长期培养的干扰素γ酶联免疫斑点法被用作中央记忆应答的量度并且与保护性抗分枝杆菌疫苗的反应。用该测定中,外周血单核细胞刺激与分枝杆菌抗原和IL-2 14天,使分化和扩展中央记忆T细胞。
通过幼稚细胞的以下抗原识别发育编程产生效应和记忆T细胞。如果感染被控制到95%的过程中的膨胀阶段中产生的T细胞被消除( 即 ,收缩相位)和记忆T细胞保持,有时一生。在人类中,两个功能不同的记忆性T细胞的亚群基于淋巴结归巢受体的表达已被描述。中央记忆T细胞表达CC趋化因子受体7和CD45RO和主要位于次级淋巴器官的T细胞区域。效应记忆T细胞表达CD45RO,缺乏与淋巴细胞归巢相关的外设或发炎组织CCR7和显示受体。效应T细胞不表达任一CCR7或CD45RO但是当与抗原产生效应细胞因子,如干扰素γ相遇。干扰素γ释放分析被用于牛和人类结核的诊断和检测主要效应和效应记忆T细胞应答。由CD4 + T细胞接种中央记忆T细胞应答,在另一方面,可用于预测疫苗功效,其表现与猴免疫缺陷病毒感染的非人类灵长类动物,肺结核在小鼠和疟疾在人类。与小鼠和人类以及对牛未公布的数据的一些研究,已经表明,干扰素γELISPOT分析测量中央记忆T细胞应答。用该测定中,外周血单核细胞是在降低抗原浓度为10〜14天(长期培养物),从而允许执行器响应达到峰值,然后减弱培养;促进中央记忆T细胞分化和扩大文化中。
通过幼稚CD4 + T细胞的抗原识别后发育编程产生效应和记忆T细胞。幼稚的CD4 + T细胞分化成细胞因子产生细胞的分化,需要由先天免疫细胞,抗原呈递至T细胞,共刺激和产生偏振光的细胞因子产生的转录变化病原体识别。例如:抗原提呈细胞产生白细胞介素(IL)-12响应于细胞内的病原体,其中,连同抗原识别,通过信号转导和活化剂信令促进T细胞分化成T辅助细胞(Th1)细胞1,2-转录4(STAT4)和T-盒中的T细胞(T-bet的)表达,从而导致细胞活化,产生IL-2,克隆扩增和干扰素(IFN)-γ生产3,4-。如果感染被控制,高达95%的在膨胀阶段产生的T细胞被消除( 即 ,收缩相)和记忆性T细胞依然存在,有时一生5。 Sallusto 等人 6,揭示了两个功能不同的记忆性T细胞的亚群在人类基于淋巴结归巢受体的表达。中央记忆T细胞(TCM)表达CC趋化因子受体(CCR)-7和CD45RO和主要位于次级淋巴器官的T细胞区域。中医具有有限的效应子功能,低激活阈值和保持高的IL-2产生和增殖能力。效应记忆T细胞(TEM)表达CD45RO,缺乏CCR7和显示受体归巢到外设或发炎的组织。效应细胞不表达任何CCR7或CD45RO但及时产生效应细胞因子,如IFN-γ,在抗原识别。
IFN-γ释放测定(IGRA)用于牛和人7结核病的诊断。 分枝杆菌是牛结核病(BTB)的主要代理,而人类CA结核病SES,主要是由结核杆菌引起的。用这些试验中,全血或外周血单核细胞(PBMC)的刺激是通过ELISA或通过检测细胞生产使用ELISPOT技术的IFN-γ测定分枝杆菌抗原为16至24小时,将上清液内IFN-γ的生产。作为短暂刺激期的结果( 即 ,16至24小时),并快速的细胞因子生成, 离体测定法检测主要效应器和TEM响应。这已被证实通过细胞群中这些培养8-10流式细胞分析。
离体 IFN-γ的应答例行包括在结核病疫苗,包括那些用于评估由牛应答的免疫应答面板的评价。最有效的牛结核病疫苗诱导特异性IFN-γ的反应,而不是诱导IFN-γ应答所有的疫苗都protectiv即此外,IFN-γ通过接种疫苗引起,如感染前测定的水平,并不一定关联与保护。例如,不同的BCG菌株可以具有不同的能力,以诱导体外 IFN-γ应答,尽管类似的保护水平11。因此, 体外 IGRAs是结核病的诊断和疫苗的访问有价值的免疫原性;然而,它们作为疫苗功效的预测的使用是有限的。中医响应疫苗接种,在另一方面,可用于预测疫苗功效,如在非人灵长类12,13,结核小鼠14和疟疾在人类15,16证实猴免疫缺陷病毒(SIV)感染。
