Långsiktig odlade interferon-γ enzymkopplad immunospot analys används som ett mått på central minnessvar och korrelerar med skyddande anti-mykobakteriella vaccinsvar. Med denna analys är perifera mononukleära blodceller stimulerades med mykobakteriella antigener och interleukin-2 i 14 dagar, vilket möjliggör differentiering och expansion av central minnes-T-celler.
Effektorceller och minnes-T-celler genereras genom utvecklings programmering av naiva celler efter antigenigenkänning. Om infektionen kontrolleras upp till 95% av T-cellerna som genereras under expansionsfasen elimineras (dvs.., Kontraktion fas) och minnes-T-celler kvarstår, ibland för en livstid. Hos människor har två funktionellt distinkta undergrupper av minnes-T-celler har beskrivits baserat på uttrycket av lymfkörtelmålsökande receptorer. Central minnes T-celler uttrycker CC kemokinreceptor 7 och CD45RO och finns främst i T-cellområden av sekundära lymfoidorgan. Effector minnes T-celler uttrycker CD45RO saknar CCR7 och visa receptorer som är förknippade med lymfocytmålsökande till perifera eller inflammerade vävnader. Effektor-T-celler uttrycker inte heller CCR7 eller CD45RO men vid möte med antigen producerar effektorceller cytokiner, såsom interferon-γ. Interferon-γ frisättningsanalyser används för diagnos av bovint och humant tuberkulos ochupptäcka främst effektor och effektor minne T-cellsvar. Centrala minnes-T-cellsvar från CD4 + T-celler på vaccination, å andra sidan, kan användas för att förutsäga vaccineffektivitet, såsom demonstreras med simian immunbristvirus-infektion av icke-mänskliga primater, tuberkulos i möss, och malaria hos människor. Flera studier med möss och människor samt opublicerade data om boskap, har visat att interferon-γ ELISPOT-analyser mäter centrala minnes-T-cellsvar. Med denna analys, perifera mononukleära blodceller odlas i minskande koncentration av antigen för 10 till 14 dagar (långtidsodling), vilket gör att effektorceller svar på topp och avta; lätta centrala minnes-T-celler att differentiera och expandera inom kulturen.
Effektor och minnes-T-celler genereras genom utvecklings programmering av naiva CD4 + -T-celler efter antigenigenkänning. Differentieringen av naiva CD4 + T-celler i cytokin producerande celler kräver patogen erkännande av medfödda immunceller, antigen presentation till T-celler, co-stimulering och transkriptions förändringar som resulterar i polariserat cytokinproduktion. Till exempel: antigenpresenterande celler producerar interleukin (IL) -12 som svar på intracellulära patogener, som tillsammans med antigenigenkänning, främjar differentiering av T-celler i T-hjälpar 1 (Th1) -celler 1,2 genom signalering genom signalomvandlare och aktivator av transkription 4 (STAT4) och T-box-uttrycks i T-celler (T-bet), vilket leder till cellaktivering, IL-2 produktion, klonal expansion och interferon (IFN) -γ produktion 3,4. Om infektionen är under kontroll, är upp till 95% av T-cellerna som genereras under expansionsfasen elimineras (dvs sammandragningfas) och minnes-T-celler kvar, ibland för en livstid 5. Sallusto et al., 6, avslöjade två funktionellt distinkta undergrupper av minnes-T-celler i människor baserat på uttrycket av lymfkörtelmålsökande receptorer. Centrala minnes-T-celler (TCM) uttrycker CC kemokinreceptor (CCR) -7 och CD45RO och finns främst i T-cellområden av sekundära lymfoidorgan. Tcm har begränsad effektorfunktion, en tröskel lågaktiva och bibehålla hög IL-2-produktion och fortplantningsförmågan. Effector minnes-T-celler (TEM) uttrycker CD45RO saknar CCR7 och visa receptorer för målsökande till perifera eller inflammerade vävnader. Effektorceller uttrycker inte antingen CCR7 eller CD45RO men snabbt producera effektor cytokiner, såsom IFN-γ, vid antigenigenkänning.
