Introduction
Rins manter o equilíbrio homeostático para várias substâncias e regular o volume de sangue de uma forma que determina a pressão arterial total. Distúrbios no filtração renal, reabsorção ou secreção de causar ou acompanham os estados patológicos, que variam de hiper ou hipotensão para a doença renal terminal que eventualmente exige transplante renal. A unidade de filtração renal (glomérulo) consiste em três camadas - o endotélio capilar, membrana basal e uma camada de célula única de células epiteliais - podócitos, que desempenham um papel importante na manutenção da integridade e função de um diafragma de fenda. Disfunção no filtro de permeabilidade selectiva glomerular provoca perda urinária de macromoléculas, tais como proteinúria. Vários agentes podem afectar a estrutura das podócitos e os seus processos de pé, que determinam a integridade da barreira de filtração glomérulos.
Os podócitos estão envolvidos na manutenção do glomfunção de filtração eruli. Foi estabelecido que a manipulação imprópria de cálcio pelo podócitos leva a lesão celular e desempenha um papel importante na progressão de várias formas de nefropatias 2,3. Portanto, o desenvolvimento de um modelo que permite a medição direta da variação da concentração de cálcio intracelulares será fundamental para estudos de função podocyte. Isolado glomérulos foram anteriormente utilizados em um numerosos estudos, incluindo medição do coeficiente de reflexão albumina muda 4 e avaliação das correntes celulares integral na de células inteiras eletrofisiológicos medições de patch-clamp 5,6. No presente artigo descrevemos o protocolo que permite ao pesquisador para medir as mudanças de concentração de cálcio intracelular em resposta aos pedidos de agentes farmacológicos, estimar os níveis basais de cálcio dentro das células, e avaliar indivíduo atividade canais de cálcio. Medições da concentração de cálcio Ratometric e patch-clamp electrophysiology foram usadas para determinar as alterações na concentração intracelular de cálcio no seio da actividade podócitos e canal, respectivamente.
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Protocol
O uso de animais e bem-estar devem aderir ao Manual do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório seguindo protocolos revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC).
1. Lave rim
- Use 8 a 12 semanas de idade de ratos macho (sugerido é uma estirpe Sprague Dawley, no entanto outras estirpes de idade e sexo diferente pode ser utilizado com modificações apropriadas).
- Anestesiar o animal de acordo com o procedimento permitido pelo protocolo IACUC; monitorar a profundidade da anestesia e inspecionar o animal. A descrição detalhada da cirurgia a ser realizada em 1,3-1,8 pode ser encontrado em Ilatovskaya et al 7.
- Após anestesia adequada, colocar o animal em uma mesa cirúrgica, com temperatura controlada, fazer uma incisão na linha média do abdome (até 3 polegadas de comprimento), e descobrir a veia cava ea aorta.
- Insira ligadura ao redor dos celíacos e artérias mesentérica superior e da abdominalaorta acima daqueles; não ligadura.
- Blunt dissecar a aorta abdominal abaixo das artérias renais, e coloque duas ligaduras em torno dele, mas não ligar, em seguida, apertar a aorta acima das ligaduras e amarre o fio inferior.
- Cateterize aorta com uma tubagem de polietileno PE50 (ligado a uma bomba seringa cheia com PBS) abaixo da braçadeira e fixar o cateter com a segunda ligadura; remover o grampo, ligar a bomba, e ligar a aorta e artérias mesentérica com doença celíaca. Rapidamente fazer incisão na veia renal para aliviar a pressão.
- Infundir a aorta com o PBS pré-arrefecida durante 2 ou 3 minutos a um caudal de 6 ml / min.
- Pare de perfusão, especiais de consumo e 7 decapsulate os rins, e colocá-los no gelo na solução PBS. Eutanásia do animal de acordo com o protocolo aprovado pelo IACUC.
2. Isolamento do Rato Os glomérulos
- Preparar 30 ml de solução fresca de 5% de BSA em meio RPMI 1640.
- Usando uma lâmina de barbear e tesouras,isolar o córtex de ambos os rins, e em seguida, mediu até ficar homogénea. Este procedimento foi descrito anteriormente 7.
- Empurrar o tecido moído durante o passo anterior através de um peneiro de aço inoxidável de malha 100 (pré-embebidos em solução de BSA a 5% / RPMI) utilizando uma espátula. Recolhe-se o fluxo de passagem e por força da gravidade permitir o fluxo de passagem para passar através de um peneiro de 140 mesh.
- Filtra-se o fluxo através recolhidos a partir de 140 utilizando um peneiro de malha pré-embebido peneira de malha 200, descarta-se o filtrado e lava-se a parte superior do crivo com 10 - 15 ml da solução de BSA / RPMI preparado para recolher os glomérulos que sedimentam sobre o crivo.
- Coloque a solução de BSA / RPMI contendo glomérulos sobre gelo em um tubo de 15 ml e deixar o sedimento glomérulos na parte inferior do tubo de até 20 min. O concentrado glomérulos no fundo do tubo irá ser claramente visto. Remover o excesso de solução, deixando cerca de 2 ml no tubo.
3. Single-channel patch-clamp Electrophysiology
- Prepare 5 x 5 milímetros chips de vidro capa de revestimento com 70.000 MW - 150.000 poli-ʟ-lisina, e deixe secar. Use cerca de 30 ml de solução estéril filtrado 0,01% em água por tampa de vidro.
- Aquecer as soluções experimentais para a TA e encher a câmara de patch-clamp e pipeta. Para a monitorização canais trpC, usar uma solução de banho, em mM: 126 de NaCl, 1 CaCl2, 10 de HEPES, 2 de MgCl2, 10 de glucose, pH 7,4; pipeta: 126 de NaCl, CaCl2 1,5, HEPES 10, glucose 10; pH 7,4.
- Adicionar inibidores para a solução da pipeta para bloquear a actividade de canais endógenos, os quais não são relevantes para os estudos (recomendados são: 100 uM de ácido niflúmico ou DIDS (para bloquear Ca 2+ -activated canais Cl -), 10 mM de TEA (para inibir a grande condutância Ca 2 + - K + dependente do canal), 10 nM iberiotoxin (para bloquear os canais de K + -activated Ca2 +), 10 mM nicardipina (para bloquear N-tipo Ca2 + canais)) diretamente antes do experimento patch-clamp.
- Misture suavemente a solução contendo glomérulos, e em seguida, aplicar cerca de 50 l de la à tampa revestida chips de vidro poli-ʟ lisina. Deixe os glomérulos anexar por aproximadamente 5 min.
- Mover os chips de vidro com glomérulos para a câmara de patch-clamp pré-cheia com a solução de banho; perfundir a câmara a um caudal de 3 ml / min durante 1 min para assegurar a remoção dos glomérulos não acopladas.
- Realizar um experimento patch-clamp convencional em um modo ligado à célula 7. Com uma pipeta de vidro (7-10 mohms resistência pipeta) formar uma vedação de alta resistência entre uma pipeta e uma membrana podócitos por aplicação de sucção suave (uma pipeta ligada a um podócitos na superfície do glomérulo isolado é mostrado na Figura 2, em a esquerda).
- Para as medições ligado de células, de baixo passam as correntes em 300 Hz por um filtro de oito pólos Bessel.
- VOCÊse isolado glomérulos em experimentos de patch-clamp para até 4-6 horas. Mantenha a fração estoque glomérulos no gelo.
4. Raciometrico confocal de fluorescência As medições da concentração de cálcio intracelular no Podócitos
- Colocar 500 mL da fracção de glomérulos (descrito em 2.5) em 0,5 ml de tubo cónico e adicionar corantes cálcio Fura Red, AM e Fluo-4, AM. Utilizar 2 mM e 1 mM concentrações de banco de Fura Red, AM e Fluo-4, AM, respectivamente (armazenar a -20 ° C, dissolveu-se em DMSO) e 2,5 ul de usar cada corante por 500 ul de fracção de glomérulos. Imediatamente após a adição dos corantes cobrir o tubo com folha de alumínio.
- Colocar os tubos num agitador rotativo durante pelo menos 20 minutos até 1 hora à TA.
Nota: Os agentes farmacológicos podem ser adicionados durante este passo. - Prepare lamelas de vidro, cubra-os com poli-ʟ-lisina e permitir a secagem usando set placa aquecida a 70 ° C.
- Uma vez que o carregamento de corantes de cálcio é complete, aplicar 100 ul de solução contendo os glomérulos para as lamelas revestidas com poli-ʟ-lisina e deixá-los aderir à superfície durante cerca de 5 min. Montar as lamelas anexado-glomérulos em uma câmara de imagem, e perfundir com a solução de banho (contendo (em mM): 145 NaCl, 4,5 de KCl, 2 de MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) com um caudal de 3 ml / min para remover os glomérulos acopladas e os corantes restantes.
- Definir o microscópio confocal de varrimento a laser a um comprimento de onda de excitação de 488 nm e filtros de emissão (525/25 e 650/25 nm para Fluo-4 e Fura Red, respectivamente). Definir o software de imagem para uma freqüência e resolução desejada.
- Encontre o glomérulos em claro e, em seguida, ligue a detecção do sinal de fluorescência. Ajustar a intensidade do laser para cada corante para evitar a saturação do sinal. Escolha o plano focal com as podocytes que estão diretamente ligados ao vidro. Isto minimiza o efeito causado pela contracção de um glomérulo em resposta à drogaaplicação. Verifique novamente se o glomérulo de escolha é bem ligado ao vidro;
- Comece imaginando o plano focal de escolha (levar 512 x 512 imagens com a freqüência ajustada em 4 segundos para visualizar rápido Ca 2+ alterações transitórias. Use um / NA 1.4 ou lente objetiva semelhante 60X imagem de alta resolução para), aplicar medicamentos de interesse, e registar a resposta.
- Escolher um plano focal desejado (o mais próximo da superfície do vidro quanto possível, para assegurar a imagiologia de podócitos na superfície do glomérulo). Verifique a intensidade da fluorescência na Fluo4 e canais FuraRed, e certifique-se que o glomérulo é claramente visto em campo claro.
- Iniciar a imagiologia. Antes da aplicação de todas as drogas, ficha, pelo menos, 1 min de linha de base de fluorescência para assegurar que o sinal é estável (não há picos repentinos ou desvanecimento do sinal).
- Aplicar drogas desejadas com a ajuda de uma micropipeta; ter cuidado e garantir a droga foi capaz de difundir bem e alcançar o glomerulus. Misturar a solução de banho suavemente se necessário, monitorar o plano focal selecionado e verifique se ele não se moveu fora de foco por causa da aplicação de drogas.
- Registar as alterações na intensidade de fluorescência para os sinais Fluo4 e FuraRed. Certifique-se a gravação é longo o suficiente, esperando até que o sinal atinge o nível de patamar ou atinge um pico e, em seguida, retorna à linha de base. Execute mudança solução ou adição de quaisquer outros medicamentos, se necessário.
- Parar a gravação e salvar o arquivo no formato nativo do software.
5. Análise de Imagem para as medições de cálcio
- Realizar análise de imagem com o software open ImageJ equipado com o plug-in utilitário ND que permite importar imagens no formato nativo ND2.
- Importar a seqüência de imagens; certifique-se de dividir os canais e usar um modo hyperstack em tons de cinza.
- Siga o → Ferramentas → caminho Analisar gerente ROI no software ImageJ para opena uma janela do gerenciador de ROI. Seleccione várias regiões de interesse (podocytes) usando uma ferramenta de seleção oval eo "(t) Adicionar" função no Gerenciador de ROI. Como o último ROI, selecione a área no fundo; salvar as ROIs selecionadas (Mais → Salvar).
- Realce a janela que contém o canal selecionado para análises. Use a mais → função multi Medida no Gerenciador de ROI, marque a caixa "uma linha por fatia" no diálogo que aparece, e em seguida, clique em OK. Os resultados serão mostrados no formato que pode ser configurado na janela de resultados: entrar nas opções de menu Resultados → Definir Medidas, selecione "valor de cinza média" e calcular os valores de intensidade de pixel para cada ROI, que será exibido na janela de resultados em colunas separadas para cada ROI.
- Copie os valores de intensidade de ROI medidos para cada canal (Fluo-4 e Fura Red) em software de análise de dados preferido; valores de intensidade fundo subtrair de cada datum ponto.
- Para cada ponto de tempo calcular o rácio de intensidades do Fluo-4 aos canais Fura Red. Gráfico de dispersão / linha mudanças em tempo ponto de Ca 2+ transitória para cada ROI. Calcule os valores médios / SE para glomérulos selecionados.
Nota: coluna Time deve ser definido de acordo com a frequência de imagem selecionada em 4.5.
6. Os cálculos de concentração intracelular de cálcio usando fluorescência de Fluo-4 Sinal
- Retirar uma amostra de glomérulos e executar o protocolo experimental acima para o passo 4.7. Depois de gravar a fluorescência de fundo adicionar Ionomicina (concentração final na câmara do banho deve ser de 10 uM) à solução de banho, e aumento da intensidade de fluorescência ficha. Uma vez que a intensidade atinge o seu máximo e começa a decadência, adicione MnCl2 (concentração final deve ser de 5 mm) para extinguir a fluorescência 8.
- Analisar os dados obtidos em 6.1. Copie os Fluo-4 valores de intensidade de sinal ROI obtidos de acordocom o protocolo descrito em 5,1-5,5 por software de análise preferido.
- Calcular a concentração intracelular de cálcio (em nM) na podócitos correspondente ao ROI através de uma fórmula:
K onde d é uma dissociação pré-determinada constante para Fluo-4 (345 nM), F é a intensidade no ponto de tempo que está a calcular a concentração de cálcio para (linha de base), e F e F max min são os valores de intensidade na ponto de carga máxima de cálcio (após aplicação ionomicina) e após a extinção da fluorescência do (com MnCl 2), respectivamente (ver Figura 3).
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Representative Results
Aqui abordamos o problema de medir alterações agudas nos níveis de cálcio nos podocytes. A Figura 1 mostra uma representação esquemática do protocolo experimental projetado para realizar alta resolução de imagem confocal de fluorescência ao vivo e gravações de atividade de canais iônicos individuais nos podocytes do recém- glomérulos isolados de roedores. Resumidamente, após o rato é anestesiados, os rins devem ser lavados com PBS para limpá-las de sangue. Em seguida, os rins são excisados e decapsulated, e glomérulos são isoladas a partir do córtex renal por peneiração diferencial. Parte da amostra pode ser feita por análise de patch-clamp e o resto pode ser carregado com corantes de cálcio fluorescente Fluo-4, AM e Fura Red, AM, a fim de realizar imagem confocal de cálcio raciométrica.
Medições electrofisiológicas da actividade de canal iónico único pode ser realizada imediatamente após o isolamento dos glomérulos. Actividade de cha iãonnels pode ser medido tanto em configurações ligado à célula e de célula completa do método de patch-clamp. Para demonstrar a exequibilidade da abordagem é mostrado o registo da actividade única TRPC-como condutor de iões de cálcio canal (Figura 2). Além disso, é possível a aplicação de células-permeável ou drogas para testar os seus efeitos sobre o influxo de cálcio nas podócitos ao nível dos canais de iões simples de ligação ao receptor.
Uma abordagem que permite a avaliação actividade de canal iónico único produz uma variedade de dados que podem caracterizar função podocyte. No entanto, ele pode ser grandemente suplementado medindo as alterações de concentração de cálcio a nível das células inteiras. Para efectuar tais estudos, glomérulos isolados de fresco foram carregadas com corantes fluorescentes para a elevada taxa de transferência de imagem confocal. Com uma elevada resolução óptica, é possível controlar os níveis de cálcio em vários podócitos de cada vez. A Figura 3 demonstra o tempo-curso para a experiência típica projetado para avaliar as mudanças de concentração de cálcio dentro do podocyte. A concentração de cálcio dentro do podócitos basal foi avaliada com base na fluorescência de Fluo-4. Depois de registar a intensidade do sinal basal durante 1 min (F), ionomicina é aplicado e faz com que a fluorescência máxima (Fmax) a ser alcançado, o qual é, em seguida, temperada por meio de MnCl2 (F min for observada). De acordo com a fórmula em 6,3, a intensidade de Fluo-4 do sinal em cada ponto de tempo da experiência podem ser então traduzido para a concentração real dos iões de cálcio na célula. Como pode ser visto a partir do gráfico, a fluorescência no fundo (cerca de 400 unidades arbitrárias) significa traduz-se em 140 nm, o que está dentro de uma gama de concentração normal de cálcio intracelular em células não apoptóticas saudáveis.
A importância e utilidade da abordagem descrita é justificada por outro aplicativo, que permite a medição de cálcio transie agudaNTS em podócitos em resposta a vários fármacos. A Figura 4A ilustra imagens representativas do glomérulo de ratos coradas com Fluo-4 e Fura Red na solução contendo cálcio 2 mM (descrito em 4.5), antes e após adição de 10 uM de ATP. Nota um aumento dramático no verde (Fluo-4 AM) a fluorescência das podócitos (marcados com setas), e uma queda na Fura Red fluorescência (pseudo vermelho). Fluo4 e FuraRed refletir um aumento na concentração de cálcio em um comprimento de onda de excitação de 488 nm em frente maneira ou seja, quando a concentração de cálcio dentro da célula aumenta Fluo 4 intensidade sobe, enquanto FuraRed vai para baixo. Isso é possível devido à natureza dupla excitação de FuraRed fluoróforo. Dependendo do comprimento de onda de excitação que pode se comportar como (488 nm) fluoróforo ligadas a cálcio (420 nm) ou sem cálcio com correspondente aumento ou diminuição da fluorescência. Portanto, o uso de FuraRed sozinho em um modo de imagiologia raciométrica é possível, no entanto, proteces dois comprimentos de onda de excitação - 420 nm e 488 nm. Isto diminuirá a frequência da imagem, pelo menos, duas vezes (em comparação com o uso de um comprimento de onda de excitação); se o pesquisador gostaria de manter o rápido ritmo de criação de imagens, a resolução da imagem deve ser diminuída. No entanto, Fluo 4 e FuraRed podem ser utilizados em conjunto num modo raciométrica sem perda de resolução ou a diminuição na frequência de imagem, uma vez que estes fluoróforos pode ser excitado pelo mesmo laser de 488 nm, e fornecer uma boa diferenciação dos espectros de emissão. Um transiente típica resumida dos ROIs marcados com setas na Figura 4A é mostrada na Figura 4B; o gráfico demonstra claramente um aumento agudo em relação Fluo4 intensidade FuraRed / após a adição de 10 uM de ATP, que decai no prazo de alguns minutos. As imagens foram tiradas a cada 4 segundos, e, portanto, a técnica permite observar as mudanças rápidas na concentração de cálcio dentro da célula.
Figura 1. Representação esquemática do protocolo experimental. Depois de o animal é anestesiado e preparado adequadamente para a cirurgia, os rins são lavadas com PBS para remover o sangue. Em seguida, os rins são excisados e decapsulated, e glomérulos são isoladas a partir do córtex renal por peneiração diferencial. Aqui, parte da amostra é colhida para análise de patch-clamp, eo resto é carregado com corantes fluorescentes de cálcio e de imagem de cálcio ratiometric confocal é executada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. gravação representativas que mostra a actividade dos canais de cálcio na TRPC podocitos do recém isolado rato glomérulos. O painel esquerdo mostra a pipeta patch-clamp ligado ao corpo podócitos na superfície do glomérulo durante uma gravação electrofisiológico numa configuração ligado à célula; uma parte de um glomérulo encapsulada pode ser visto no canto inferior direito da imagem. Traço atual representante da atividade canais TRPC-like de um patch anexado à célula feita sobre a podocyte do glomérulo rato em um potencial segurando -40 mV é mostrada à direita. A c e o i denotar níveis de canal fechadas e abertas, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Experiência representativa concebido para avaliar o nível de cálcio intracelular em os podócitos. Para medir a concentração de cálcio intracelular, glomérulos são carregadas com Fluo-4, AM, a intensidade de fluorescência é gravado na linha de base e após a adição de ionomicina e MnCl2. O gráfico demonstra que as alterações do sinal de fluorescência em resposta a ionomicina (produzindo o máximo da fluorescência de Fluo-4, F max) e MnCl2, que extingue o corante e resulta em menor intensidade da fluorescência (F min). A intensidade de fluorescência (abcissa esquerda) para cada ponto de tempo pode ser traduzido para a concentração real de cálcio em nanomoles (abcissa direita) de acordo com a fórmula em 6.3. Observe as inserções com as imagens que mostram podocytes aos tempos de quando F, F max e F min foram calculados. O gráfico aqui apresentado reflecte a intensidade de fluorescência do podócitos marcado por um círculo (ROI); imagens foram tiradas a cada 4 segundos.nk "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Medição dos transientes de cálcio nos podócitos em resposta ao ATP. (A) Imagens representativas que ilustram o glomérulo tipo selvagem de rato coradas com Fluo-4 (pseudo verde) e Fura Red (vermelho pseudo) na solução contendo cálcio 2 mM antes e após a adição de 10 uM de ATP. Baixa fluorescência de cor verde intensidade antes da aplicação do fármaco deve ser observado. (B) que são resumidos exemplo do cálcio intracelular transiente evocada em podócitos por aplicação de 10 uM de ATP. Nota um aumento forte e rápida em proporção da intensidade de fluorescência de Fluo-4 / Fura vermelha após a adição do fármaco, que é responsável pela estimulação e depleção do depósito de cálcio e o influxo de cálcio a partir the fora da célula, o que resulta na elevação da concentração intracelular de cálcio. As barras de erro representam o erro padrão das médias calculadas para 11 podocytes do mesmo glomérulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A abordagem aqui descrita permite a análise de manuseamento de cálcio pelos podócitos dos glomérulos de roedores. Esta técnica permite a aplicação de patch-clamp eletrofisiologia canal único e fluorescência confocal ratiometric imagem. No entanto, ambas as abordagens podem ser utilizadas separadamente, por conta própria. O protocolo proposto tem várias etapas relativamente simples, incluindo rubor 1) rim; 2) isolamento dos glomérulos por peneiração diferencial; 3) realização de patch-clamp experimentos eletrofisiológicos, ou incubação dos glomérulos com corantes fluorescentes rotulagem de cálcio para imagem confocal ratiometric de alterações de cálcio intracelular.
Para isolar os glomérulos, um protocolo modificado com base no Gloy et ai. 5 foi utilizado. A principal vantagem da técnica actual de crivagem diferencial é que ele produz glomérulos despojados de cápsula de Bowman e, portanto, não requerem o passo sofisticado e demoradode decapsulation manual. A maioria dos glomérulos na fração isolada são decapsulated, no entanto, o pesquisador deve estar ciente de que existem glomérulos capsuladas, também. É importante certificar-se de que os glomérulos despojado fora da cápsula de Bowman são gravadas, como cápsula impede que as drogas cheguem aos podocytes. Como visto na Figura 2, glomérulos descapsulados tem uma superfície áspera com capilares distintas e organismos podocyte, enquanto glomérulos capsuladas parecer lisa e em forma redonda. Além disso, encapsulada Fluo4 e FuraRed glomérulos carregados emitem sinal de fluorescência menos intensa em comparação com os descapsulados.
A fracção de glomérulos de ratos obtido é 95% puro (com vestígios de túbulos proximais) e pode ser facilmente utilizado para a transferência de western ou outras aplicações de biologia molecular, se necessário. É extremamente importante que nesta preparação podócitos estão ligados aos capilares, reter processos pé intactas e funcionam como uma partedo aparelho de filtração glomerular máquinas nativa. Os mecanismos de manuseamento de cálcio por os podócitos servem um papel regulador essencial no desenvolvimento e na prevenção de complicações renais em doenças tais como a diabetes ou a hipertensão 9-12. Podócitos contribuir de forma significativa para as barreiras de permeabilidade, como evidenciado pelo facto de que a lesão aguda altera a morfologia e estrutura podócitos e pode causar proteinúria 2,3,13-15. Portanto, é de grande importância para observar a capacidade de resposta do influxo de cálcio em células para essas drogas, que podem ser facilmente rastreados em esta preparação. Deve ser entendido que, se o pesquisador está sondando podócitos em um estado patológico, por exemplo, hipertensão ou diabetes, que geralmente resultam na proteinúria e glomérulos danos, o rendimento de glomérulos pode ser menos pura do que a dos animais saudáveis. Recomenda-se sempre para monitorar as fracções glomérulos em cada fase do processo de isolamento, para evitar a perda deo tecido. Em alguns casos, glomérulos fortemente doente ou glomérulos de animais idosos ou muito jovens podem exigir ajuste individual do processo de isolamento, incluindo a seleção de maiores peneiras / menores de malha.
Aplicou-se esta abordagem, inicialmente, para determinar a eficácia de fármacos anti-inflamatórios não-esteróides na inibição dos canais de cálcio em podócitos trpC 16. Na sequência destes estudos 7,16-22 empregamos as técnicas descritas para estabelecer vários mecanismos críticos controladores podocytes função. Por exemplo, descrevemos o perfil do P2 (purinérgico) nos receptores podócitos dos ratos e definida a regulação do fluxo de cálcio através da angiotensina II nos glomérulos do rato. Como descrito num manuscrito posterior 20, o protocolo pode ser adaptado para realizar estudos semelhantes em ratos, não só, mas também em outras espécies, tais como ratinhos. Imagiologia de fluorescência raciométrica cálcio (com o uso de dois fluorescentecorantes - Fluo-4 e Fura vermelho) garante confiabilidade adicional dos dados, e se as imagens de cálcio necessária pode ser combinado com outros corantes fluorescentes para monitorar as mudanças em outras substâncias dentro dos podocytes. Por exemplo, utilizou-se esta abordagem para medir o óxido nítrico com a ajuda do corante FM-DAF. Patch-clamp electrofisiologia pode ser usado sozinho ou (configuração permitindo) em combinação com a imagem de cálcio. Além de canais de cálcio, a técnica permite a gravação a actividade de outros canais iónicos. Além disso, a utilização de transfecção e siARN pode expandir a área de aplicação ainda mais, como foi recentemente mostrado por grupo do Dr. secador 23.
Microscopia de epifluorescência convencional pode ser usado aqui, em vez da imagem confocal menos acessível. No entanto, o pesquisador deve estar ciente de que a sensibilidade eficaz de microscopia de fluorescência de campo grande é geralmente limitada pela luz fora de foco. Este (em comparação com imagin confocalg) faz com que tais limitações como incapacidade de produzir alta resolução de imagem de ROI único (podocyte) ou os seus processos de pé. Além disso, a microscopia de campo amplo complica a identificação de podócitos, uma vez que é difícil de diferenciar entre a superfície do glomérulo e profunda do tecido. A partir de agora disponibilidade comercial de vários fluoróforos para imagem confocal é muito melhor e em rápida expansão. Como alternativa, os estudos de epifluorescência pode ser facilmente combinado com uma configuração que pode proporcionar electrofisiológico Ca 2+ intracelular simultâneo e a actividade de canal único de gravação. Fura2-AM carregamento de podocytes glomérulos com monocromador filtro de rodas ea instalação de filtros de densidade neutra é amplamente utilizado, mas nem sempre é adequado para alta qualidade de resolução de imagem.
Deve também ser notado que a, glomérulo funcional isolado é capaz de alterar o seu volume em resposta a estímulos fisiológicos. O pesquisador deve estar ciente disto realizando ao mesmo tempoexperiências, e escolher cuidadosamente o plano focal durante os estudos confocal para evitar a perda de foco, e realizar experimentos de controle em cima da seleção de novos medicamentos, a fim de testar a contração involuntária ou relaxamento.
Esta técnica oferece uma oportunidade única para monitorar as alterações no fluxo de cálcio no canal iônico único e níveis de células individuais após os tratamentos farmacológicos ou outras manipulações, em uma variedade de fundos de roedores. Esta técnica pode também ser utilizado em estudos de doenças renais humanas como um protocolo modificado pode ser aplicado aos tecidos obtidos a partir de biópsias de rim, o que, sem dúvida, proporcionar informações excepcionalmente valioso. Além disso, as medições da concentração de cálcio poderia ser emparelhado com os experimentos de patch-clamp eletrofisiológicos em tempo real, que podem fornecer mais aprofundada e uma visão mecanicista na regulação do cálcio manipulação dentro podocytes em condições normais e patológicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) e Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) para a assistência técnica excelente, com experimentos de microscopia. Gregory Blass é reconhecida pela revisão crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Saúde HL108880 concessão e American Diabetes Association conceder 1-15-BS-172 (para AS), eo Ben J. Lipps Research Fellowship da Sociedade Americana de Nefrologia (para DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
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