后导致病原体清除有效的免疫应答,TCM保持和用相同的试剂提供保护,以最终第二感染。一个值得注意的例外情况是M.肺结核 INFE人类ction其中接收治疗的抗分枝杆菌治疗的患者易受再感染17,18。此外,在慢性感染治免疫记忆的事件,其中所述抗原刺激仍然存在,都不能很好地理解19。在慢性感染,例如人类免疫缺陷病毒(HIV)和结核病,一个显著华健康响应与一个有利的结果( 例如 ,等待时间以结核病和亚临床疾病与HIV)20,21相关联。几项研究与小鼠和人已经表明,长期培养的IFN-γ的ELISPOT分析测量华健康响应16,20-22。用该测定中,外周血是在降低抗原为10至14天的浓度,使效应器响应达到峰值,然后减弱培养;促进华健康分化和扩大文化中。
长期培养的IFN-γ的ELISPOT分析也已在兽医使用研究,但应答细胞的表型已经难以评估由于缺乏关键的试剂,尤其是抗体对CCR7的。有效的牛结核病疫苗[ 如 。使用M的单剂量牛卡介苗(BCG),BCG其次是病毒抗原向量85A亚单位疫苗或减毒牛分枝杆菌 ΔRD1]引起接种后的长期培养的IFN-γELISPOT反应与保护的相关( 即更低的分枝杆菌负担和降低TB-相关的病理)对随后的挑战与毒力M.牛 23,24。此外,抗原特异性IFN-γ分泌细胞的长期PBMC培养物中的数字是在12个月高,但减少在新生儿小牛接种卡介苗后24个月内,以保护检测交分枝程度相关牛挑战25。在这种情况下,将培养的IFN-γELISPOT是一个预测疫苗的有效性,提供优先候选疫苗的成本高,药效试验一指N重要工具。此外,培养的ELISPOT技术可以通过改变抗原或抗体为多种目的在不同的研究领域适于各种宿主,病原体和细胞因子。
IFN-γ的生产中的长期培养的ELISPOT分析一般是由于华健康在人类中,但这种反应在培养如何发展却知之甚少。是否华健康存在于循环和扩大在体外 ,或者如果来自分化的效应和TEM细胞进入医药文化期间华健康反应导致不得而知。然而,随着从人类样本的研究发现,从体外和长期培养的IFN-γ的ELISPOT分析CD4 + T细胞具有无关表位特异性,这意味着华健康响应不脱离效应细胞28发展。显然,响应的持续时间可以改变,但是如果病原体间隙来实现,最终都离体和TCM响应下降。此外,长期培养物的反应抗原引发后早期和长期测量(当效应器响应是低级)被示出为相关,这表明抗后早期和长循环华健康种群基因启动保持体内相关。在另一方面,在体外反应的程度似乎没有进行相关的记忆应答29的幅度。这些结果表明,长期培养的IFN-γELISPOT反应从体外扩增医药和效应响应的样品中的相关联的减弱,而不是效应细胞分化成华健康表型结果。
与牛,效应物和存储器的子集,以响应由长期的IFN-γELISPOT分析检测的相对贡献是未知的。最近的研究表明疫苗之间的相关性引起的长期培养的IFN-γ的ELISPOT反应和保护,防止随后的实验感染分枝牛 23-24。据报道,弱长期IFN-γ的ELISPOT反应接种与没有保护30的关联。无论生活和杀ED疫苗诱发类似的体外 IFN-γELISPOT反应,但接种卡介苗活强引起的长期培养的IFN-γ酶联免疫斑点比灭活疫苗制剂反应。有趣的是,活疫苗是保护而被杀的配方不能提供保护,防止挑战,有毒结核分枝杆菌31-32,33。
华健康反应的评估也是由PBMC整理这些细胞是可行的。华健康从PBMC直接富集,但是,需要昂贵的设备,训练有素的个人,是困难的,因为这些细胞不大量在血流中。 PBMC的长期培养提供中医富集在TEM和效应细胞,无需昂贵的设备;然而,因为这些T细胞群在体外扩展它们可以在体内记忆应答的代表以下。它可以访问的IFN-γ记忆应答(使用长期培养或TCM排序荷兰国际集团的策略)通过分析比ELISPOT其他如:细胞因子ELISA中34,细胞因子珠子阵列(CBA),细胞内染色(ICS),或细胞因子蛋白质阵列(CPA)。这些方法;然而,一般都是较不敏感的比ELISPOT分析35。
