Introduction
הכליות לשמור על איזון homeostatic לחומרים שונים ולהסדיר את נפח דם באופן שקובע כולל לחץ דם. הפרעות בסינון הכלייתי, הספיגה או להוביל להפרשה או מצבים פתולוגיים מלווים, החל יתר או תת לחץ דם בסופו מחלת כליות בשלב שסופו של דבר דורשת השתלת כליה. יחידת כליות הסינון (glomerulus) מורכבת משלוש שכבות - האנדותל הנימים, קרום במרתף ושכבת תא בודד של תאי אפיתל - podocytes, אשר ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות החריץ-סרעפת והפונקציה 1. חוסר תפקוד במסנן גלומרולרי permselective גורם לאובדן שתן של מקרומולקולות, כגון חלבון. סוכנים שונים עשויים להשפיע על המבנה של podocytes ותהליכי רגלם, הקובע את שלמות מחסום סינון glomeruli.
Podocytes מעורב בתחזוקה של הגנב שפונקצית סינון eruli. זה כבר נקבע כי טיפול סידן נאותה podocyte מוביל לפציעת תא וממלא תפקיד חשוב בהתקדמות של צורות שונות של nephropathies 2,3. לכן, פיתוח של מודל המאפשר למדידה ישירה של שינויי ריכוז סידן תוך תאי יהיה אינסטרומנטלי ללימודים של פונקצית podocyte. glomeruli המבודדת שימשה בעבר במחקרים רבים, כולל מדידה של מקדם השתקפות אלבומין משנה 4 והערכה של זרמים סלולריים נפרד במדידות תיקון מהדק אלקטרו כל תא 5,6. בעבודה הנוכחית אנו מתארים את הפרוטוקול שמאפשר לחוקר למדוד תאיים שינויי ריכוז סידן בתגובה לבקשות של סוכנים תרופתיים, להעריך את הרמות בסיסיות של סידן בתוך התאים, ולהעריך את פעילות ערוצי סידן בודדת. מדידות ריכוז סידן Ratometric וelectrop תיקון מהדקhysiology שימש לקביעת שינויים בריכוז סידן תוך תאי במסגרת פעילות podocyte והערוץ, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שימוש בבעלי חיים ולרווחתם צריך לדבוק במדריך NIH לטיפול ושימוש בחי המעבדה הבא פרוטוקולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC).
פלאש 1. הכליות
- השתמש עכברוש 8 עד 12 בשבוע ישן זכר (הציע הוא זן ספראג Dawley, אולם זנים אחרים של גיל ומין שונים ניתן להשתמש עם שינויים מתאימים).
- להרדים את החיה על פי הנוהל מתיר פרוטוקול IACUC; לפקח עומק ההרדמה ולבדוק את בעלי החיים. התיאור מפורט של הניתוח שיבוצע ב1.3 - ניתן למצוא 1.8 בet al Ilatovskaya 7.
- לאחר הרדמה נכונה, למקם את החיה על שולחן ניתוחים בטמפרטורה מבוקרת, לעשות (עד 3 אינץ 'באורך) חתך קו האמצע של הבטן, ולחשוף את הווריד הנבוב ואב העורקים.
- הכנס מייתר סביב עורקי צליאק וmesenteric מעולה והבטןאב העורקים מעל אלה; לא לקשור.
- בוטה לנתח אב העורקים בבטן מתחת לעורקי הכליה, ומניח את שני חיבורים אותיות סביבו, אבל לא לקשור, אז מהדק את אב העורקים מעל חיבורי האותיות ולקשור את החוט התחתון.
- קטטר אב העורקים עם צינורות פוליאתילן PE50 (המצורפים למשאבת מזרק מלאה PBS) מתחת למהדק ולתקן את הקטטר עם המייתר השני; להסיר את המהדק, להפעיל את המשאבה, ולקשור את אב העורקים ועורקי mesenteric עם צליאק. במהירות לעשות חתך בעורק כליה כדי להקל את הלחץ.
- להשרות את אב העורקים עם PBS-מקורר מראש עבור 2 או 3 דקות בקצב של 6 מיליליטר / דקה.
- עצור זלוף, בלו וdecapsulate 7 הכליות, ולשים אותם על קרח בפתרון PBS. להרדים את החיה על פי פרוטוקול שאושר על ידי IACUC.
2. בידוד של glomeruli העכברוש
- הכן 30 מיליליטר של תמיסה טריות של BSA 5% בRPMI 1640.
- באמצעות סכין גילוח ומספריים,לבודד את הקליפה של שני הכליות, ולאחר מכן ברר עד הומוגנית. הליך זה כבר תואר קודם לכן 7.
- לדחוף את הרקמה טחונות בשלב הקודם דרך מסננת נירוסטה 100 רשת (ספוג מראש ב 5% BSA / פתרון RPMI) בעזרת מרית. לאסוף את הזרימה דרך בכוח הכבידה לאפשר הזרימה דרך לעבור דרך מסננת 140 רשת.
- סנן את הזרימה דרך נאסף מהרשת 140 מסננת באמצעות מסננת רשת מראש ספוג 200, לבטל את התסנין, ולשטוף את החלק העליון של המסננת עם 10 - 15 מיליליטר של פתרון BSA / RPMI מוכן לאסוף glomeruli שהמשקעת ב המסננת.
- שים את פתרון BSA / RPMI המכיל glomeruli על קרח בצינור 15 מ"ל ולתת משקעי glomeruli בחלק התחתון של הצינור עד 20 דקות. תרכיז glomeruli בחלק התחתון של הצינור יהיה לראות בבירור. הסר את הפתרון העודף, עוזב כ 2 מיליליטר בצינור.
3. ערוץ יחיד תיקון מהדק אלectrophysiology
- הכן שבבי זכוכית כיסוי 5 X 5 מ"מ על ידי ציפוי אותם עם MW 70,000 - 150,000 פולי-ʟ ליזין, ולתת יבש. השתמש כ -30 μl של פתרון מסונן סטרילי 0.01% במים לכיסוי זכוכית.
- לחמם את הפתרונות הניסיוניים לRT ולמלא את תא תיקון- clamp ופיפטה. לניטור ערוצי TRPC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ"מ: 126 NaCl, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 10 גלוקוז, pH 7.4; פיפטה: 126 NaCl, 1.5 CaCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז; pH 7.4.
- להוסיף מעכבים לפתרון פיפטה לחסום את הפעילות של ערוצי אנדוגני, שאינם רלוונטיים ללימודים (המומלצים הם: חומצת niflumic 100 מיקרומטר או DIDS (לחסום Ca 2 + Cl -activated - ערוצים), 10 מ"מ TEA (לעכב גדולות-מוליכות 2 Ca + - K התלוי + ערוץ), 10 iberiotoxin ננומטר (לחסום את Ca 2 + K + ערוצי -activated), 10 מיקרומטר nicardipine (לחסום N-סוג Ca2 + ערוצים)) ישירות לפני ניסוי תיקון מהדק.
- לערבב בעדינות הפתרון המכיל glomeruli, ולאחר מכן להחיל כ -50 μl שלו לשבבי זכוכית הכיסוי מצופה פולי-ʟ ליזין. בואו glomeruli לצרף לכ 5 דקות.
- הזז את שבבי זכוכית עם glomeruli לתא תיקון- clamp מראש מלא בפתרון האמבטיה; perfuse קאמרי בשיעור של 3 מיליליטר / דקה 1 דקות כדי להבטיח את הסרת glomeruli הפנוייה.
- לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 7-מצורף תא. עם טפטפת זכוכית (7-10 התנגדות פיפטה MΩ) ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום podocyte ידי החלת שאיבה עדינה (פיפטה המצורפת לpodocyte על פני השטח של glomerulus המבודד מוצג באיור 2, ב משמאל).
- למדידות מצורפים תא, נמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל.
- Use מבודד glomeruli בניסויי תיקון מהדק עד 4 - 6 שעות. שמור את חלק glomeruli המניות על קרח.
4. מדידות ratiometric Confocal הקרינה של ריכוז סידן תוך תאים בPodocytes
- הנח 500 μl של חלק glomeruli (שתואר על 2.5) 0.5 מיליליטר בצינור חרוטי ולהוסיף צבעי סידן פורעה אדום, בבוקר וFluo-4, בבוקר. השתמש 2 מ"מ ו 1 ריכוזי מניית מ"מ של פורעה האדום, בבוקר וFluo-4, בבוקר, בהתאמה (חנות ב -20 ° C, מומס DMSO) ולהשתמש 2.5 μl של כל צבע לμl 500 של חלק glomeruli. מייד לאחר תוספת של הצבעים לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום.
- מקום צינורות על שייקר מסתובב לפחות 20 דקות עד שעה 1 בRT.
הערה: ניתן להוסיף סוכנים תרופתי במהלך שלב זה. - הכן coverslips זכוכית, לכסות אותם עם פולי-ליזין ʟ ולאפשר ייבוש באמצעות סט צלחת מחומם ל -70 מעלות צלזיוס.
- ברגע שהטעינה של צבעי סידן היא completדואר, יחול של glomeruli מכילה פתרון לcoverslips המצופה פולי-ליזין 100 ʟ μl ולתת להם להיצמד למשטח לכ -5 דקות. הר coverslips המצורף glomeruli לחדר הדמיה, ותנקב עם פתרון האמבטיה (המכיל (במ"מ): 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, pH 7.35) בשיעור של 3 מיליליטר / דקה להסרת glomeruli הפנוייה והצבעים שנותרו.
- הגדר את המיקרוסקופ סריקת לייזר confocal לגל עירור 488 ננומטר ומסנני פליטה (525/25 וננומטר 650/25 לFluo-4 ופורע אדום, בהתאמה). הגדר את תוכנת הדמיה לתדר ורזולוציה רצויים.
- מצא glomeruli בbrightfield ולאחר מכן הפעל את זיהוי של אותות הקרינה. התאם את עוצמת הלייזר לכל צבע כדי למנוע הרוויה של האות. בחר את מישור המוקד עם podocytes שישירות מחוברים לזכוכית. זה ממזער את ההשפעה נגרמת על ידי התכווצות של glomerulus בתגובה לתרופהיישום. פעמיים לבדוק שglomerulus של בחירה מצורף גם לזכוכית;
- התחל הדמיה מישור המוקד של בחירה (לקחת 512 x 512 תמונות עם התדירות שנקבעה ב 4 שניות לדמיין Ca 2 + שינויים מהירים חולפים. השתמש 60x / עדשה אובייקטיבית דומה NA 1.4 או לתמונה ברזולוציה גבוהה), תחול תרופות של עניין, ולהקליט את התגובה.
- בחר מטוס מוקד רצוי (קרוב למשטח של הזכוכית ככל האפשר, כדי להבטיח הדמיה של podocytes על פני השטח של glomerulus). בדוק את עוצמת הקרינה על Fluo4 וערוצי FuraRed, ולוודא כי glomerulus נראה בbrightfield ברור.
- התחל הדמיה. לפני היישום של כל תרופות, שיא לפחות 1 דקות של הקרינה בסיס לוודא כי האות היא יציבה (אין קוצים פתאומיים או דהייה של האות).
- החל תרופות הרצויות בעזרת micropipette; להיות זהיר ולוודא את התרופה הצליחה לפזר היטב ולהגיע לglomerUlus. מערבבים את פתרון האמבטיה בעדינות אם יש צורך, לפקח על מישור המוקד הנבחר ולבדוק שזה לא זז מחוץ לפוקוס בגלל יישום הסמים.
- רשום את השינויים בעוצמת הקרינה לאותות Fluo4 וFuraRed. ודא ההקלטה היא מספיק זמן, על ידי מחכה עד האות מגיעה לרמת הרמה או מגיעה לשיא ואז חוזרת לנקודת התחלה. לבצע שינוי פתרון או תוספת של כל תרופות אחרות במידת הצורך.
- לעצור את ההקלטה, ולשמור את הקובץ בתבנית המקורית של התוכנה.
ניתוח תמונה 5. למדידות סידן
- לבצע ניתוח תמונה עם התוכנה הפתוחה ImageJ מצויד בתוסף שירות ND המאפשר יבוא תמונות בפורמט ND2 הילידים.
- לייבא את התמונה ברצף; לוודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack.
- עקוב → כלים → נתיב מנהל ROI לנתח בתוכנת ImageJ לoעט חלון מנהל החזר על השקעה. בחר כמה אזורים של העניין (podocytes) באמצעות כלי בחירה סגלגלים ו" הוסף (t) "הפונקציה במנהל ההחזר על ההשקעה. כהחזר על ההשקעה האחרונה, בחר את האזור ברקע; להציל את ROIs נבחר (עוד → שמור).
- סמן את החלון המכיל את הערוץ שנבחר לניתוח. השתמש עוד → פונקצית מדידה רב במנהל את ההחזר על ההשקעה, סמן את התיבה "שורה אחת לכל פרוסה" בדיאלוג שקופץ החוצה, ולאחר מכן לחץ על אישור. התוצאות יוצגו בפורמט שניתן להגדיר בחלון התוצאות: להיכנס לתוצאות אפשרות תפריט → מדידות, בחר "Mean ערך אפור" ולחשב את ערכי עוצמה עבור כל פיקסל את ההחזר על ההשקעה, אשר יוצג ב חלון תוצאות בעמודות נפרדות לכל החזר על השקעה.
- העתק את ערכי עצמת ROI נמדדו עבור כל ערוץ (Fluo-4 ופורע אדום) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לגרוע מכל DATנקודה.
- עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של Fluo-4 לערוצי פורעה אדומים. פיזור עלילה / קו שינויים של חולף Ca 2 + לכל החזר על השקעה נקודה-זמן. חישוב ממוצע ערכים / SE לglomeruli נבחרה.
הערה: טור זמן צריך להיות מוגדר על פי תדירות הדמיה נבחרה על 4.5.
6. חישובי ריכוז סידן תוך תאים באמצעות Fluo-4 פלואורסצנטי איתותים
- קח דוגמא של glomeruli ולבצע את פרוטוקול הניסוי עד שלב 4.7. לאחר ההקלטה של הקרינה הרקע להוסיף ionomycin (ריכוז סופי בתא האמבטיה צריך להיות 10 מיקרומטר) לפתרון האמבטיה, ועליית עוצמת הקרינה שיא. ברגע שמגיעה למקסימום העצמה שלה והריקבון מתחיל, להוסיף MnCl 2 (ריכוז סופי צריך להיות 5 מ"מ) כדי להרוות את הקרינה 8.
- לנתח את הנתונים שהתקבלו ב6.1. העתק את Fluo-4 ערכי עוצמת אות ROI מתקבלים לפילפרוטוקול המתואר ב5.1-5.5 על ידי תוכנת ניתוח מועדפת.
- חישוב ריכוז סידן תוך תאי (בננומטר) בpodocyte המתאים להחזר על ההשקעה באמצעות נוסחא:
שם ד K הוא ניתוק שנקבע מראש קבוע לFluo-4 (345 ננומטר), F הוא העצמה בנקודה הזמן שאתה חישוב ריכוז סידן ל( בסיס), ודקות F ו- F מקסימום הם ערכי העצמה ב נקודת העומס מרבי סידן (לאחר יישום ionomycin) ואחרי מרווה של הקרינה (עם MnCl 2), בהתאמה (ראה איור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו התייחסנו לבעיה של מדידת שינויים חריפים ברמות סידן בpodocytes. איור 1 מראה ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי תוכנן על מנת לבצע הדמיה confocal הקרינה חי ברזולוציה גבוהה והקלטות פעילות ערוץ יון אחד בpodocytes של טרי glomeruli מכרסם מבודדת. בקצרה, לאחר החולדה מורדמת, צריכים להיות סמוקות הכליות עם PBS כדי לנקות אותם מדם. לאחר מכן, הכליות הם נכרת וdecapsulated, וglomeruli מבודדות מקליפת הכליה על ידי סינון ההפרש. חלק מהמדגם שניתן לנקוט לניתוח תיקון מהדק וניתן לטעון את שאר עם צבעי ניאון סידן Fluo-4, בבוקר והפורע אדום, הנני על מנת לבצע הדמיה סידן ratiometric confocal.
מדידות אלקטרו של פעילות ערוץ היון הבודד יכולות להתבצע מייד לאחר הבידוד של glomeruli. פעילות של צ'ה היוןניתן למדוד nnels הן בתצורות מצורף תא וכל התא של שיטת תיקון מהדק. כדי להדגים את הכדאיות של הגישה המוצגת הוא ההקלטה של הפעילות היחידה כמו TRPC-ביצוע-סיד יון הערוץ (איור 2). בנוסף, ניתן להחיל תא חדיר או סמים כדי לבדוק את ההשפעות שלהם על זרימת סידן בpodocytes ברמה של תעלות יונים בודדות מחייב קולט.
גישה המאפשרת הערכת פעילות ערוץ יון בודד מייצרת מגוון רחב של נתונים שיכולים לאפיין פונקצית podocyte. עם זאת, זה יכול להיות בתוספת מאוד על ידי מדידת שינויי ריכוז סידן ברמה של כל התאים. כדי לבצע מחקרים כאלה, glomeruli מבודדת טרי היו עמוסה בצבעי ניאון להדמית confocal תפוקה גבוהה. עם רזולוציה אופטית גבוהה שאפשר לעקוב אחר רמות סידן בכמה podocytes בכל פעם. איור 3 מדגים, לפעםכמובן לניסוי הטיפוסי שנועד להעריך את השינויים של ריכוז סידן תוך podocyte. ריכוז סידן הבסיסי בתוך podocyte הוערך על בסיס הקרינה Fluo-4. לאחר הקלטת עוצמת האות הבסיסית דקות 1 (F), ionomycin מוחל וגורם הקרינה שיא (מקסימום F) להיות הגיעה, שהוא הרווה לאחר מכן על ידי MnCl 2 (F דקות יצוין). על פי הנוסחא ב6.3, עוצמה של Fluo-4 אות בכל נקודה של הניסוי זמן יכולה להיות מתורגמת לאחר מכן לריכוז בפועל של יוני סידן בתא. כפי שניתן לראות מהגרף, אומר הקרינה ברקע (יחידות שרירותיות כ 400) מיתרגם 140 ננומטר, אשר נמצא בטווח ריכוז רגיל לסידן תוך תאי בתאים שאינם בריאים אפופטוטיים.
החשיבות והתועלת של הגישה המתוארת מוצדקת על ידי יישום אחר, המאפשר למדידת transie סידן החריףNTS בpodocytes בתגובה לתרופות שונות. איור 4 א ממחיש תמונות נציג glomerulus העכברוש מוכתם עם Fluo-4 ופורע אדום בפתרון המכיל סידן 2 מ"מ (שתואר ב4.5) לפני ואחרי תוספת של 10 מיקרומטר ATP. הערה עלייה דרמטית בירוק (Fluo-4 בבוקר) הקרינה של podocytes (מסומנת בחצים), וירידה בקרינת פורעה האדום (pseudocolor האדום). Fluo4 וFuraRed משקפים עלייה בריכוז סידן בגל עירור של 488 ננומטר בכיוון הפוך, כלומר, כאשר ריכוז סידן בתוך התא מגביר Fluo 4 אינטנסיביות עולה, ואילו FuraRed יורד. זה אפשרי בשל אופי עירור כפול של fluorophore FuraRed. בהתאם לגל עירור זה יכול להתנהג כמו fluorophore-מחויב סידן (420 ננומטר) או ללא סידן (488 ננומטר) עם עלייה מקבילה או ירידה בקרינה. לכן, השימוש בFuraRed לבד במצב הדמיה ratiometric אפשרי, אבל זה requir es שני אורכי גל עירור - 420 ננומטר 488 ננומטר ו. זה יקטין את תדירות ההדמיה לפחות פעמיים (בהשוואה לשימוש בעירור אחד אורך גל); אם החוקר היה רוצה לשמור את הקצב המהיר של הדמיה, צריך להיות ירידת רזולוציית התמונה. עם זאת, 4 Fluo וFuraRed יכולים לשמש יחד במצב ratiometric ללא אובדן הרזולוציה או ירידה בתדירות הדמיה, כפי שניתן נרגש fluorophores אלה על ידי אותו לייזר ננומטר 488, ומספקת בידול טוב של ספקטרום הפליטה. חולף אופייני סיכמו מROIs מסומנת בחיצים באיור 4 א מוצגים באיור 4; הגרף מראה בבירור עלייה חריפה בFluo4 / יחס עוצמת FuraRed לאחר תוספת של 10 מיקרומטר ATP, שדועך בתוך כמה דקות. תמונות צולמו כל שניות 4, ומכאן, הטכניקה מאפשרת התבוננות שינויים מהירים בריכוז סידן בתוך התא.
בעמודים = "תמיד"> 
איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול הניסוי. לאחר החיה מורדמת כראוי ומוכנה לניתוח, הכליות סמוקות עם PBS להסיר דם. לאחר מכן, הכליות הם נכרת וdecapsulated, וglomeruli מבודדות מקליפת הכליה על ידי סינון ההפרש. כאן, חלק מהמדגם נלקח לניתוח תיקון מהדק, ואת השאר נטען עם צבעי ניאון וסידן הדמיה סידן ratiometric confocal מתבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הקלטת נציג מראה את הפעילות של ערוצי סידן TRPC בpodocytes של glomeruli העכברוש מבודדת הטרי. לוח שמאלי מדגים את פיפטה תיקון מהדק מחוברת לגוף podocyte על פני השטח של glomerulus במהלך הקלטת אלקטרו בתצורה המצורפת תא; חלק מglomerulus לתמצת ניתן לראות בפינה הימנית התחתונה של התמונה. עקבות הנוכחיות נציג של פעילות הערוצים כמו TRPC-מתיקון מצורף תא נעשה על podocyte של glomerulus העכברוש בפוטנציאל החזקת -40 mV מוצגת בצד הימין. ג וo אני מציין רמות ערוץ סגורות ופתוחות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. ניסוי נציג איור שנועד להעריך את רמת סידן תוך תאי ב podocytes. כדי למדוד ריכוז סידן תוך תאי, glomeruli נטענות עם Fluo-4, בבוקר, עוצמת הקרינה נרשמה בתחילת המחקר ולאחר תוספת של ionomycin וMnCl 2. הגרף ממחיש את שינויי אות הקרינה בתגובה לionomycin (ייצור המרבי של הקרינה Fluo-4, מקסימום F) וMnCl 2, שמרווה את הצבע ואת התוצאות בעוצמה הנמוכה ביותר הקרינה (דקות F). עוצמת הקרינה (abscissa עזב) עבור כל נקודת זמן יכולה להיות מתורגמת לריכוז סידן בפועל בnanomoles (מימין abscissa) על פי הנוסחא ב6.3. שים לב לריבועים עם התמונות מראים podocytes בנקודות הזמן שבו F, F המקסימום וF דקות חושבו. הגרף שמוצג כאן משקף עוצמת הקרינה של podocyte המסומן בעיגול (ROI); תמונות צולמו כל שניות 4.nk "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מדידה הארעיים סידן בpodocytes בתגובה ל- ATP. (א) נציג תמונות הממחישות את glomerulus עכברוש הסוג בר מוכתם עם Fluo-4 (pseudocolor הירוק) והפורע אדום (pseudocolor האדום) בפתרון המכיל סידן 2 מ"מ לפני ואחרי תוספת של 10 מיקרומטר ATP. הקרינה בצבע ירוקה נמוכה עצימות לפני היישום של התרופה יש לציין. (ב) תמצית דוגמא של חולף סידן תוך תאי עוררו בpodocytes על ידי יישום של 10 מיקרומטר ATP. הערה עלייה חזקה ומהירה ביחס עוצמת הקרינה Fluo-4 / פורע האדום הבאים תוספת של התרופה, המהווה גירוי ודלדול של מחסן סידן וזרימת סידן מהדואר מחוץ לתא, וכתוצאה מכך ההעלאה של ריכוז סידן תוך תאי. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של אמצעי מחושבת עבור 11 podocytes של אותו glomerulus. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הגישה המתוארת כאן מאפשרת הניתוח של טיפול בסידן על ידי podocytes של glomeruli המכרסמים. טכניקה זו מאפשרת יישום של אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק היחידה ערוץ וההדמיה confocal ratiometric הקרינה. עם זאת, ניתן להשתמש בשתי הגישות בנפרד, בכוחות עצמם. יש הפרוטוקול המוצע כמה צעדים פשוטים יחסית, הכוללים סומק) בכליות 1; בידוד של glomeruli ידי סינון ההפרש 2); 3) ביצוע ניסויי אלקטרו תיקון מהדק, או דגירה של glomeruli עם צבעי ניאון תיוג סידן הדמיה confocal ratiometric של שינויים בסידן תוך תאי.
כדי לבודד את glomeruli, פרוטוקול שונה המבוסס על Gloy et al. 5 היו בשימוש. היתרון העיקרי של הטכניקה הנוכחית של סינון ההפרש הוא שהיא מייצרת glomeruli הופשטה מהכמוסה של באומן ולכן אינו דורשת צעד המתוחכם וגוזל זמןשל decapsulation הידני. רוב glomeruli בחלק המבודד הם decapsulated, אולם החוקר חייב להיות מודע לכך שיש glomeruli לתמצת, מדי. חשוב לוודא כי glomeruli פשטה את של הכמוסה של באומן הם צילמו, ככמוסה מונעת תרופות מלהגיע podocytes. כפי שניתן לראות באיור 2, יש לי glomeruli decapsulated משטח מחוספס עם נימים שונות וגופי podocyte, ואילו glomeruli לתמצת מופיעה חלקה ועגולה בצורה. יתר על כן, במארז glomeruli הטעון Fluo4 וFuraRed לפלוט אות הקרינה פחות אינטנסיבית בהשוואה לאלה decapsulated.
החלק של glomeruli העכברוש שהושג הוא 95% טהורים (עם עקבות של צינוריות הפרוקסימלי) ויכול לשמש בקלות למערבית סופג או יישומי ביולוגיה מולקולריים אחרים במידת צורך. חשוב במיוחד שבהכנה זו podocytes מחוברים לנימים, לשמור על תהליכי רגל שלמים ומתפקד כחלקשל מכונות מנגנון סינון glomerulus ילידים. מנגנוני טיפול בסידן על ידי podocytes משרתים תפקיד רגולציה חיוני להתפתחות ולמניעת סיבוכי כליות במחלות כגון סוכרת או יתר לחץ דם 9-12. Podocytes לתרום באופן משמעותי לחסמי החדירות, כפי שמעיד העובדה שפציעה אקוטית משנה מורפולוגיה podocyte ומבנה ועלולה לגרום לפרוטאינוריה 2,3,13-15. לכן, יש חשיבות רבה לבחון את ההיענות של זרימת סידן בתאים אלה לתרופות, שיכול להיות מוקרנים בקלות בהכנה זו. יש להבין שאם החוקר הוא חיטוט podocytes במצב פתולוגי, למשל, יתר לחץ דם או סוכרת, אשר בדרך כלל לגרום לפרוטאינוריה ונזק glomeruli, התשואה של glomeruli עשויה להיות פחות טהורה מזה של בעלי החיים הבריאים. מומלץ תמיד לעקוב אחר שברי glomeruli בכל שלב של תהליך הבידוד כדי למנוע אובדן שלהרקמה. במקרים מסוימים, glomeruli החולה בכבדות או glomeruli מבעלי חיים בגילים או צעירים מדי עלולה לחייב התאמה אישית של תהליך הבידוד, כוללים מבחר של מסננות רשת גדולות / קטנות.
יש לנו ליישם גישה זו בתחילה כדי לקבוע את היעילות של תרופות אנטי דלקתיות שאינם סטרואידים בעיכוב של ערוצי TRPC סידן בpodocytes 16. בעקבות מחקרים אלה 7,16-22 אנחנו מועסקים טכניקות המתוארות להקים כמה מנגנונים קריטיים שליטה פונקצית podocytes. לדוגמא שתארנו את הפרופיל של P2 (purinergic) קולטנים בpodocytes של החולדות והגדרנו את הסדרת זרימת סידן על ידי אנגיוטנסין II בglomeruli העכבר. כפי שתואר בכתב יד מאוחר יותר 20, הפרוטוקול ניתן להתאים לבצע מחקרים דומים לא רק בחולדות, אלא גם במינים אחרים, כגון עכברים. הדמיה הקרינה סידן ratiometric (עם השימוש בשני ניאוןצבעים - Fluo-4 ופורע אדום) מבטיחים אמינות נוספת של הנתונים, ואם הדמיה סידן נחוצה יכולה להיות משולבת עם צבעי ניאון אחרים כדי לעקוב אחר שינויים בחומרים אחרים בתוך podocytes. לדוגמא, השתמשנו בגישה זו כדי למדוד תחמוצת חנקן בעזרת צבע DAF-FM. אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק יכולה לשמש לבד או (התקנה המתירה) בשילוב עם סידן הדמיה. מלבד ערוצי סידן, הטכניקה מאפשרת הקלטת הפעילות של תעלות יונים אחרות. יתר על כן, השימוש בtransfection וsiRNA יכול להרחיב את השטח של יישום עוד יותר, לאחרונה כפי שהוכח על ידי קבוצתו של ד"ר מייבש 23.
מיקרוסקופיה epifluorescence הקונבנציונלית יכולה לשמש כאן במקום ההדמיה confocal פחות סביר. עם זאת, החוקר צריך להיות מודע לכך שהרגישות היעילה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי השדה הרחב מוגבלת בדרך כלל על ידי אור מחוץ לפוקוס. (בהשוואה לזה imagin confocalז) גורם מגבלות כגון חוסר יכולת לייצר רזולוציית תמונה גבוהה של החזר על השקעה בודדת (podocyte) או תהליכי רגלה. יתר על כן, מיקרוסקופיה רחב בתחום מסבכת זיהוי podocytes כפי שקשה להבחין בין פני השטח של glomerulus ורקמות עמוקות. נכון לעכשיו זמינות מסחרית של fluorophores השונים להדמיה confocal היא הרבה יותר טובה ומתרחב במהירות. לחלופין, מחקרי epifluorescence ניתן לשלב בקלות עם התקנת אלקטרו אשר יכול לספק Ca 2 + בו זמנית תאיים והקלטת פעילות ערוץ אחד. טעינת Fura2-AM של podocytes glomeruli עם monochromator מסנן-גלגל והתקנת מסנני צפיפות ניטראלית היא בשימוש נרחב, אך לא תמיד מתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה באיכות.
צריך גם לציין כי glomerulus המבודד, הפונקציונלי הוא מסוגל לשנות את נפחו בתגובה לגירויים פיסיולוגיים. החוקר צריך להיות מודע בזמן הזה ביצועניסויים, ולבחור בזהירות את מישור המוקד במהלך לימודי confocal כדי למנוע האובדן של מוקד, ולבצע ניסויי שליטה על בחירה של תרופות חדשניות על מנת לבדוק התכווצות או הרפיה מכוונת.
טכניקה זו מציעה הזדמנות ייחודית לעקוב אחר שינויים בזרימת סידן בערוץ היון הבודד ורמות תאים בודדים לאחר טיפולים תרופתיים או מניפולציות אחרות, במגוון רחב של רקעי מכרסמים. טכניקה זו יכולה לשמש גם במחקרי מחלת כליות אדם כפרוטוקול שונה יכול להיות מיושם על רקמות המתקבלות מביופסיות כליה, שללא ספק מספקות מידע בעל ערך יוצא דופן. בנוסף, מדידות ריכוז סידן יכולות להיות יחד עם ניסויי אלקטרו תיקון מהדק בזמן אמת, אשר עשוי לספק יותר מעמיק ותובנה מכניסטית לרגולציה של סידן טיפול בpodocytes בתנאים נורמלים ופתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (ניקון מכשירים, Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. גרגורי בלס הוא הודה להגהה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות וHL108880 מענק איגוד סוכרת האמריקנית להעניק 1-15-BS-172 (לAS), ובן ג 'יפס מחקר המלגה מהאגודה לנפרולוגיה האמריקנית (ל- DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