IFN-γ frisättningsanalyser (Igra) används för diagnos av bovin och human tuberkulos 7. Mycobacterium bovis är det huvudsakliga medlet av bovin tuberkulos (BTB) medan mänsklig caSES av tuberkulos orsakas huvudsakligen av Mycobacterium tuberculosis. Med dessa tester, helblod eller perifera blodmononukleära celler (PBMC) stimuleras med mykobakteriella antigener för 16 till 24 timmar och IFN-γ tillverkning i den överstående vätskan mäts genom ELISA eller genom detektion av celler som producerar IFN-γ användning ELISPOT-tekniker. Som ett resultat av den korta stimuleringsperioden (dvs.., 16 till 24 timmar) och snabb produktion cytokin, ex vivo-analyser detekterar primärt effektor och Tem responser. Detta har bekräftats genom flödescytometrisk analys av cellpopulationer i dessa kulturer 8-10.
Ex vivo IFN-γ svar rutinmässigt ingår i immunsvaret panelen utvärdering av vacciner tuberkulos, inklusive de som används för att utvärdera svaren från nötkreatur. Mest effektiva vacciner bovin tuberkulos framkallar specifika IFN-γ svar, men inte alla vacciner som inducerar IFN-γ svar är Skyddse. Även halterna av IFN-γ framkallad genom vaccination, mätt före infektion, inte nödvändigtvis korrelerar med skydd. Till exempel kan olika BCG-stammar har olika förmåga att framkalla ex vivo IFN-γ svar, trots liknande skyddsnivåer 11. Således, ex vivo Igras är värdefulla för diagnos tuberkulos och för att komma åt vaccin immunogenicitet; emellertid, är begränsad deras användning som prediktorer för vaccineffekt. Tcm svar på vaccination, å andra sidan, kan användas för att förutsäga vaccineffekt, vilket framgår med simian immunbristvirus (SIV) hos icke-mänskliga primater 12,13, tuberkulos hos möss 14 och malaria hos människor 15,16.
Efter ett effektivt immunsvar resulterar i patogen clearance är Tcm underhålls och ge skydd till en eventuell andra infektion av samma agent. Ett anmärkningsvärt undantag till detta scenario är M. infe tuberkulosInsatser av människor där patienter som fick kurativ antimykobakteriell terapi är mottagliga för återinfektion 17,18. Dessutom, händelser som reglerar immunologiskt minne under kroniska infektioner, där den antigenstimulering kvarstår, är inte väl förstådda 19. Under kroniska infektioner, såsom med humant immunbristvirus (hiv) och tuberkulos är en betydande Tcm svar i samband med ett positivt resultat (t.ex. latens med tuberkulos och subklinisk sjukdom med HIV) 20,21. Flera studier med möss och människor har visat att långtids odlade IFN-γ ELISPOT-analyser mäter Tcm svar 16,20-22. Med denna analys, PBMC odlas i minskande koncentration av antigen för 10 till 14 dagar, vilket effektorceller svar på topp och avta; lätta Tcm att differentiera och expandera inom kulturen.
Långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analyser har också använts inom veterinär-forskning, men fenotypen svarande celler har varit svårt att bedöma på grund av bristande kritiska reagenser, speciellt en antikropp mot CCR7. Effektiva vacciner bovin tuberkulos [t.ex.. med användning av en enda dos av M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG, följt av virusvektor antigen 85A subenhetsvaccin eller försvagade M. bovis ΔRD1] framkalla långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar efter vaccination som korrelerar med skydd (dvs lägre mykobakteriellt börda och minskade TB-associerad patologi) mot efterföljande utmaning med virulent M. bovis 23,24. Dessutom, antalet antigenspecifika IFN-γ-celler som utsöndrar inom långtids PBMC kulturer är högre vid 12 månader, men minska på 24 månader efter BCG-vaccination av nyfödda kalvar, korrelera med graden av skydd detekterbara inlägget M. bovis utmaning 25. I detta scenario är den odlade IFN-γ ELISPOT enn viktigt verktyg för att förutsäga vaccineffekt, vilket ger en möjlighet att prioritera vaccinkandidater för höga kostnader effektivitetsstudierna. Dessutom kan odlade ELISPOT tekniker anpassas för olika värdar, patogener och cytokiner genom att förändra antigener eller antikroppar för en mängd olika ändamål i olika forskningsområden.
IFN-γ produktion i långsiktiga odlade ELISPOT-analyser är i allmänhet på Tcm hos människa, men hur detta svar utvecklas i kultur är dåligt förstådd. Huruvida Tcm är närvarande i cirkulationen och expandera in vitro, eller om Tcm responser resulterar från differentiering av effektor och Tem celler till Tcm under odling är inte känd. Samtidigt har studier med prover från människa funnit att CD4 + T-celler från ex vivo och långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analyser har orelaterade epitopspecificiteter, vilket innebär att Tcm responser inte utvecklas från effektorceller 28. Uppenbarligen kan varaktigheten av svaret varierar, men om patogen clearance uppnås, så småningom både ex vivo och Tcm responser minska. Även svaren från långsiktiga kulturer mätt tidigt och långt efter antigen priming (när effektor svar är lägre) har visat sig korrelera, vilket tyder på att cirkulerande Tcm populationer tidigt och långt efter antiframkallande priming är kopplat in vivo. Å andra sidan, inte storleken på ex vivo svar inte verkar vara relaterade till storleken på minnessvar 29. Dessa resultat tyder på att långtids odlade IFN-γ ELISPOT responser resulterar från in vitro-expansion av TCM och en tillhörande avtagande av effektorceller responser i provet, i stället för differentieringen av effektorceller i Tcm fenotyp.
Med nötkreatur, är den relativa betydelsen av effektorceller och minnesgrupper till svar detekteras av de långsiktiga IFN-γ ELISPOT-analyser inte känd. Nyligen genomförda studier tyder på ett samband mellan vaccin framkallade långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar och skydd mot efterföljande experimentell infektion med M. bovis 23-24. Det har rapporterats att svaga långsiktiga IFN-γ ELISPOT svaret på vaccination är associerade med avsaknaden av skydd 30. Både levande och dödaed vacciner inducerar liknande ex vivo IFN-γ ELISPOT svar, men vaccination med levande BCG framkallar starkare långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar än gör dödade vaccinpreparat. Intressant, levande vacciner är skydds medan dödade formuleringar inte att ge skydd mot utmaning med virulent tuberkelmykobakterier 31-32, 33.
Bedömning av Tcm svar är också möjligt genom att sortera dessa celler från PBMC. Direkt anrikning av Tcm från PBMC, kräver emellertid dyra anordningar, välutbildade personlig och är svår eftersom dessa celler inte är talrika i blodomloppet. Långsiktig kultur av PBMC ger anrikning av Tcm över Tem och effektorceller utan dyra enheter; men eftersom dessa T-cellspopulationer expanderas in vitro de kan vara mindre representativ för in vivo svar minnes. Det är möjligt att få tillgång till IFN-γ minnessvar (med hjälp av långtidsodling eller Tcm sorteraing strategier) från andra källor än ELISPOT-analyser såsom: cytokin ELISA 34, cytokin pärla arrayer (CBA), intracellulär färgning (ICS), eller cytokin proteinchip (CPA). Dessa metoder; dock, är i allmänhet mindre känsliga än ELISPOT-analyser 35.
En fördel med ELISPOT är dess förmåga att detektera omedelbar infångning av cytokinet kort efter dess frigöring förhindra utspädning i supernatanten och nedbrytning genom enzymatisk klyvning eller cytokin upptagning av andra celler. ELISPOT-analyser detekterar enstaka celler som producerar cytokiner som ger exakta resultat även i svagt signal till brus scenarier (dvs låga specifika svar) 35. Också med ICS, kan detektion av cytokiner kända att frisätta resultera i falsk identifiering av celler som producerar cytokiner (t ex., På grund av posttranslationell module före eller under den sekretoriska processen) 34. Inhibitorema transport anställda med ICS analyser för att minimera cytokinutsöndringunder antigenstimulering (sk Golgi stopp proteiner) begränsa giltighetstiden för cellstimulering på grund av celltoxicitet av dessa proteiner i slutändan påverkar cytokinproduktion 35.
Med detta sagt – CBA, CPA och ICS är användbara tekniker för att mäta flera cytokiner samtidigt och / eller för att bestämma cellytmarkör uttryck (dvs med ICS.). Därför kan dessa metoder användas i kombination med IFN-γ ELISPOT-analys 36. Medan tidigare bovint TB-vaccin effektstudier mätt Tcm svar via ELISPOT analys kommer att upptäcka Tcm svar av andra tekniker sannolikt ge jämförbara resultat. Viktigt är ELISPOT-assay billigare och enklare att utföra än CBA, CPA och ICS analystekniker 34. Manuell räkning av SFC är ett alternativ till automatisk räkning, och ELISPOT-plattor kan lagras vid rumstemperatur under lång tidsperiod med minimal kvalitetsförlust, före eller efter punkt counting 37.
Den långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT svar har tillämpats för att bedöma minnes svar av människor, och boskap vid utvärdering tuberkulosvaccin svar 14-16,31-32,33. Tcm svar antas också spela viktiga roller i värd svar på flera andra smittämnen av nötkreatur, såsom:. Mycoplasma mycoides underart mycoides 42, Anaplasma marginale 38 och bovint respiratoriskt syncytialvirus 39. Potentiellt kan det långsiktiga ELISPOT-analys anpassas för andra djurarter, cytokiner och infektioner. Dessa bredare program kommer att vara särskilt användbart för veterinärmedicinska immunologiska tillämpningar på grund av nuvarande begränsade tillgången av specifika reagens.
Tcm svar är avgörande för att skydda mot flera infektioner, men att mäta dem tidigt efter infektion / immunisering (för sjukdom resultatet förutsägelse eller vaccineffekt) may vara besvärligt. Analys av immunsvaret enligt ex vivo och korta antigenstimulering förhållandena kommer oftare representerar effektor svar, på grund av överlappningen av minnes- och effektor svar, särskilt under inledningen av immunologiskt minne bildning. I samband med kroniska sjukdomar i vilka antigenbelastningen är kontinuerlig, kommer ex vivo responser bedöma effektor-cellsvar eller en kombination av minnes- och effektor-cellsvar. Det långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analys, som beskrivs här, sannolikt möjliggör mätningen av Tcm svar snarare än effektor T-cell eller kombinerade cellsvar CD4 + T. Sammanfattningsvis tillhandahåller den långsiktiga odlade IFN-γ ELISPOT-analys en värdefull metod för att uppskatta T-cellminnessvar och har använts framgångsrikt för att utvärdera minnes svar hos flera arter till en mängd olika infektioner medel 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen stöddes av USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 och jordbruks- och livsmedels Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant nr. 2011-67015-30736 från USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi tackar Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, och Tracy Porter för deras utmärkta tekniskt bistånd samt Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers Robin Zeisness, och David Panthen för utmärkt vård och hantering av djur.
Sodium citrate (dihydrate) | Various | ||
Citric acid (monohydrate) | Various | ||
Dextrose | Various | ||
ELISPOT PVDF plate | Various | ||
Vectastain ABC – AP KIT Standard | Vector Laboratories | AK-5000 | |
Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5300 | |
Ag85A | Lionex | LRP-0004.3 | 23, 24, 25, 37 |
TB 10.4 | Lionex | LRP-0061.6 | 23, 24, 25, 37 |
PPDb | Prionics AG | 7600055 | |
rESAT-6:CFP10 | Kind gift Dr. Minion, Iastate | 23, 24, 25, 27, 37 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ Clone CC302 | Serotec | MCA1783B | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine IFN-γ Biotinylated Clone CC330 | Serotec | MCA2112 | 23, 24, 25, 27, 37 |
Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8 | Serotec | MCA1653GA | |
Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A | Serotec | MCA2434GA | |
Rat anti-human CCR7 Clone 3D12 | Abcam | ab95665 | |
Mouse anti-bovine IFN-γ-Pe Clone CC302 | Serotec | MCA1783PE | |
Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350 | Invitrogen | A-21130 | |
Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7 | SouthernBiotechnology | 1080-193 | |
Goat anti-rat IgG-APC | Invitrogen | A10540 | |
BD Cytofix/Cytoperm™ | BD Biosciences | 554714 | |
BrefeldinA | Sigma-Aldrich | B7651 | |
Pokeweed Mitogen | Sigma-Aldrich | L8777 | |
Recombinat human Interleukin 2 | Sigma-Aldrich | I7908 |