ELISPOT的一个优点是它的后不久其释放防止稀释在上清液和降解通过酶裂解或细胞因子的摄取通过其它细胞,以检测细胞因子的直接捕获能力。酶联免疫斑点试验检测单个细胞的细胞因子生产提供精确的结果,即使在低信噪比的情况下( 即低特异性应答)35。另外,使用ICS,检测释放前的细胞因子,可能会导致细胞产生细胞因子的误识别( 例如 ,由于之前或期间分泌过程翻译后调制)34。使用ICS测定以最小化细胞因子的分泌所用的转运抑制剂在抗原刺激(称为高尔基停止蛋白质)限制细胞刺激的持续时间,由于这些蛋白质最终影响细胞因子的产生器35的细胞毒性。
随着中说- CBA,CPA和ICS是用于同时测量多种细胞因子和/或用于确定细胞表面标记的表达有用的技术( 即 ,使用ICS)。因此,这些方法可结合使用的IFN-γELISPOT测定36。虽然以前的牛结核病疫苗的有效性研究通过酶联免疫斑点法检测华健康响应,TCM反应通过其他技术检测可能会产生类似的结果。重要的是,酶联免疫斑点法是更便宜,更简单的CBA相比,CPA和ICS分析技术34来执行。 SFC的人工计数是替代自动计数,和ELISPOT板可以存储在RT长时间持续具有最小质量损失,之前或现货℃后ounting 37。
长期培养的IFN-γ的ELISPOT反应已应用于评估结核疫苗的反应时,以评估人的记忆应答,和牛14-16,31-32,33。中医响应也假定为在宿主发挥响应显著角色牛几个其它感染剂,如: 丝状支原体亚种丝状 42, 无形体 38和牛呼吸道合胞病毒39。潜在地,长期ELISPOT测定可以适于对其他动物物种,细胞因子和感染。这些更广泛的应用将是兽医免疫学应用特别有用由于目前有限的特定试剂的可用性。
中医的反应是防止感染的几个关键的,但感染/免疫接种后的早期测量它们(疾病结果的预测或疫苗的有效性)马y为繁琐。下离体和短抗原刺激条件的免疫应答的分析会更经常代表效应的反应,由于记忆和效应的响应的重叠,特别是在免疫学记忆形成的开始。在慢性疾病的情况下,其中的抗原负载是持续, 离体的反应将评估效应器细胞应答或记忆和效应细胞应答的组合。长期培养的IFN-γELISPOT测定,这里描述的,有可能使华健康响应而不是效应T细胞或组合的CD4 + T细胞应答的测定。总之,长期培养的IFN-γELISPOT试验提供了一个有价值的方法,用于估计的T细胞记忆应答,并已采用成功评估几个物种的存储器响应于各种感染剂12-16,20-25,29 ,31,33,34,38,39。
The authors have nothing to disclose.
3625-32000-104农业和食品研究计划竞争性赠款号:研究是由美国农业部ARS克里斯支持。 2011-67015-30736来自粮食和农业的美国农业部研 究所。我们感谢杰西卡·波洛克,艾玛Frimml -摩根,雪莱齐默尔曼,克里斯汀低音,布鲁斯·佩施,莫莉Stafne,艾伦詹森和特雷西·波特的出色的技术援助以及丽贝卡麦迪逊,道格·尤因,凯蒂Pille先生,周杰伦斯特芬,大卫·吕贝尔斯,罗宾Zeisness,和大卫Panthen动物的良好的护理和处理。
Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
Citric acid (monohydrate) | Various | ||
Dextrose | Various | ||
ELISPOT PVDF plate | Various | ||
Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |