteres som svar på PPD-B (gennemsnit af duplikatprøver) minus reaktion på mediernes alene.

Discussion

IFN-γ-produktion i langtids-dyrkede ELISPOT-analyser er generelt skyldes Tcm hos mennesker, men hvor denne reaktion udvikler sig i kulturen er dårligt forstået. Hvorvidt Tcm er til stede i cirkulation og ekspandere in vitro, eller hvis TCM reaktioner skyldes differentiering af effektor og Tem celler i Tcm under dyrkning er ikke kendt. Imidlertid har undersøgelser med prøver fra mennesker fundet, at CD4 + T-celler fra ex vivo og langsigtede dyrket IFN-γ ELISPOT-analyser har ubeslægtede epitopspecificiteter, hvilket indebærer, at Tcm svarene ikke udvikle sig fra effektorceller 28. Naturligvis kan varigheden af respons varierer, men hvis patogen clearance opnås, vinder både ex vivo og Tcm responser falde. Også, reaktioner af langvarige kulturer målt tidligt og længe efter antigen priming (når effektor respons er lavere) er vist at korrelere, hvilket indikerer, at cirkulerende Tcm populationer tidligt og længe efter antigen-priming forbliver relateret in vivo. På den anden side, er størrelsen af den ex vivo respons ikke at være relateret til størrelsen af hukommelsen respons 29. Disse resultater antyder, at langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser resulterer fra in vitro-ekspansion af TCM og en tilhørende aftagende effektor responser i prøven, snarere end differentieringen af effektorceller i Tcm fænotype.

Med kvæg, er det relative bidrag effektor og memory delmængder til svar opdaget af de langsigtede IFN-γ ELISPOT-analyser ikke kendt. Nylige undersøgelser tyder på en korrelation mellem vaccine udløste langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser og beskyttelse mod efterfølgende eksperimentel infektion med M. bovis 23-24. Det er blevet rapporteret, at svage langsigtede IFN-γ-ELISpot reaktioner på vaccination er forbundet med den manglende beskyttelse 30. Både live og dræbeed vacciner inducerer lignende ex vivo IFN-γ-ELISpot-responser, men vaccination med levende BCG fremkalder stærkere langtids-dyrkede IFN-γ-ELISpot-responser end lave dræbt vaccinepræparater. Interessant, levende vacciner er beskyttende, mens dræbte formuleringer undlader at yde beskyttelse mod udfordring med virulent tuberkuløse mykobakterier 31-32, 33.

Vurdering TCM reaktioner er også muligt ved at sortere disse celler fra PBMC. Direkte berigelse af Tcm fra PBMC, kræver imidlertid dyrt udstyr, højtuddannede personlig og er vanskelig, da disse celler ikke er talrige i blodet. Langsigtet kultur af PBMC giver berigelse af Tcm løbet Tem og effektor celler uden dyre udstyr; men fordi disse T-celle-populationer er ekspanderes in vitro kan de være mindre repræsentative for in vivo memory-responser. Det er muligt at få adgang IFN-γ memory-responser (ved hjælp af langvarig kultur eller Tcm slagsing strategier) af andre end ELISPOT assays, såsom: cytokin ELISA 34, cytokin perle arrays (CBA), intracellulær farvning (ICS), eller cytokin proteinarrays (CPA). Disse metoder; imidlertid er generelt mindre følsomme end ELISPOT-analyser 35.

En fordel ved ELISPOT er dens evne til at detektere den øjeblikkelige indfangning af cytokinet kort efter dets frigivelse forhindrer fortynding i supernatanten og nedbrydning ved enzymatisk spaltning eller cytokin optagelse af andre celler. ELISPOT-analyser opdage enkelte celler, der producerer cytokiner der giver præcise resultater, selv i lavt signal til støj scenarier (dvs. lave specifikke svar) 35. Også med ICS, kan påvisning af cytokiner inden de ledes medføre falsk identifikation af celler, der producerer cytokiner (f.eks. På grund af posttranslationel modulering før eller under den sekretoriske proces) 34. Transport hæmmere ansat med ICS analyser at minimere cytokinsekretionunder antigenstimulering (kendt som Golgi stop-proteiner) begrænse varigheden af cellestimulering grund af celletoksicitet af disse proteiner i sidste ende påvirker cytokinproduktion 35.

Med det sagt - CBA, CPA og ICS er nyttige teknikker til måling af multiple cytokiner samtidigt og / eller til bestemmelse celleoverflademarkør ekspression (dvs. med ICS.). Derfor kan disse metoder anvendes i kombination med IFN-γ ELISPOT-analyse 36. Mens tidligere bovine TB vaccine virkningsundersøgelser målt Tcm svar via ELISPOT assay, vil påvisningen TCM reaktioner fra andre teknikker sandsynligvis giver sammenlignelige resultater. Vigtigere er det, ELISPOT assay er billigere og enklere at udføre end CBA, CPA og ICS analyseteknikker 34. Manuel tælling af SFC er et alternativ til automatiseret optælling og ELISPOT plader kan opbevares ved stuetemperatur i længere tid med minimal tab af kvalitet, før eller efter spot counting 37.

Den langsigtede kulturperler IFN-γ ELISPOT respons er blevet anvendt til at vurdere hukommelse reaktioner af mennesker, og kvæg, når de evaluerer tuberkulose vaccine reaktioner 14-16,31-32,33. TCM svar er også antages at spille en betydelig rolle i værtens respons til flere andre smitstoffer af kvæg, såsom:. Mycoplasma mycoider subsp mycoides 42, Anaplasma Marginale 38 og bovint respiratorisk syncytialvirus 39. Potentielt kan den langsigtede ELISPOT-analyse tilpasses til andre dyrearter, cytokiner og infektioner. Disse bredere applikationer vil især være nyttigt for veterinære immunologi applikationer på grund af nuværende begrænsede tilgængelighed af specifikke reagenser.

TCM svar er afgørende for beskyttelse mod flere infektioner, men måle dem tidligt efter infektion / immunisering (for resultatet sygdom forudsigelse eller vaccine effekt) may være besværligt. Analyse af immunresponset under ex vivo og korte antigene stimuleringsbetingelser vil oftere repræsenterer effektor responser, på grund af overlapningen af hukommelses- og effektor reaktioner, især i begyndelsen af immunologisk hukommelse formation. I forbindelse med kroniske sygdomme, hvor antigenet belastning er konstant, vil ex vivo responser vurdere effektor cellereaktioner eller en kombination af hukommelses- og effektor celleresponser. Den langsigtede dyrket IFN-γ ELISPOT assay beskrevet her, sandsynligvis muliggør måling TCM responser snarere end effektor T-celle eller kombinerede CD4 + T-cellereaktioner. Sammenfattende langsigtede dyrket IFN-γ ELISPOT assay tilvejebringer en værdifuld fremgangsmåde til estimering T-celle memory-responser og har været anvendt med succes til at evaluere hukommelse responser af flere arter til en række infektioner agenter 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forskningen blev støttet af USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 og Landbrug og Fødevarer Research Initiative Konkurrencedygtige Grant nej. 2011-67015-30736 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi takker Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, og Tracy Porter for deres fremragende tekniske bistand samt Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers Robin Zeisness, og David Panthen for den fremragende pleje og håndtering af dyr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100, (6), 655-669 (2000).
  2. Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292, (5523), 1907 (2001).
  3. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136, (7), 2348-2357 (1986).
  4. Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (26), 15137-15142 (2001).
  5. Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188, (12), 5811-5817 (2012).
  6. Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401, (6754), 708-712 (1999).
  7. Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011, (1), 1-11 (2011).
  8. Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6, (12), e29194 (2011).
  9. Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2, (8), e735 (2007).
  10. Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
  11. Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30, (16), 2611-2622 (2012).
  12. Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312, (5779), 1530-1533 (2006).
  13. Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203, (6), 1533-1541 (2006).
  14. Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190, (12), 6311-6319 (2013).
  15. Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3, (4), e2027 (2008).
  16. Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, (13), 4836-4841 (2005).
  17. Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341, (16), 1174-1179 (1999).
  18. Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, (3), 717-720 (2001).
  19. Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33, (4), 451-463 (2010).
  20. Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202, (11), 1685-1689 (2010).
  21. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38, (2), 373-383 (2013).
  22. Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194, (7), 984-992 (2006).
  23. Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27, (8), 1201-1209 (2009).
  24. Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18, (3), 373-379 (2011).
  25. Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19, (8), 1254-1260 (2012).
  26. Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18, (7), 1150-1156 (2011).
  27. Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73, (10), 6659-6667 (2005).
  28. Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169, (4), 2210-2214 (2002).
  29. Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128, (1), 83-91 (2009).
  30. Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77, (8), 3364-3373 (2009).
  31. Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56, (12), 3310-3312 (1988).
  32. Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79, (3), 135-143 (1999).
  33. Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae. Research in veterinary science. 59, (1), 10-16 (1995).
  34. Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792, (Chapter 1), 3-23 (2011).
  35. Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1, (2), 99-99 (2012).
  36. Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9, (10), 1231-1237 (2010).
  37. Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
  38. Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181, (11), 7759a-7769a (2008).
  39. Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30, (45), 6382-6388 (2012).
Anvendelse af Langsigtet kulturperler Interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay til Vurdering Effektorceller og Memory T celle responser i Cattle
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).More

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter