Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية

doi: 10.3791/52833 Published: July 11, 2015

Summary

ويستخدم على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط immunospot فحص كإجراء الردود الذاكرة المركزية ويرتبط مع الاستجابات لقاح لمكافحة المتفطرات واقية. مع هذا الاختبار، يتم تحفيز الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي مع المستضدات المتفطرات وانترلوكين 2 لمدة 14 يوما، والتمايز تمكين وتوسيع الخلايا التائية الذاكرة المركزية.

Abstract

يتم إنشاء خلايا المستجيب والذاكرة T من خلال برمجة التنموية للخلايا ساذجة بعد الاعتراف مستضد. إذا يتم التحكم في العدوى تصل إلى 95٪ من الخلايا T ولدت خلال مرحلة التوسع والقضاء عليها (أي مرحلة الانكماش) ​​والخلايا التائية الذاكرة لا تزال قائمة، وأحيانا لمدى الحياة. في البشر، وقد وصفت اثنين من مجموعات فرعية متميزة وظيفيا من ذاكرة الخلايا التائية على أساس التعبير عن مستقبلات صاروخ موجه العقدة الليمفاوية. خلايا T الذاكرة المركزية تعبر عن CC مستقبلات chemokine 7 وCD45RO وتقع أساسا في مناطق T-خلية من الأجهزة اللمفاوية الثانوية. خلايا T الذاكرة المستجيب تعبر عن CD45RO، تفتقر CCR7 وعرض مستقبلات المرتبطة اللمفاوية صاروخ موجه إلى الأنسجة الطرفية أو ملتهبة. خلايا T المستجيب لا تعبر عن أي CCR7 أو CD45RO ولكن عند لقاء مع السيتوكينات المستجيب المنتجات مستضد، مثل انترفيرون γ. يتم استخدام فحوصات الإفراج انترفيرون γ لتشخيص السل البقري والبشري وكشف في المقام الأول المستجيب والذاكرة المستجيب استجابات الخلايا T. استجابات الخلايا التائية الذاكرة المركزية من قبل خلايا CD4 + T للتلقيح، من ناحية أخرى، يمكن استخدامها للتنبؤ نجاعة اللقاح، كما هو موضح مع عدوى فيروس نقص المناعة القردي من الرئيسيات غير البشرية والسل في الفئران، والملاريا في البشر. وقد أثبتت العديد من الدراسات على الفئران والبشر فضلا عن بيانات غير منشورة على الماشية، أن الإنترفيرون γ المقايسات ELISPOT قياس الذاكرة المركزية استجابات الخلايا T. مع هذا الاختبار، وخلايا الدم وحيدات النوى المحيطية يتم تربيتها في خفض تركيز المستضد لمدة 10 إلى 14 يوما (ثقافة طويلة الأجل)، والسماح ردود المستجيب إلى ذروته ويضعف. تسهيل خلايا الذاكرة T المركزية للتمييز، وتوسيع إطار الثقافة.

Introduction

يتم إنشاء خلايا المستجيب والذاكرة T من خلال برمجة التنموية للخلايا CD4 + T ساذجة بعد الاعتراف مستضد. تمايز الخلايا الساذجة CD4 + T إلى خلايا خلوى إنتاج يتطلب الاعتراف الممرض من قبل الخلايا المناعية الفطرية، تقديم المستضد للخلايا T، وشارك في التحفيز والتغيرات النسخي مما أدى إلى إنتاج السيتوكينات الاستقطاب. على سبيل المثال: خلايا مقدمة للمستضد تنتج انترلوكين (IL) -12 ردا على مسببات الأمراض داخل الخلايا، التي، جنبا إلى جنب مع الاعتراف مستضد، ويعزز التمايز للخلايا T في T المساعد 1 (TH1) خلايا 1،2 خلال الإشارة من خلال محول الإشارات ومنشط النسخ 4 (STAT4) وT-مربع أعرب في خلايا T (T-رهان)، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا، IL-2 الإنتاج، والتوسع نسيلي ومضاد للفيروسات (IFN) إنتاج -γ 3،4. إذا يتم التحكم في العدوى، ويتم استبعاد ما يصل إلى 95٪ من الخلايا T ولدت خلال مرحلة التوسع (أي انكماشلا تزال مرحلة) وذاكرة الخلايا التائية، وأحيانا لمدى الحياة 5. Sallusto وآخرون كشف مجموعتين فرعيتين متميزة وظيفيا من الخلايا التائية الذاكرة لدى البشر على أساس التعبير عن مستقبلات صاروخ موجه العقدة الليمفاوية. الخلايا التائية الذاكرة المركزية (TCM) تعبر عن مستقبلات chemokine CC (CCR) -7 وCD45RO وتقع أساسا في مناطق T-خلية من الأجهزة اللمفاوية الثانوية. TCM محدودة وظيفة المستجيب، عتبة تفعيل المنخفضة والاحتفاظ ارتفاع إنتاج IL-2 والقدرة التكاثري. خلايا الذاكرة المستجيب T (تيم) تعبر عن CD45RO، تفتقر CCR7 وعرض مستقبلات لصاروخ موجه إلى الأنسجة الطرفية أو الملتهبة. خلايا المستجيب لا تعبر عن أي CCR7 أو CD45RO لكن فورا إنتاج السيتوكينات المستجيب، مثل IFN-γ، عند الاعتراف مستضد.

يتم استخدام فحوصات الإفراج IFN-γ (اجرا) لتشخيص السل البقري والبشري 7. المتفطرة البقرية هو العامل الرئيسي لمرض السل البقري (BTB)، في حين كاليفورنيا الإنسانهي سبب سيس من السل بشكل رئيسي من قبل المتفطرة السلية. مع هذه الاختبارات، والدم كله أو الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMC) وحفز مع المستضدات المتفطرات من 16 إلى 24 ساعة والإنتاج IFN-γ داخل طاف يقاس ELISA أو من خلال الكشف عن الخلايا المنتجة IFN-γ باستخدام تقنيات ELISPOT. ونتيجة لفترة وجيزة التحفيز (أي، من 16 إلى 24 ساعة)، وإنتاج السيتوكينات السريع، خارج الحي فحوصات الكشف في المقام الأول المستجيب وتيم الردود. وقد تأكد ذلك من خلال تحليل تدفق cytometric من السكان الخلية في هذه الثقافات 10/08.

السابق مدرجة الجسم الحي استجابات IFN γ بشكل روتيني في تقييم وحة الاستجابة المناعية للقاحات السل، بما في ذلك تلك المستخدمة لتقييم ردود الماشية. معظم لقاحات فعالة السل البقري تثير استجابات IFN γ محددة، ولكن ليس جميع اللقاحات التي تحفز استجابات IFN γ هي protectivه. أيضا، ومستويات IFN-γ التي تسببها التطعيم، كما تم قياسها قبل الإصابة، لا ترتبط بالضرورة مع الحماية. على سبيل المثال، قد يكون سلالات مختلفة BCG قدرات مختلفة للحث خارج الجسم الحي استجابة IFN-γ، على الرغم من مستويات حماية مماثلة (11). وبالتالي، خارج الحي IGRAs هي قيمة لتشخيص السل وللوصول المناعية اللقاحات؛ ومع ذلك، فإن استخدامها في التنبؤ نجاعة اللقاح محدودة. ردود الطب الصينى التقليدى لتلقيح، من ناحية أخرى، يمكن أن تستخدم للتنبؤ نجاعة اللقاح، كما هو موضح مع فيروس نقص المناعة القردي (SIV) إصابة في الرئيسيات غير البشرية 12،13، والسل في الفئران 14 والملاريا في البشر 15،16.

بعد استجابة مناعية فعالة مما يؤدي إلى إزالة العوامل المسببة للأمراض، ويحتفظ الطب الصينى التقليدى وتوفير الحماية للعدوى الثاني في نهاية المطاف من قبل نفس الوكيل. وهناك استثناء واضح من هذا السيناريو هو M. infe السلction من البشر التي المرضى الذين يتلقون العلاجية العلاج المضاد للالفطرية عرضة لإعادة العدوى 17،18. بالإضافة إلى ذلك، والأحداث التي تنظم الذاكرة المناعية أثناء الالتهابات المزمنة، حيث استمر التحفيز الأنتيجين، ليست مفهومة جيدا 19. أثناء الالتهابات المزمنة، مثل المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) والسل، ويرتبط استجابة كبيرة الطب الصينى التقليدى مع نتيجة إيجابية (مثل الكمون مع السل ومرض تحت الإكلينيكي مع فيروس نقص المناعة البشرية) 20،21. وقد أثبتت العديد من الدراسات على الفئران والبشر أن على المدى الطويل مثقف المقايسات ELISPOT-IFN γ تقيس ردود الطب الصينى التقليدى 16،20-22. مع هذا الاختبار، PBMCs هي مثقف في خفض تركيز المستضد لمدة 10 إلى 14 يوما، والسماح ردود المستجيب إلى ذروته ويضعف. تسهيل الطب الصينى التقليدى للتمييز، وتوسيع إطار الثقافة.

كما تم استخدام على المدى الطويل مثقف IFN-γ المقايسات ELISPOT في الطب البيطري.وكانت الأبحاث، إلا أن النمط الظاهري للخلايا الاستجابة الصعب تقدير نظرا لعدم وجود الكواشف الحيوية، وخاصة أجسام مضادة لCCR7. لقاحات السل البقري فعالة [على سبيل المثال. باستخدام جرعة واحدة من M. البقرية عصيات كالميت غيران (BCG)، تليها BCG التي كتبها مستضد 85A قاح الوحيدات الفيروسية تنقلها، أو الموهن M. البقرية ΔRD1] انتزاع مثقف-γ IFN الردود ELISPOT على المدى الطويل بعد التطعيم التي ترتبط مع حماية (أي أقل عبء الفطرية وانخفاض علم الأمراض المرتبطة TB) ضد التحدي لاحق مع ضراوة M. البقرية 23،24. وعلاوة على ذلك، فإن أعداد خلايا إفراز الإنترفيرون γ-مستضد معين داخل الثقافات PBMC على المدى الطويل هي أعلى في 12 شهرا ولكن انخفاض في 24 شهرا بعد التطعيم BCG العجول حديثي الولادة، ربط مع درجة من الحماية آخر كشف M. البقرية تحديا 25. في هذا السيناريو، مثقف IFN-γ ELISPOT هوأداة ن هامة للتنبؤ نجاعة اللقاح، وتوفير وسيلة لإعطاء الأولوية لقاحات مرشحة للمحاكمات فعالية التكلفة العالية. بالإضافة إلى ذلك، تقنيات ELISPOT مثقف يمكن تكييفها لمختلف المضيفين، مسببات الأمراض والسيتوكينات عن طريق تغيير المستضدات أو الأجسام المضادة لمجموعة متنوعة من الأغراض في المجالات البحثية المختلفة.

Protocol

1. إعداد الحلول التالية

  1. إعداد كامل RPMI (cRMPI) وذلك بإضافة مصل بقري جنيني (FBS) إلى تركيز 10٪ (حجم / حجم)، الجلوتامين (2 ميكرومتر)، البيروفات الصوديوم (1 ميكرومتر)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (0.1 ميكرومتر)، البنسلين -streptomycin (100 وحدة / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين) و 2 المركابتويثانول (50 ملي) في RPMI 1640.
  2. إعداد 2 X سترات حامض سكر العنب، عن طريق خلط سيترات الصوديوم (77 ميكرون)، وحامض الستريك (38 ميكرون)، وسكر العنب (122 ميكرومتر)، في الماء المقطر.
  3. يعد الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ الفوسفات مجانا مخزنة المالحة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2: كلوريد الصوديوم (137 ملم)، بوكل (2.7 ملم)، نا 2 هبو 4 (ثنائي القاعدة، 10 مم)، KH 2 PO 4 (أحادي القاعدة، 2 مم) في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2.
  4. إعداد PBS 1٪ (PBS 1٪ BSA) عن طريق إضافة ألبومين المصل البقري في برنامج تلفزيوني (الحجم / الوزن، 1G / 100 مل من PBS).
  5. إعداد برنامج تلفزيوني + 0.05٪ توين 20(PBST) وذلك بإضافة 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني (حجم / حجم، 500 ميكرولتر من توين 20/1 L من PBS).
  6. إعداد 100 ملي تريس HCL درجة الحموضة 8.2 العازلة عن طريق خلط تريس (100 ملم)، حمض الهيدروكلوريك (0.50 ملم) في الماء المقطر.
  7. إعداد 35٪ من محلول الإيثانول عن طريق تمييع الكحول الإيثيلي (نقاء ≥99.5٪) في الماء المقطر (حجم / حجم 35 مل من الكحول الإيثيلي / 100 مل من الماء المقطر).
  8. فلتر تعقيم cRPMI، 2 × حمض سكر العنب سترات، PBS، PBS 1٪ BSA باستخدام 0.22 ميكرون مرشحات.

2. الخلايا المستزرعة على المدى الطويل (14 بروتوكول يوم)

(اليوم الأول)

  1. إعداد الحلول المستضد في ضعف التركيز النهائي في cRPMI. اختيار مستضد أمر بالغ الأهمية ويجب أن تكون مصممة لغرض الدراسة.
  2. تمييع المؤتلف M. السل المستضدات TB10.4 والمستضد Ag85A إلى 2 ميكروغرام / مل (من كل مستضد، والتركيز النهائي هو 1 ميكروغرام / مل).
  3. مخفف M. البقرية تنقية البروتين المشتق(PPD-B، Prionics AG) إلى 10 ميكروغرام / مل (تركيز النهائي هو 5 ميكروغرام / مل).
  4. تمييع أوائل الهدف المؤتلف إفرازية الأنتيجين 6 (ESAT-6) والثقافة الترشيح البروتين 10 (CFP-10) انصهار بروتين (ريسات-6: CFP10) إلى 2 ميكروغرام / مل (تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل).
    ملاحظة: هذه المستضدات سائد مناعيا IFN-γ حمل مستضدات من المتفطرات السلية ويمكن أن تشمل لتحفيز PBMC من M. البقرية الحيوانات المصابة. BCG أو M. تطعيم البقرية ΔRD1 الحيوانات لا تستجيب للريسات-6: CFP10، حيث أن المنطقة ترميز هذه المستضدات (أي RD1) يتم حذف في هذه السلالات. رشاد-6: كان CFP10 المستخدمة في هذه الدراسة هدية عينية من الدكتور C. المحبوب المعبود، جامعة ولاية أيوا. TB10.4 والمستضد Ag85A هي المستضدات سائد مناعيا الحالية في خبثا واللقاح M. البقرية سلالات 37. PPDB، وبروتين مشتق النقاء، عبارة عن مجمع من عدة مستضدات بما في ذلك المضادات المشتركة مع المتفطرات غير السلية. Infecوالحيوانات تيد يحتمل أن يستجيب لجميع المستضدات (وهي: TB10.4، حج 85A، رشاد-6: CFP10 وPPDb)، في حين أن الحيوانات الملقحة لا ينبغي أن يستجيب لريسات-6: CFP10 11.
  5. لوحة 500 ميكرولتر / بئر حل مستضد في quadruplicates لكل حيوان في 24 لوحة جيدا. لهذا البروتوكول، استخدام المضادات كبركة. وبالتالي استخدام جميع الآبار تحتوي على جميع المستضدات وأي ضوابط (مثل، خالية أو mitogen) هذه الخطوة. احتضان لوحة في 39 ° C / 5٪ CO 2. درجة الحرارة العادية من الماشية هي 39 ° C؛ وبالتالي، بعض المحققين الاستفادة من 39 درجة مئوية لمدة الثقافة من الخلايا البقري. أيضا، في بعض الحالات مع الخلايا البشرية، والثقافة الخلية في 39 ° C يوفر وأضاف صالح 26،30.
  6. المحاقن ما قبل الحمل إلى جانب 16 أو 18 G إبر الحقن مع 6 مل من 2 X حمض سترات الدكستروز. وجمع 60 مل من الدم البقري من قبل بزل الوريد الوداجي.
  7. عزل PBMC من قبل ستاندرد الطرد المركزي التدرج الكثافة من الدم المحيطي كسور معطف الشهباء ضبط تركيز الخلية إلى 4 X 10 6 خلية / مل كما وصفها Maue وآخرون 27
  8. إضافة الخلايا (500 ميكرولتر / جيد) في مستضد مسبقة 24 لوحة جيدا، في quadruplicate لكل حيوان (الخطوة 2.5). احتضان لوحة في 39 ° C / 5٪ CO 2.

(ثلاثة أيام وسبعة)

  1. باستخدام تقنية معقمة، وإزالة بعناية 500 ميكرولتر من طاف من كل بئر من دون إزعاج طبقة الخلايا.
  2. تجديد حجم جيد من خلال إضافة 500 ميكرولتر / بئر cRPMI تحتوي على IL-2 (30 U / ميكرولتر، أي 15 U / جيد، IL-2 البشري المؤتلف سيجما I7908). احتضان لوحة في 39 ° C / 5٪ CO 2.

(أيام 10 و 12)

  1. باستخدام تقنية معقمة، وإزالة 750 ميكرولتر من طاف من كل بئر. تجديد حجم مع 750 ميكرولتر / بئر cRPMI (بدون IL-2). احتضان لوحة في 39 ° C / 5٪ CO 2.

الطبقة = "jove_title"> 3. ELISPOT الفحص (بروتوكول يوم الثالث)

(يوم واحد (12 يوم التاسع من بروتوكول ثقافة طويل الأجل))

  1. تسمية لوحة ELISPOT بشكل صحيح لكل مجموعة من العينات، لتجنب الأخطاء عند طلاء الخلايا: الخلايا على المدى الطويل بالإضافة إلى تقديم المستضد خلايا (ناقلات الجنود المدرعة)، والخلايا على المدى الطويل دون ناقلات الجنود المدرعة وخارج الحي خلية / قصيرة الأجل (الشكل 1). يعيد لكل معاملة (أي التحفيز الأنتيجين) وينبغي أن يتم على الأقل في مكررة.
  2. إعداد حل التقاط الأجسام المضادة عن طريق تمييع الماوس المضادة للالبقري IFN-γ الأضداد (MCA2112، استنساخ CC330) في برنامج تلفزيوني (8 ميكروغرام / مل).
  3. باستخدام pipettor الأقنية قبل الرطب الآبار من لوحة ELISPOT مع 15 ميكرولتر / جيد من 35٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة. لمنع تلف الغشاء، لا تلمس الجزء السفلي من الآبار مع نصائح ماصة في أي وقت أثناء الفحص.
  4. غسل لوحة ست مرات مع 300 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني. يجب التخلص من غسل السوائل عن طريق لوحة قلب. وينبغي أن يتم يغسل بسرعة، وعدم السماح الآبار لوحة لتجف.
  5. ماصة 100 ميكرولتر / بئر التقاط الأجسام المضادة لمكافحة IFN-γ (من الخطوة 1 أعلاه). احتضان عند 4 درجات CO / N (الحفاظ على لوحة داخل كيس تخزين انغلق).

(اليوم الثاني (13 يوم التاسع من البروتوكول الثقافة على المدى الطويل))

  1. إعداد الحلول المستضد في ضعف التركيز النهائي. العلاجات: لا التحفيز (cRPMI)، PPD-B (20 ميكروغرام / مل، وتركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل)، والبروتين كوكتيل من TB10.4 وAg85A (2 ميكروغرام / مل من كل من البروتين، والتركيز النهائي: 1 ميكروغرام / مل من كل من البروتين)، رشاد-6: CFP10 (للعدوى M. البقرية، 2 ميكروغرام / مل، وتركيز النهائي: 1 ميكروغرام / مل)، وتحكم إيجابية، مثل الفتلاق (20 ميكروغرام / مل، وتركيز النهائي: 10 ميكروغرام / مل). ويمكن استخدام mitogen أخرى بدلا من PWM (على سبيل المثال، كونكانافالين A).
    ملاحظة: لهذه الخطوة مستضدات يؤلف أربعة معالجات مختلفة ومن نبعد التمديد تستخدم بركة (كما في الخطوة 2.5). العلاجات الأربعة هي: NS، PPDb، بروتين كوكتيل (TB10.4 وAg85A تشكل معاملة واحدة) وPWM.

زراعة الخلايا 4. المدى القصير وخلية ملتصقة (ناقلات الجنود المدرعة) عزل

  1. جمع 60 ملليتر دم من الحيوانات نفسها نزف في يوم 1 (تحت: الثقافة على المدى الطويل، 14 البروتوكول اليوم) وعزل PBMCs كما كان من قبل.
  2. ضبط تركيز الخلية إلى 2 X 10 6 خلية / مل. أنابيب التسمية واضح لمنع سوء تخصيص عندما خلايا الطلاء. وسيتم استخدام هذه الخلايا لناقلات الجنود المدرعة العزلة وأيضا زراعة الخلايا على المدى القصير (الخطوة 6.5). أنابيب التسمية مع كل من عدد الحيوانات ونوع الثقافة (في هذه الحالة: فيفو السابقين، على المدى القصير أو خلايا جديدة).
  3. إزالة الزائدة القبض على الضد من ELISPOT بواسطة لوحة انقلاب. غسل الأطباق 6 مرات مع 300 ميكرولتر PBST.
  4. إزالة الكثير من PBST وقت ممكن. ماصة 50 ميكرولتر من الايقاف الخلية إلى الآبار وصفت بأنها الخلايا على المدى الطويل بالإضافة إلى ناقلات الجنود المدرعة. كتلة أهلا وسهلا أخرىليرة سورية مع 200 ميكرولتر / بئر cRPMI. احتضان 90 دقيقة في أو 39 درجة مئوية. قبل دافئ cRPMI أو 39 ° C (ضروري لخطوات لاحقة). وستكون هناك حاجة PBMCs جديدة لم تستخدم لخلية ملتصقة (ناقلات الجنود المدرعة) العزلة في الخطوات اللاحقة ويجب أن يتم تخزينها.

5. الخلايا المستزرعة

  1. أثناء الحضانة 90 دقيقة (الخطوة 4.4 والثقافة على المدى القصير وملتصقة خطوة عزل الخلية)، والحصاد الخلايا المستزرعة على المدى الطويل.
  2. استخدام 5 أو 10 ميكرولتر الماصات، ووسائل الإعلام ماصة مع خلايا صعودا وهبوطا لفصل الخلايا، والجمع بين quadruplicate يعيد من كل حيوان إلى واحد أنبوب 15 مل. أنابيب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 غرام.
  3. بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف بواسطة أنبوب انقلاب. طرد بيليه الخلية. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني، بلطف اعادة تعليق بيليه، إذا لزم الأمر. تكرار الطرد المركزي. كرر الخطوة غسل مرتين. تجاهل طاف بواسطة أنبوب قلب وبلطف اعادة تعليق الخلايا في 1ML cRPMI. ضبط تركيز الخليةل2 X 10 5 خلية / مل.

6. طلاء الطازجة وPBMCs مثقف

  1. بعد حضانة 90 دقيقة، هز لوحات على لوحة شاكر لمدة 30 ثانية. إزالة الخلايا غير ملتصقة بواسطة لوحة انقلاب. ماصة 150 ميكرولتر / بئر الحارة cRPMI (من الخطوة 4، تحت: الخلايا على المدى القصير وخلايا ملتصقة (ناقلات الجنود المدرعة) خطوة العزلة).
  2. هز لوحات ونبذ السائل غسل. تكرار غسل 3 مرات. إضافة 100 ميكرولتر / جيد من كل مستضد في آبار المناسبة (المسمى مسبقا).
  3. لوحة الخلايا، ماصة 100 ميكرولتر / بئر تعليق خلية مثقف طويلة الأجل (2 × 10 5 خلية / مل) في الآبار وصفت بأنها الخلايا على المدى الطويل بالإضافة إلى ناقلات الجنود المدرعة. تأكد من أن الخلايا على المدى الطويل المضافة في هذه الخطوة هي من نفس الحيوان كما هو APC بالفعل في البئر. لا تخلط الخلايا المستزرعة APC وعلى المدى الطويل من الحيوانات المختلفة.
  4. ماصة 100 ميكرولتر / بئر تعليق خلية مثقف طويلة الأجل (2 × 10 5 خلية / مل) في الآبار دون APCالصورة لتقييم متطلبات APC إلى الاستجابة الثقافة على المدى الطويل.
  5. إضافة 100 ميكرولتر / بئر الخلايا على المدى القصير (عزل طازجة ويتم تعديلها ل2 × 10 6 خلية / مل) لخارج الجسم الحي تقييم الاستجابة. احتضان لوحات O / N عند 39 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة. تأكد من أن لوحات يكذبون شقة ولا كومة لوحات.
    ملاحظة: إذا كان المطلوب تحليل النمط الظاهري الخلية، التدفق الخلوي يمكن أن يؤديها كما مقايسة التبعية. ومطلي الخلايا في 96 لوحات جيدا U السفلية (بدلا من ELISPOT لوحات) كما هو موضح ELISPOT مقايسة. يجب أن يتم تخطي التقاط الأجسام المضادة الامتزاز (الخطوات 3،4-3،5). ثم يتم تحضين الخلايا O / N عند 39 ° C / 5٪ CO2 ومعيار بروتوكول تلطيخ الخلايا التي يؤدونها. وترد الكواشف تلطيخ خلية في الجدول الكواشف.

لمدة ثلاثة أيام (14 يوم التاسع من البروتوكول الثقافة على المدى الطويل)

  1. تمييع الأجسام المضادة كشف (الماوس مكافحة البقري IFN-γ، استنساخ CC302) إلى 5 ميكروغرام / مل في PBS 1٪ BSA. تجاهل السوائل من الآبار وغسل الأطباق: ست مرات مع PBST (300 ميكرولتر / جيد)، ووضع على شاكر في كل مرة لمدة 10 ثانية قبل وبين يغسل مرة واحدة مع DH 2 O (300 ميكرولتر / جيد)، وهو إضافية 6 مرات مع PBST (300 ميكرولتر / جيد) ومرتين مع برنامج تلفزيوني (300 ميكرولتر / جيد). بعد إزالة الخلايا من لوحات، وإذا لم تنطبق المخاوف المتعلقة بالسلامة الأحيائية، قد يتم تنفيذ إجراءات خارج خزانات السلامة البيولوجية.
  2. تخلصي من السائل غسل. إزالة أكبر قدر من السائل غسل ممكن عن طريق التنصت على لوحة على مناشف ورقية. إضافة الكشف عن الأجسام المضادة (100 ميكرولتر / جيد).
  3. احتضان لوحات لمدة 120 دقيقة في أو 39 درجة مئوية. خلال هذه الخطوة الحضانة، وإعداد حل الفوسفاتيز القلوية باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ثلاثين دقيقة قبل الاستخدام (أي 90 دقيقة بعد إضافة الكشف عن الأجسام المضادة لآبار) تمييع كاشف في PBST. عكس الأنبوب برفق لمزج الكواشف وحضنت في RT.
  4. بعد 120 دقيقة الحضانة، وتجاهل الكشف الزائد الأجسام المضادة التي كتبها لوحة انقلاب. غسل لوحة 6 مرات مع PBST (300 ميكرولتر / جيد). إزالة أكبر قدر من السائل غسل ممكن عن طريق التنصت على لوحة على مناشف ورقية.
  5. إضافة 100 ميكرولتر / بئر حل الفوسفاتيز القلوية (من الخطوة 3 أعلاه). احتضان لوحات لمدة 45 دقيقة في RT. تجاهل السائل ويغسل كل لوحة 6 مرات مع PBST (300 ميكرولتر / جيد).
  6. إعداد الحل الركيزة باتباع إرشادات الصانعين (ناقلات الأزرق AP الركيزة الثالثة): تمييع الكواشف في 100 ملي تريس HCL درجة الحموضة 8.2 العازلة. ماصة 50 ميكرولتر / جيد من الحل الركيزة.
  7. في احتضان RT حتى يبدأ اللون الأزرق لتطوير (حوالي 30 دقيقة). تجاهل السوائل وغسل الأطباق مع كميات وفيرة من درهم 2 O. إزالة لوحة أسفل لفضح الغشاء، وغسل الخلفي من الآبار والسماح لوحة في الهواء الجاف.
  8. قراءة لوحات على immunospot محلل صورة أو قارئ ELISPOT (الجدول 1)، أو يدويا، وذلك باستخدام stereomicroscope. بدلا من ذلك، والحفاظ على لوحاتفي الظلام في RT حتى القراءة. بسبب ارتفاع ثبات الركيزة رد فعل، والحفاظ على جودة لعدة سنوات.
    تم الأمثل خلايا وتجمعات مستضد لتجنب الآبار مع وجود بقع يحصى 23،24،27،37: ملاحظة. فمن الممكن أن تشكيل البقع لا يحصى يحدث في بيئات مختلفة أو بسبب الاختلاف البيولوجي. إذا كان هذا هو الحال، ينبغي أن يكون الأمثل تركيز الخلية بحيث يتم الحصول على قراءة استجابة بقعة العد.

7. لوحات قراءة وتحليل البيانات

  1. إجراء تحليل حسب الخلوية التكنولوجيا المحدودة (CTL) لوحة ELISPOT دليل القارئ (الجدول 1). بعد الحصول على التهم البقع لكل من الآبار، وحساب المتوسط ​​بين التكرارات. يتم احتساب الاستجابة المناعية الخاصة بكل التحفيز الأنتيجين عن طريق طرح متوسط ​​عدد البقع في الآبار غير المحفز من أن الآبار حفز المستضد.

Representative Results

ما يقرب من شهر واحد العدوى بعد الهباء الجوي مع M. البقرية (10 4 وحدات تشكيل مستعمرة)، PBMCs من المصابين (ن = 8) والحيوانات التحكم (ن = 8) كان المثقف في وجود مستضدات وIL-2 لمدة 13 يوما. وضع استجابات الطب الصينى التقليدى بعد الإصابة تم تحديد استخدام IFN-γ ELISPOT مقايسة. ممثل الطب الصينى التقليدى (في وجود أو عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة) وخارج الحي IFN-γ الردود ELISPOT من الحيوانات المصابة (ثلاث الحيوانات) وحيوان غير مصاب (حيوان واحد) في الشكل 1. A ناجحة على المدى الطويل IFN-γ ELISPOT نتائج الفحص في الخلايا المنتجة IFN-γ (سبوت تشكيل خلايا، SFC) في ظل ظروف حفز وبالقرب من عدم وجود استجابة من الحيوانات غير المصابة وتحت ظروف غير حفز. أيضا، يجب أن يحدث رد فعل قوي خلية T ردا على PWM. استجابات محددة لM. تم تقييم البقرية التي كتبها PPD-B أو ريسات-6: CFP10 التحفيز الأنتيجين. كما هو مبين في الشكل 1، قوي الطب الصينى التقليدى وخارج الحي الردود على PPD-B ورشات-6: تم الكشف عن CFP10 من كل ثلاثة M. البقرية -infected الحيوانات. تم الكشف عن الحد الأدنى للم الطب الصينى التقليدى وخارج الجسم الحي الاستجابات من الحيوان السيطرة. أيضا، كان مطلوبا وجود ناقلات الجنود المدرعة للاستجابات الطب الصينى التقليدى المثلى عن طريق الحيوانات المصابة، كما يتضح من تقلص إلى حد كبير ردود الخلايا على المدى الطويل مثقف في حالة عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة ذاتي. استجابة IFN-γ التي كتبها PBMCs من M. البقرية المصابة ويتم عرض الحيوانات غير المصابة في الشكل 2. تم حساب عدد SFCs من كل حيوان حيث بلغ متوسط ​​عدد SFCs في عينات المكررة ردا على PPD-B ناقص استجابة منها إلى وسائل الإعلام وحدها. وقدرت الردود لمدة 10 6 خلايا. ردود اختلف (P <0.05) على أساس الإصابة الوضع، وجود أو عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة ومدة الثقافة (أي، على المدى الطويل ثقافة مقابل فيفو السابقين الثقافة).

ز = "0" هوامش الخلية = "0">
الحصول على صورة لوحات
1. تشغيل الجهاز
2. فتح "المناعية لقطة" النسخة 6.3 البرمجيات.
3. الخطوة 1: حدد نوع لوحة.
4. الخطوة 2: لوحة الحمل.
5. الخطوة 3: تحديد خيارات المسح الضوئي.
6. الخطوة 4: بدء المسح الضوئي.
7. الحصول على صورة نظرة عامة على لوحة.
8. إخراج اللوحة.
9. الإقلاع عن التدخين "المناعية لقطة" البرمجيات.
عد الوحدات بقعة تشكيل
1. فتح "المناعي بقعة القبض على" الإصدار 5.0 البرمجيات.
2. حدد objec نوع تي: عادي.
3. اختر وحدة العد: العد الذكية.
4. الخطوة 1: لوحة الحمل.
5. الخطوة 2: تحديد معايير الفرز: دقة اختبار الاعتراف بقعة على الآبار مع وجود بقع مختلفة.
6. بدء العد السيارات.
ضبط الجودة
1. فتح "Immunospot القبض على" الإصدار 5.0 البرمجيات.
2. اختر وحدة العد: مراقبة الجودة.
3. الخطوة 1: لوحة الحمل.
4. خطوة 2: تحليل الآبار المميزة على حدة.
5. الانتهاء من مراقبة الجودة.

الجدول 1 - AutoImmun DIAGNOSTIKA ELISPOT اكتساب القارئ صورة وخلايا العد الداخلي.

ove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 1
الشكل 1. صورة من الآبار من IFN- مثقف على المدى الطويل γ ELISPOT مقايسة. تم إجراء مثقف-γ IFN ELISPOT مقايسة approximatelyone بعد شهر من التحدي مع ضراوة M. البقرية (ثلاثة حيوانات). أدرجت الحيوانات غير المصابة والضوابط (حيوان واحد) تم إنشاؤها خطوط الخلايا على المدى الطويل من خلال تحفيز PBMC مع كوكتيل من Ag85A المؤتلف (1 ميكروغرام / مل)، TB10.4 (1 ميكروغرام / مل)، رشاد-6: CFP10 (1 ميكروغرام / مل)، وPPD-B (5 ميكروغرام / مل) لمدة 13 يوما تليها نقل لوحات ELISPOT في وجود أو عدم وجود ذاتي APC. وتألفت الخلايا على المدى القصير من PBMC معزولة في يوم 13 ومطلي مباشرة في لوحات ELISPOT. وقد حفز خلايا طويلة الأجل وقصيرة الأجل مع PPD-B (10 ميكروغرام / مل)، رشاد-6: CFP10 (1 ميكروغرام / مل) ومتوسطة وحدها أو الفتلاق mitogen (5 &# 956؛ ز / مل) لمدة 24 ساعة.

الرقم 2
الشكل 2. ممثل النتائج من IFN- مثقف على المدى الطويل γ استجابة ELISPOT إلى M. البقرية تنقية البروتين المشتق تم تنفيذ (PPD-B). مثقف IFN-γELISPOT فحص approximatelyone بعد شهر من التحدي مع ضراوة M. البقرية (ثمانية حيوانات). أدرجت الحيوانات غير المصابة والضوابط (تم إنشاؤها خلايا ثمانية حيوانات طويل الأجل من خلال تحفيز PBMC مع كوكتيل من Ag85A المؤتلف (1 ميكروغرام / مل)، TB10.4 (1 ميكروغرام / مل)، رشاد-6: CFP10 (1 ميكروغرام / مل)، وPPD-B (5 ميكروغرام / مل) لمدة 13 يوما تليها نقل لوحات ELISPOT في وجود أو عدم وجود ناقلات الجنود المدرعة ذاتي. وتألفت الخلايا على المدى القصير من PBMC معزولة في يوم 13 ومطلي مباشرة في لوحة ELISPOT . الطويلة الأجل وSHOوقد حفز خلايا غ الأمد مع PPD-B (10 ميكروغرام / مل) أو المتوسطة وحدها لمدة 24 ساعة. يتم تقديم استجابات محددة من كل حيوان (SFC / 10 6 خلايا)، وردا على PPD-B (متوسط ​​العينات المكررة) ناقص ردا على وسائل الإعلام وحدها.

Discussion

هو إنتاج IFN-γ في المدى الطويل المقايسات ELISPOT مثقف يرجع عموما إلى الطب الصينى التقليدى في البشر، ولكن كيف تطور هذا الرد في ثقافة غير مفهومة. سواء الطب الصينى التقليدى موجودة في الدورة الدموية والتوسع في المختبر، أو إذا كانت ردود الطب الصينى التقليدى تنتج عن تمايز الخلايا المستجيب وتيم في الطب الصينى التقليدى خلال الثقافة غير معروف. ومع ذلك، فقد وجدت الدراسات مع عينات من البشر أن خلايا CD4 + T من خارج الحي وطويلة الأجل فحوصات مثقف IFN-γ ELISPOT لها خصوصيات حاتمة لا علاقة لها، مما يعني أن ردود الطب الصينى التقليدى لا تتطور من الخلايا المستجيب 28. من الواضح، ومدة الاستجابة قد تختلف، ولكن إذا ويتحقق إزالة العوامل المسببة للأمراض، في نهاية المطاف على حد سواء خارج الحي وردود الطب الصينى التقليدى تنخفض. أيضا، ردود الثقافات على المدى الطويل قياسها في وقت مبكر وبعد فترة طويلة من فتيلة الأنتيجين (عند الاستجابة المستجيب أقل) يظهر لربط، مشيرا إلى أن تعميم السكان الطب الصينى التقليدى وقت مبكر، وبعد فترة طويلة المضادةلا يزال فتيلة الجيني ذات الصلة في الجسم الحي. من ناحية أخرى، لا يظهر حجم الاستجابة فيفو السابقين لتكون متصلة بحجم الرد الذاكرة 29. هذه النتائج تشير إلى أن المثقف-γ IFN الردود ELISPOT طويلة الأجل ناتجة عن التوسع في المختبر من الطب الصينى التقليدى وانحسار المرتبطة الردود المستجيب في العينة، بدلا من تمايز الخلايا المستجيب في الطب الصينى التقليدى النمط الظاهري.

مع الماشية، والمساهمة النسبية للالمستجيب والذاكرة فرعية لردود الكشف عنها بواسطة طويلة الأجل فحوصات IFN-γ ELISPOT غير معروف. وتشير الدراسات الحديثة وجود علاقة بين لقاح أثارت مثقف-γ IFN الردود ELISPOT على المدى الطويل وحماية ضد العدوى التجريبية لاحق مع M. البقرية 23-24. وقد أفيد أن ضعف على المدى الطويل IFN-γ الردود ELISPOT لتطعيم ترتبط مع عدم وجود حماية 30. كل من يعيش وقتلاللقاحات إد تحفز مماثلة خارج الحي IFN-γ الردود ELISPOT، ولكن التطعيم الحية BCG يتسبب على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT ردود فعل أقوى من الاستعدادات لقاح للقتل. ومن المثير للاهتمام، واللقاحات الحية واقية في حين فشلت تركيبات قتل لتوفير الحماية من التحدي مع ضراوة المتفطرات السلية 31-32، 33.

تقييم ردود الطب الصينى التقليدى هو أيضا ممكنا عن طريق فرز هذه الخلايا من PBMC. تخصيب المباشر من الطب الصيني التقليدي من PBMC، ومع ذلك، يتطلب أجهزة غالية الثمن، المدربين تدريبا عاليا الشخصية وصعب لأن هذه الخلايا ليست عديدة في مجرى الدم. توفر ثقافة طويلة الأمد من PBMC إثراء الطب الصينى التقليدى على تيم والخلايا المستجيب دون أجهزة باهظة الثمن. ومع ذلك، ليتم توسيع هؤلاء السكان الخلايا التائية في المختبر أنها قد تكون أقل تمثيلا من الردود الذاكرة في الجسم الحي. فمن الممكن للوصول إلى استجابات ذاكرة IFN-γ (باستخدام الثقافة على المدى الطويل أو الطب الصينى التقليدى النوعELISAs خلوى 34، صفائف خلوى حبة (CBA)، وتلطيخ الخلايا (ICS)، أو صفائف بروتين السيتوكين (CPA): استراتيجيات) من خلال فحوصات أخرى من ELISPOT مثل جي. هذه الأساليب؛ ومع ذلك، عادة ما تكون أقل حساسية من ELISPOT المقايسات 35.

ميزة من ELISPOT هو قدرته على كشف القبض الفوري للخلوى بعد وقت قصير من إطلاقه منع التخفيف في طاف والتدهور التي كتبها الانقسام الأنزيمية أو امتصاص خلوى بواسطة خلايا أخرى. المقايسات ELISPOT كشف الخلايا وحيدة إنتاج السيتوكينات تقديم نتائج دقيقة حتى في إشارة إلى انخفاض سيناريوهات الضوضاء (أي استجابات محددة منخفضة) 35. أيضا، مع ICS، والكشف عن السيتوكينات قبل الإفراج قد يؤدي إلى هوية مزورة من الخلايا المنتجة السيتوكينات (على سبيل المثال، وذلك بسبب تعديل آخر متعدية قبل أو أثناء عملية إفرازية) 34. مثبطات النقل المستخدمة مع ICS المقايسات لتقليل إفراز السيتوكيناتخلال التحفيز مستضد (المعروف باسم جولجي البروتينات توقف) تحديد مدة التحفيز الخلية نظرا لسمية خلية من هذه البروتينات التي تؤثر في نهاية المطاف إنتاج السيتوكينات 35.

مع أن قال - CBA، CPA وICS تقنيات مفيدة لقياس السيتوكينات متعددة في وقت واحد و / أو لتحديد سطح الخلية علامة التعبير (أي مع ICS). وبالتالي، يمكن استخدام هذه الأساليب في تركيبة مع-γ IFN ELISPOT مقايسة 36. في حين السل البقري الدراسات نجاعة اللقاح السابقة قياس ردود الطب الصينى التقليدى عبر ELISPOT مقايسة، فإن الكشف عن ردود الطب الصينى التقليدى من خلال تقنيات أخرى على الأرجح تسفر عن نتائج مماثلة. الأهم من ذلك، مقايسة ELISPOT أقل تكلفة وأبسط لأداء من CBA، CPA وتحليل ICS تقنيات 34. العد والفرز اليدوي من SFC هو بديل لالعد الآلي، ويمكن تخزين لوحات ELISPOT في RT لفترة طويلة من الوقت مع الحد الأدنى من فقدان جودة، قبل أو بعد بقعة جounting 37.

وقد تم تطبيق على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT استجابة لتقييم الاستجابات الذاكرة من قبل الإنسان، والماشية عند تقييم الاستجابات لقاح السل 14-16،31-32،33. ويفترض ردود TCM أيضا أن تلعب أدوارا هامة في ردود المضيفة لعدة عوامل المعدية الأخرى من الماشية، مثل: الميكوبلازما الفطرانية subsp الفطرانية 42، Anaplasma هامشية 38 و البقري الفيروس المخلوي التنفسي 39. يحتمل أن تكون، يمكن تكييف ELISPOT مقايسة طويلة الأجل لغيرها من الحيوانات الأنواع، والسيتوكينات والالتهابات. وهذه التطبيقات الأوسع يكون مفيدا بشكل خاص للتطبيقات علم المناعة البيطرية بسبب محدودية الحالي من الكواشف محددة.

ردود TCM حاسمة للوقاية من العديد من الأمراض، ولكن قياس عليها في وقت مبكر بعد الاصابة / التحصين (للتنبؤ نتيجة مرض أو نجاعة اللقاح) أماهذ تكون مرهقة. وتحليل الاستجابة المناعية تحت خارج الحي والشروط التحفيز المستضدات قصيرة في كثير من الأحيان تمثل ردود المستجيب، وذلك بسبب التداخل الردود الذاكرة والمستجيب، وخصوصا خلال بداية تكوين الذاكرة المناعية. في سياق الأمراض المزمنة التي الحمل المستضد هو مستمر، وخارج الحي الردود تقييم استجابات الخلايا المستجيب أو مزيج من الردود الذاكرة والخلايا المستجيب. على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT الفحص، الموصوفة هنا، من المرجح أن تمكن من قياس ردود الطب الصينى التقليدى بدلا من الخلايا T المستجيب أو الجمع بين استجابات الخلايا CD4 + T. باختصار، يوفر على المدى الطويل مثقف-γ IFN ELISPOT مقايسة نهجا قيما لتقدير T الردود ذاكرة الخلية واستخدمت بنجاح لتقييم ردود ذكرى العديد من الأنواع لمجموعة متنوعة من عوامل العدوى 12-16، 20-25،29 ، 31،33،34،38،39.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد البحث من قبل وزارة الزراعة، ARS كريس: 3625-32000-104 والزراعة ومبادرة بحوث الأغذية تنافسي منحة لا. 2011-67015-30736 من المعهد الوطني USDA للأغذية والزراعة. نشكر جيسيكا بولوك، إيما Frimml مورغان، شيلي زيمرمان، كريستين باس، بروس PESCH، مولي Stafne، ألن جنسن، وتريسي بورتر للحصول على مساعدة فنية ممتازة وكذلك ريبيكا ماديسون، دوغ يوينغ، كاتي Pille، جاي ستيفن، ديفيد لوبرز روبن Zeisness، وديفيد Panthen لرعاية ممتازة والتعامل مع الحيوانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium citrate (dihydrate) Various
Citric acid (monohydrate) Various
Dextrose Various
ELISPOT PVDF plate Various
Vectastain ABC – AP KIT Standard Vector Laboratories AK-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit Vector Laboratories SK-5300
Ag85A Lionex LRP-0004.3 23, 24, 25, 37
TB 10.4 Lionex LRP-0061.6 23, 24, 25, 37
PPDb Prionics AG 7600055
rESAT-6:CFP10 Kind gift Dr. Minion, Iastate 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 Serotec MCA1783B 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 Serotec MCA2112 23, 24, 25, 27,  37
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 Serotec MCA1653GA
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A Serotec MCA2434GA
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 Abcam ab95665
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 Serotec MCA1783PE
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 Invitrogen A-21130
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 SouthernBiotechnology 1080-193
Goat anti-rat IgG-APC Invitrogen A10540
BD Cytofix/Cytoperm™ BD Biosciences 554714
BrefeldinA Sigma-Aldrich B7651
Pokeweed Mitogen Sigma-Aldrich L8777
Recombinat human Interleukin 2 Sigma-Aldrich I7908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., et al. Novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100, (6), 655-669 (2000).
  2. Mullen, A. C., High, F. A., Hutchins, A. S., Lee, H. W., Villarino, A. V., et al. Role of T-bet in commitment of Th1 cells before IL-12-dependent selection. Science Signaling. 292, (5523), 1907 (2001).
  3. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. Journal of immunology. 136, (7), 2348-2357 (1986).
  4. Lighvani, A. A., Frucht, D. M., Jankovic, D., Yamane, H., Aliberti, J., et al. T-bet is rapidly induced by interferon-gamma in lymphoid and myeloid cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (26), 15137-15142 (2001).
  5. Masopust, D., Picker, L. J. Hidden memories: frontline memory T cells and early pathogen interception. Journal of immunology. 188, (12), 5811-5817 (2012).
  6. Sallusto, F., Lenig, D., Förster, R., Lipp, M., Lanzavecchia, A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions. Nature. 401, (6754), 708-712 (1999).
  7. Waters, W. R., Palmer, M. V., Thacker, T. C., Davis, W. C., Sreevatsan, S., et al. Tuberculosis immunity: Opportunities from studies with Cattle. Clinical and Developmental Immunology. 2011, (1), 1-11 (2011).
  8. Whelan, A. O., Villarreal-Ramos, B., Vordermeier, H. M., Hogarth, P. J. Development of an antibody to bovine IL-2 reveals multifunctional CD4 T(EM) cells in cattle naturally infected with bovine tuberculosis. PLoS ONE. 6, (12), e29194 (2011).
  9. Streitz, M., Tesfa, L., Yildirim, V., Yahyazadeh, A., Ulrichs, T., et al. Loss of receptor on tuberculin-reactive T-cells marks active pulmonary tuberculosis. PLoS ONE. 2, (8), e735 (2007).
  10. Soares, A. P., Scriba, T. J., Joseph, S., Harbacheuski, R., Murray, R. A., et al. Bacillus Calmette-Guérin vaccination of human newborns induces T cells with complex cytokine and phenotypic profiles. Journal of immunology. 180, 3569-3577 (2008).
  11. Waters, W. R., Palmer, M. V., Buddle, B. M., Vordermeier, H. M. Bovine tuberculosis vaccine research: historical perspectives and recent advances. Vaccine. 30, (16), 2611-2622 (2012).
  12. Letvin, N. L., Mascola, J. R., Sun, Y., Gorgone, D. A., Buzby, A. P., et al. Preserved CD4+ central memory T cells and survival in vaccinated SIV-challenged monkeys. Science. 312, (5779), 1530-1533 (2006).
  13. Mattapallil, J. J., Douek, D. C., Buckler-White, A., Montefiori, D., Letvin, N. L., et al. Vaccination preserves CD4 memory T cells during acute simian immunodeficiency virus challenge. The Journal of experimental medicine. 203, (6), 1533-1541 (2006).
  14. Lindenstrom, T., Knudsen, N. P. H., Agger, E. M., Andersen, P. Control of Chronic Mycobacterium tuberculosis .infection by CD4 KLRG1- IL-2-secreting central memory cells. The Journal of Immunology. 190, (12), 6311-6319 (2013).
  15. Todryk, S. M., Bejon, P., Mwangi, T., Plebanski, M., Urban, B., et al. Correlation of memory T cell responses against TRAP with protection from clinical malaria, and CD4 CD25 high T cells with susceptibility in Kenyans. PLoS ONE. 3, (4), e2027 (2008).
  16. Webster, D. P., Dunachie, S., Vuola, J. M., Berthoud, T., Keating, S., et al. Enhanced T cell-mediated protection against malaria in human challenges by using the recombinant poxviruses FP9 and modified vaccinia virus Ankara. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, (13), 4836-4841 (2005).
  17. Rie, A., Warren, R., Richardson, M., Victor, T. C., Gie, R. P., et al. Exogenous reinfection as a cause of recurrent tuberculosis after curative treatment. New England Journal of Medicine. 341, (16), 1174-1179 (1999).
  18. Caminero, J. A., Pena, M. J., Campos-Herrero, M. I., Rodríguez, J. C., Afonso, O., et al. Exogenous reinfection with tuberculosis on a European Island with a moderate incidence of disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, (3), 717-720 (2001).
  19. Sallusto, F., Lanzavecchia, A., Araki, K., Ahmed, R. From vaccines to memory and back. Immunity. 33, (4), 451-463 (2010).
  20. Millington, K. A., Gooding, S., Hinks, T. S. C., Reynolds, D. J. M., Lalvani, A. Mycobacterium tuberculosis.-specific cellular immune profiles suggest bacillary persistence decades after spontaneous cure in untreated tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 202, (11), 1685-1689 (2010).
  21. Su, L. F., Kidd, B. A., Han, A., Kotzin, J. J., Davis, M. M. Virus-specific CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults. Immunity. 38, (2), 373-383 (2013).
  22. Goletti, D., Butera, O., Bizzoni, F., Casetti, R., Girardi, E., Poccia, F. Region of difference 1 antigen-specific CD4+ memory T cells correlate with a favorable outcome of tuberculosis. The Journal of infectious diseases. 194, (7), 984-992 (2006).
  23. Waters, W. R., et al. Efficacy and immunogenicity of Mycobacterium bovis. DeltaRD1 against aerosol M. bovis. infection in neonatal calves. Vaccine. 27, (8), 1201-1209 (2009).
  24. Hope, J. C., et al. Identification of surrogates and correlates of protection in protective immunity against Mycobacterium bovis. infection induced in neonatal calves by vaccination with M. bovis. BCG Pasteur and M. bovis. BCG Danish. Clinical and Vaccine Immunology. 18, (3), 373-379 (2011).
  25. Thom, M. L., et al. Duration of immunity against Mycobacterium bovis. following neonatal vaccination with bacillus Calmette-Guérin Danish: significant protection against infection at 12, but not 24, months. Clinical and Vaccine Immunology. 19, (8), 1254-1260 (2012).
  26. Aabye, M. G., Ravn, P., Johansen, I. S., Eugen-Olsen, J., Ruhwald, M. Incubation of whole blood at 39°C augments gamma interferon (IFN-γ)-induced protein 10 and IFN-γ responses to Mycobacterium tuberculosis .antigens. Clinical and vaccine immunology : CVI. 18, (7), 1150-1156 (2011).
  27. Maue, A. C., Waters, W. R., Davis, W. C., Palmer, M. V., Minion, F. C., Estes, D. M. Analysis of immune responses directed toward a recombinant early secretory antigenic target six-kilodalton protein-culture filtrate protein 10 fusion protein in Mycobacterium bovis.-infected cattle. Infection and Immunity. 73, (10), 6659-6667 (2005).
  28. Godkin, A. J., Thomas, H. C., Openshaw, P. J. Evolution of epitope-specific memory CD4(+) T cells after clearance of hepatitis C virus. Journal of immunology. 169, (4), 2210-2214 (2002).
  29. Todryk, S. M., et al. The relationship between human effector and memory T cells measured by ex vivo and cultured ELISPOT following recent and distal priming. Immunology. 128, (1), 83-91 (2009).
  30. Vordermeier, H. M., et al. Viral booster vaccines improve Mycobacterium bovis. BCG-induced protection against bovine tuberculosis. Infection and Immunity. 77, (8), 3364-3373 (2009).
  31. Orme, I. M. Induction of nonspecific acquired resistance and delayed-type hypersensitivity, but not specific acquired resistance in mice inoculated with killed mycobacterial vaccines. Infect. Immun. 56, (12), 3310-3312 (1988).
  32. Griffin, J. F., Mackintosh, C. G., Slobbe, L., Thomson, A. J., Buchan, G. S. Vaccine protocols to optimise the protective efficacy of BCG. Tubercle and lung disease : the official journal of the International Union against Tuberculosis and Lung Disease. 79, (3), 135-143 (1999).
  33. Buddle, B. M., et al. Protection of cattle from bovine tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium vaccae. Research in veterinary science. 59, (1), 10-16 (1995).
  34. Lehmann, P. V., Zhang, W. Unique strengths of ELISPOT for T cell diagnostics. Methods in Molecular Biology. 792, (Chapter 1), 3-23 (2011).
  35. Tincati, C., Iii, A. J. C., Snyder-Cappione, J. E. Distinguishing latent from active Mycobacterium tuberculosis. infection using Elispot assays: looking beyond interferon-gamma). Cells. 1, (2), 99-99 (2012).
  36. Lash, G. E., Pinto, L. A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert review of vaccines. 9, (10), 1231-1237 (2010).
  37. Vordermeier, M., Whelan, A. O. ELISPOT assays to enumerate bovine IFN-γ-secreting cells for the development of novel vaccines against bovine tuberculosis. Methods in molecular biology. 792, 219-227 (2012).
  38. Han, S., Norimine, J., Palmer, G. H., Mwangi, W., Lahmers, K. K., Brown, W. C. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. Journal of immunology. 181, (11), 7759a-7769a (2008).
  39. Helden, M. J. G., et al. Pre-existing virus-specific CD8(+) T-cells provide protection against pneumovirus-induced disease in mice. Vaccine. 30, (45), 6382-6388 (2012).
تطبيق على المدى الطويل مثقف انترفيرون γ انزيم مرتبط Immunospot الفحص لتقييم المستجيب والذاكرة T الردود خلية في الماشية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).More

Maggioli, M. F., Palmer, M. V., Vordermeier, H. M., Whelan, A. O., Fosse, J. M., Nonnecke, B. J., Waters, W. R. Application of Long-term cultured Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle. J. Vis. Exp. (101), e52833, doi:10.3791/52833 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter