Introduction
Nyrene opprett homeostatisk balanse for forskjellige stoffer og regulere blodvolum på en måte som bestemmer det totale blodtrykket. Forstyrrelser i nyrefiltrasjon, reabsorpsjon eller sekresjon føre til eller følge patologiske tilstander, alt fra hyper- eller hypotensjon å ende nyresykdom som etter hvert trenger nyretransplantasjon. Nyre filtrering enhet (glomerulus) består av tre lag - kapillære endotel, kjeller membran og en encellet lag av epitelceller - podocytes, som spiller en viktig rolle i vedlikehold av spaltegulvet integritet og funksjon 1. Dysfunksjon i det permselektive glomerulær filteret forårsaker tap av urin makromolekyler, slik som proteinuri. Forskjellige midler kan påvirke strukturen av podocytes og deres fot prosesser, som bestemmer integriteten av glomeruli filtreringsbarriere.
De podocytes er involvert i vedlikehold av glomeruli filtrering funksjon. Det har blitt fastslått at kalsium uriktig håndtering av podocyte leder til celleskade og spiller en viktig rolle i progresjonen av forskjellige former av nefropatier 2,3. Derfor er utvikling av en modell som tillater direkte måling av intracellulære kalsiumkonsentrasjonen endringer vil være medvirkende for studier av podocyte funksjon. Isolerte glomeruli ble tidligere brukt i en rekke studier, inkludert måling av albumin refleksjonskoeffisienten endrer 4 og vurdering av integrerte mobil strømninger i hel-celle elektro patch-clamp målinger 5,6. I den foreliggende beskrivelsen beskriver vi den protokoll som tillater forskeren til å måle intracellulære kalsiumkonsentrasjonen endres som reaksjon på anvendelser av farmakologiske midler, estimere basale nivåer av kalsium i cellene og vurdere individuell kalsiumkanaler aktivitet. Ratometric kalsium konsentrasjonsmålinger og patch-clamp electrophysiology ble anvendt for å bestemme endringer i den intracellulære kalsiumkonsentrasjon innenfor podocyte og kanalaktivitet, respektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal bruk og velferd bør følge NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr følgende protokoller gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Nyre Flush
- Bruk 8 til 12 uker gamle hannrotter (antydet er en Sprague Dawley stamme, men andre stammer av forskjellig alder og kjønn kan brukes med passende endringer).
- Bedøve dyret i henhold til prosedyren som tillates av IACUC protokoll; overvåke anestesidybden og inspisere dyret. Den detaljerte beskrivelsen av operasjonen som skal utføres i 1.3 til 1.8 kan finnes i Ilatovskaya et al 7.
- Etter riktig anestesi, plasserer dyret på et temperaturkontrollert kirurgisk bordet, lage en midtlinjen snitt av magen (opp til 3 inches i lengde), og avdekke vena cava og aorta.
- Sett ligatur rundt cøliaki og overlegen tarmens arterier og mageaorta ovenfor dem; ikke ligere.
- Blunt dissekere abdominal aorta nedenfor nyrearteriene, og plassere to ligaturer rundt det, men ikke ligere, deretter klemme aorta over ligaturer og slips undertråden.
- Kateter aorta med en polyetylen-PE50 slange (festet til en sprøytepumpe fylt med PBS) under klemmen og feste kateteret med den andre ligaturen; fjerne klemmen, slå på pumpen, og ligate aorta og mesenteriske med cøliaki arterier. Raskt gjøre snitt i nyrevenen å avlaste trykket.
- Sette mot aorta med pre-avkjølt PBS i 2 eller 3 minutter ved en hastighet på 6 ml / min.
- Stopp perfusjon, avgifter og decapsulate 7 nyrene, og sette dem på is i PBS løsning. Avlive dyret i henhold til protokoll godkjennes av IACUC.
2. Isolering av Rat glomeruli
- Forbered 30 ml av frisk oppløsning av 5% BSA i RPMI 1640.
- Ved hjelp av et barberblad og saks,isolere cortex i begge nyrer, og deretter hakke før homogen. Denne prosedyren er beskrevet tidligere 7.
- Skyve vevet hakket under det foregående trinn gjennom en 100 mesh sikt av rustfritt stål (pre-dyppet i 5% BSA / RPMI-løsning) ved hjelp av en spatel. Samle gjennomstrømnings og ved tyngdekraften tillate gjennomstrømning til å passere gjennom en 140 mesh sikt.
- Filtrer gjennomstrømnings innsamlet fra 140 mesh sikt ved hjelp av en pre-fuktet 200 mesh sikt, kast filtratet og vask toppen av sikten med 10 - 15 ml av den fremstilte BSA / RPMI-løsning for å samle opp glomeruli som sedimenterer på silen.
- Sett BSA / RPMI oppløsning innehold glomeruli på is i et 15 ml rør og la glomeruli sediment i bunnen av røret opp til 20 min. Glomeruli konsentratet på bunnen av røret vil være tydelig sees. Fjern overskudd av oppløsningen, som går ca. 2 ml i røret.
3. Single-kanal Patch-clamp Electrophysiology
- Forbered 5 x 5 mm dekkglass chips av belegg dem med MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysin, og la tørke. Bruk omtrent 30 ul av 0,01% sterilfiltrert løsning i vann per dekkglass.
- Varm opp de eksperimentelle løsninger på RT og fylle patch-clamp kammer og pipette. For TRPC kanaler overvåkning ved å bruke et bad løsning, i mM: 126 NaCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glukose, pH 7,4; pipette: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glukose; pH 7,4.
- Legg inhibitorer til pipetten løsning for å blokkere aktiviteten til endogene kanaler, som ikke er relevante for de studier (anbefalte er: 100 uM nifluminsyre eller DIDs (for å blokkere Ca 2 + -aktiverte cl - kanaler), 10 mM TEA (for å hemme høy-konduktans Ca 2 + - avhengig K + kanal), 10 nM iberiotoksin (for å blokkere Ca 2 + -aktiverte K + -kanaler), 10 uM nicardipin (for å blokkere N-type Ca2+ kanaler)) direkte før patch-clamp eksperiment.
- Bland forsiktig glomeruli holdig løsning, og deretter bruke ca 50 mL av den til poly-ʟ-lysin belagt dekkglassbrikker. La glomeruli fest for ca 5 min.
- Flytt glassbitene med glomeruli til patch-clamp kammer forhåndsutfylt med badekar løsning; perfuse kammeret med en hastighet på 3 ml / min i 1 min for å sikre fjerning av ufestede glomeruli.
- Gjennomføre en konvensjonell patch-clamp eksperiment i en celle-tilknyttet mode 7. Med et glass pipette (7-10 Megohm pipette resistens) danner en høyohmig tetning mellom en pipette og et podocyte membran ved påføring av forsiktig suging (en pipette festet til en podocyte på overflaten av den isolerte glomerulus er vist i figur 2, på venstre).
- For celle-tilknyttet målinger, lav-pass strømmene på 300 Hz ved en åtte-pols Bessel-filter.
- Use isolert glomeruli i patch-clamp eksperimenter for opp til 4 - 6 timer. Hold aksje glomeruli brøkdel på is.
4. Proporsjonellekspansjon Confocal fluorescensmålinger av intracellulær kalsiumkonsentrasjon i Podocytes
- Plasser 500 mL av glomeruli fraksjonen (beskrevet i 2.5) i 0,5 ml konisk rør og tilsett kalsiumfargestoffer Fura Red, AM og Fluo-4, AM. Bruk 2 mM og 1 mM konsentrasjoner av Fura Red, AM og Fluo-4, AM, henholdsvis (oppbevar ved -20 ° C, oppløst i DMSO) og bruke 2,5 ul av hver fargestoff for en 500 ul av glomeruli fraksjon. Umiddelbart etter tilsetning av fargestoffer som dekker røret med aluminiumsfolie.
- Plasser rørene på en roterende ryster i minst 20 minutter inntil en time ved RT.
Merk: farmakologiske midler kan tilsettes under dette trinnet. - Forbered dekkglass, dekk dem med poly-ʟ-lysin og la tørke ved hjelp av oppvarmet plate satt til 70 ° C.
- Når lasting av kalsium fargestoffer er komplette, gjelder 100 mL av glomeruli inneholder løsning på poly-ʟ-lysin belagt Dekk og la dem holde seg til overflaten i ca 5 min. Monter glomeruli festet dekk til en avbildnings kammer, og perfuse med badoppløsningen (inneholdende (i mM): 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl2 og 10 HEPES, pH 7,35) ved en hastighet på 3 ml / min for å fjerne den løse glomeruli og de resterende fargestoffer.
- Sett konfokal laser scanning mikroskop til 488 nm eksitasjon bølgelengde og emisjonsfiltre (525/25 og 650/25 nm for Fluo-4 og Fura Red, henholdsvis). Sett bildebehandlingsprogrammer til en ønsket frekvens og oppløsning.
- Finn glomeruli i lysfelt og slå deretter på deteksjon av fluorescens signal. Justere intensiteten av lasers for hver fargestoff for å unngå metning av signalet. Velg fokusplanet med podocytes som er direkte knyttet til glasset. Dette minimerer effekten forårsaket av sammentrekning av en glomerulus i respons til medikamentapplikasjon. Dobbeltsjekk at glomerulus av valget er godt festet til glass;
- Begynn bildebehandling fokalplanet av valg (ta 512 x 512 bilder med frekvensen satt til 4 sek for å visualisere rask Ca 2+ forbigående endringer. Bruk en 60x / NA 1.4 eller lignende objektiv for høyoppløselig bilde), gjelder narkotika av interesse, og registrere responsen.
- Velge en ønsket fokalplan (så nær overflaten av glasset som mulig, for å sikre avbildning av podocytes på overflaten av glomerulus). Sjekk intensiteten av fluorescens på Fluo4 og FuraRed kanaler, og sørg for at glomerulus er tydelig i lysfelt.
- Begynn bildebehandling. Før påføring av noen medikamenter, til posten minst 1 min fra baseline fluorescens sørge for at signalet er stabilt (det er ingen plutselige pigger eller falming av signalet).
- Påfør ønsket narkotika ved hjelp av en mikropipette; være forsiktig og sikre stoffet var i stand til å spre godt og nå glomerUlus. Bland badløsningen forsiktig hvis nødvendig, overvåke valgt fokusplan og sjekk at det ikke flytte ut av fokus på grunn av stoffet søknaden.
- Spill endringene i fluorescens intensitet for Fluo4 og FuraRed signaler. Sørg for at opptaket er lang nok, ved å vente til signalet når platånivå eller når en topp og deretter tilbake til utgangsverdien. Utfør løsning endring eller tillegg av andre rusmidler hvis nødvendig.
- Stoppe innspillingen, og lagre filen i den opprinnelige formatet av programvaren.
5. Bildeanalyse for kalsium Målinger
- Utfør bildeanalyse med ImageJ åpen programvare utstyrt med ND Utility plugin som gjør at du importerer bilder i mors ND2 format.
- Importere bildesekvensen; sørg for å splitte kanalene og bruke en hyperstack gråtoner modus.
- Følg Analyser → Verktøy → ROI sjef banen i ImageJ programvare for å opennen en ROI leder vindu. Velg flere regioner av interesse (podocytes) ved hjelp av en oval utvalg verktøy og "Legg til (t)" -funksjonen i ROI Manager. Som den siste ROI, velge området i bakgrunnen; lagre de valgte Rois (More → Lagre).
- Uthev vindu som inneholder den valgte for analyser kanal. Bruk mer → Multi Mål funksjon i ROI Manager markere "en rad per skive" boksen i dialogen som spretter ut, og klikk deretter OK. Resultatene vil bli vist i det formatet som kan settes opp i Resultater vinduet: inngå menyvalget Resultater → Set Målinger, velg "Mean grå verdi", og beregne pixel intensitetsverdiene for hver ROI, som vil bli vist i Resultater vindu i egne kolonner for hver ROI.
- Kopier de målte ROI intensitetsverdiene for hver kanal (Fluo-4 og Fura Red) inn foretrukne dataanalyse programvare; Trekk fra bakgrunnsintensitetsverdiene fra hver datEt poeng.
- For hvert tidspunkt å beregne forholdet mellom intensitetene av Fluo-4 til Fura Red kanaler. Plot scatter / linje point-tiden endringer av Ca 2+ transient for hver ROI. Beregn Mean / SE verdier for utvalgte glomeruli.
Merk: Tid kolonnen skal settes i henhold til bildefrekvensen valgt til 4,5.
6. intracellulære kalsium Konsentrasjon beregninger ved hjelp Fluo-4 fluorescenssignal
- Ta en prøve av glomeruli og utføre eksperimentelle protokollen opp til trinn 4.7. Etter opptak av bakgrunnsfluorescens legge Ionomycin (sluttkonsentrasjon i badet kammeret bør være 10 pM) til badet løsning, og registrere fluorescens-intensiteten øker. Når intensiteten nådd sitt maksimum og forfallet begynner, legger MnCI2 (endelig konsentrasjon bør være 5 mm) for å slukke den fluorescens 8.
- Analysere data innhentet i 6.1. Kopier Fluo-4 signal ROI intensitet verdier oppnådd i henholdtil den protokoll som er beskrevet i 5.1 til 5.5 ved å foretrukne analyseprogramvare.
- Beregn intracellulær kalsiumkonsentrasjon (i nM) i podocyte svarende til avkastningen ved hjelp av en formel:
hvor K d er en forhåndsbestemt dissosiasjonskonstant for Fluo-4 (345 nM), F er intensitet ved endepunktet som man beregner kalsiumkonsentrasjonen for (baseline), og F, og F min max er intensitetsverdiene ved punktet for maksimal kalsium belastning (etter ionomycin søknad), og etter slukking av fluorescensen (med MnCl2), henholdsvis (se figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her har vi løst problemet med å måle akutte endringer i kalsiumnivået i podocytes. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av den eksperimentelle protokoll utviklet for å utføre høy oppløsning levende fluorescens konfokal avbildning og enkelt ion kanalaktivitet opptak i podocytes av ferskt isolerte gnager glomeruli. I korthet, etter at rotten bedøvet, nyrene skal skylles med PBS for å fjerne dem fra blod. Deretter blir skåret ut og nyrer Decapsulated, og glomeruli er isolert fra nyrebark ved differensiell sikting. En del av prøven kan tas for patch-clamp analyse og resten kan lastes med fluorescerende kalsium fargestoffer Fluo-4, AM og Fura Red, AM for å utføre konfokal proporsjonal kalsium bildebehandling.
Elektrofysiologiske målinger av enkelt ionekanalen aktivitet kan utføres umiddelbart etter isolering av glomeruli. Aktivitet av ion channels kan måles både i celle-festet og hel-celle konfigurasjoner av patch-clamp-metoden. For å demonstrere gjennomførbarheten av tilnærming er vist opptak av enkelt TRPC lignende kalsium-ledende ionekanal-aktivitet (figur 2). I tillegg er det mulig å anvende celle-permeabel eller reseptor-bindende midler for å teste deres virkninger på kalsiuminnstrømningen i podocytes på nivået av enkelt ionekanaler.
En tilnærming som gjør at kun en ionekanal aktivitet vurderingen produserer en rekke data som kan karakterisere podocyte funksjon. Den kan imidlertid bli sterkt suppleres ved å måle kalsiumkonsentrasjonen endringer på nivå av hele celler. For å utføre slike studier, ble nylig isolerte glomeruli lastet med fluorescerende fargestoffer for høy gjennomstrømming confocal bildebehandling. Med en høy optisk oppløsning er det mulig å overvåke kalsiumnivåer i flere podocytes på en gang. Figur 3 viser den tidskurs for typisk forsøk utformet for å evaluere endringer av kalsiumkonsentrasjon innenfor podocyte. Den basale kalsiumkonsentrasjon i podocyte ble evaluert basert på Fluo-4 fluorescens. Etter opptak av basal signalintensiteten for en min (F), blir Ionomycin anvendt og forårsaker maksimal fluorescens (F max) som skal nås, som deretter stanset ved MnCl2 (F min er kjent). I henhold til formelen i 6.3, kan intensiteten i Fluo-4-signalet ved hvert tidspunkt for eksperimentet blir deretter oversettes til den virkelige konsentrasjonen av kalsiumioner i cellen. Som det fremgår av diagrammet, betyr fluorescens i bakgrunnen (ca. 400 vilkårlige enheter) omsettes til 140 nM, som er innenfor et normalt konsentrasjonsområde for intracellulært kalsium hos friske, ikke-apoptotiske celler.
Viktigheten og nytten av den beskrevne tilnærming begrunnes med et annet program, som gjør det mulig for måling av akutt kalsium transients i podocytes som respons på forskjellige legemidler. Figur 4A illustrerer representative bilder av rotte glomerulus farget med Fluo-4 og Fura Red i 2 mM kalsium-inneholdende oppløsning (beskrevet i 4.5) før og etter tilsetning av 10 um ATP. Oppmerksom på en dramatisk økning i den grønne (Fluo-4 AM) fluorescens av podocytes (merket med piler), og et fall i Fura Red fluorescens (rød pseudocolor). Fluo4 og FuraRed reflekterer en økning i kalsiumkonsentrasjonen ved en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm i motsatt retning dvs. når kalsiumkonsentrasjon i cellen øker Fluo 4 intensitet går opp, mens FuraRed går ned. Det er mulig på grunn av dual eksitasjon natur FuraRed fluorophore. Avhengig eksitasjonsbølgelengde kan det oppføre seg som kalsium-bundet (420 nm) eller kalsium-fri (488 nm) fluorofor med tilsvarende økning eller reduksjon i fluorescence. Derfor er bruk av FuraRed alene i en ratiometrisk bildemodus mulig, men det requires to eksitasjonsbølgelengdene - 420 nm og 488 nm. Dette vil redusere hyppigheten av avbildnings minst to ganger (sammenlignet med bruk av en eksitasjonsbølgelengde); hvis forskeren ønsker å beholde den raske tempoet i bildebehandling, bør bildeoppløsningen reduseres. Imidlertid kan Fluo 4 og FuraRed brukes sammen i en proporsjonal modus uten tap av oppløsning eller reduksjon i bildefrekvens, da disse fluoroforer kan bli eksitert ved den samme 488 nm laser, og gir en god differensiering av emisjonsspektrene. En typisk transient oppsummert fra ROIs markert med piler i figur 4A, er vist i figur 4B; grafen viser klart en akutt økning i Fluo4 / FuraRed intensitetsforholdet etter tilsetningen av 10 uM ATP, som brytes ned i løpet av noen minutter. Bilder ble tatt hvert 4. sekund, og således, tillater teknikken observere raske endringer i kalsiumkonsentrasjonen i cellen.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av forsøksprotokollen. Etter at dyret er bedøvet og riktig forberedt for kirurgi, nyrene skylles med PBS for å fjerne blodet. Deretter blir skåret ut og nyrer Decapsulated, og glomeruli er isolert fra nyrebark ved differensiell sikting. Her er en del av prøven tatt for patch-clamp analyse, og resten er lastet med fluorescerende kalsium fargestoffer og konfokal proporsjonal kalsium bildebehandling blir utført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative opptak som viser aktiviteten av TRPC kalsiumkanaler i Podocytes av den ferske isolert rotte glomeruli. Venstre panel demonstrerer patch-clamp pipette festet til podocyte legemet på overflaten av glomerulus under elektrofysiologisk opptak i et celle-tilknyttet konfigurasjon; en del av en kapslet glomerulus kan sees i det nedre høyre hjørnet av bildet. Representative strøm spor av TRPC lignende kanaler aktivitet fra et celle-tilknyttet patch gjort på podocyte til rotten ved en glomerulus -40 mV holder potensialet er vist til høyre. C og o jeg betegne lukkede og åpne kanalnivåer, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representant eksperiment designet for å vurdere den intracellulære kalsiumnivå i de podocytes. For å måle intracellulær kalsiumkonsentrasjon, glomeruli er lastet med Fluo-4, AM, fluorescens intensitet er registrert i baseline og etter tilsetning av ionomycin og MnCl2. Grafen demonstrerer fluorescenssignalet endres i respons til ionomycin (produsere maksimum av Fluo-4 fluorescens, F max) og MnCl2, som slukker fargestoff og resulterer i den laveste fluorescensintensitet (F min). Intensiteten av fluorescens (venstre abscisse) for hvert tidspunkt kan oversettes inn i selve kalsiumkonsentrasjonen i nanomol (høyre abscisse) i henhold til formelen i 6.3. Legg merke til innfellinger med bilder som viser podocytes på de tidspunkter når F, F max og F min ble beregnet. Grafen vist her reflekterer fluorescensintensitet av podocyte markert med en sirkel (ROI); Bildene ble tatt hver 4 sek.nk "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Måling av kalsium transienter i podocytes i respons til ATP. (A) Representative bilder som illustrerer villtype rat glomerulus farget med Fluo-4 (grønn pseudocolor) og Fura Rød (red pseudocolor) i 2 mM kalsium-inneholdende oppløsning før og etter tilsetning av 10 uM ATP. Lavere intensitet grønnfarget fluorescens før påføring av medikamentet bør bemerkes. (B) Sammenfattet eksempel av det intracellulære kalsium transient fremkalt i podocytes ved anvendelse av 10 um ATP. Oppmerksom på en sterk og rask økning i Fluo-4 / Fura Red Fluorescensintensiteten ratio følgende tillegg av stoffet, som står for stimulering og nedbryting av kalsium depot og kalsium tilstrømningen fra the utenfor i cellen, noe som resulterer i økning av den intracellulære kalsiumkonsentrasjon. Feilfelt representerer standard feil av midler beregnet for 11 podocytes av samme glomerulus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode som er beskrevet her gjør det mulig for analyse av kalsium håndtering av podocytes av gnager glomeruli. Denne teknikken tillater bruk av patch-clamp enkelt kanal elektrofysiologi og fluorescens proporsjonal confocal bildebehandling. Imidlertid kan begge tilnærminger brukes separat, på egen hånd. Den foreslåtte protokollen har flere relativt enkle grep, inkludert 1) nyre flush; 2) isolering av glomeruli ved differensial sikting; 3) utføre patch-clamp elektrofysiologiske eksperimenter, eller inkubasjon av glomeruli med fluorescerende kalsium merking fargestoffer for proporsjonal confocal avbildning av endringer i intracellulær kalsium.
For å isolere glomeruli, en modifisert protokoll basert på Gloy et al. 5 ble anvendt. Den største fordelen med den nåværende teknikk for differensial sikting er at den produserer glomeruli strippet av Bowmans kapsel og således ikke krever sofistikert og tidkrevende trinnmanuell decapsulation. Flertallet av glomeruli i den isolerte fraksjonen er Decapsulated, men forskeren må være oppmerksom på at det er capsulated glomeruli, også. Det er viktig å sørge for at glomeruli strippet ut av Bowmans kapsel er avbildet, som kapsel hindrer narkotika fra å nå podocytes. Som vist i figur 2, Decapsulated glomeruli har en ru overflate med distinkte kapillærene og podocyte legemer, mens capsulated glomeruli virke jevn og rund-formet. Videre innkapslet Fluo4 og FuraRed lastet glomeruli avgir mindre intens fluorescens signal i forhold til Decapsulated seg.
Den fraksjon av rotte glomeruli erholdt er 95% rent (med spor av proksimale tubuli), og kan lett brukes for western blotting og andre molekylærbiologiske anvendelser hvis nødvendig. Det er svært viktig at det i dette preparatet podocytes er festet til kapillærene, beholder intakte fot prosesser og funksjon som en delav de innfødte glomerulus filtreringsapparat maskiner. Mekanismene for kalsium håndtering av de podocytes tjene en viktig regulerende rolle i utvikling og forebygging av nyrekomplikasjoner i slike sykdommer som diabetes eller hypertensjon 9-12. Podocytes bidra betydelig til permeabilitet barrierer, noe som gjenspeiles av det faktum at akutt skade endrer podocyte morfologi og struktur og kan forårsake proteinuri 2,3,13-15. Derfor er det av stor betydning å observere responsen av kalsium tilstrømning i disse cellene til narkotika, som lett kan vist i dette preparatet. Det skal forstås at dersom forskeren sonderer podocytes i en patologisk tilstand, for eksempel, hypertensjon eller diabetes, som vanligvis resulterer i proteinuri og glomeruli skader utbyttet av glomeruli kan være mindre ren enn den friske dyr. Det anbefales å alltid overvåke glomeruli fraksjoner på hvert trinn i isolasjon prosessen for å unngå tap avvevet. I noen tilfeller kan sterkt syke glomeruli eller glomeruli fra alderen eller for unge dyr krever individuell tilpasning av isolasjonsprosess, inkludert valg av større / mindre maskesikter.
Vi har anvendt denne metode først for å bestemme effekten av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler ved inhibering av kalsiumkanaler i TRPC podocytes 16. Etter disse studiene 7,16-22 benyttet vi de beskrevne teknikker for å etablere flere kritiske mekanismer som kontrollerer podocytes funksjon. For eksempel har vi beskrevet profilen av P2 (purinergiske reseptorer) i podocytes hos rottene og definert regulering av kalsiuminnstrømningen av Angiotensin II på mus glomeruli. Som beskrevet i et senere manuskript 20, kan protokollen kan tilpasses til å utføre tilsvarende undersøkelser, ikke bare i rotter, men også i andre arter, for eksempel mus. Proporsjonal kalsium fluorescensavbildning (med bruk av to fluorescerendefargestoffer - Fluo-4 og Fura Red) sørger for ekstra påliteligheten av data, og om nødvendig kalsium avbildning kan kombineres med andre fluorescerende fargestoffer for å overvåke endringer i andre stoffer i podocytes. For eksempel har vi brukt denne tilnærmingen til å måle nitrogenoksid med hjelp av DAF-FM fargestoff. Patch-clamp elektro kan anvendes alene eller (setup tillater det) i kombinasjon med kalsium imaging. Bortsett fra kalsiumkanaler, kan den teknikk som opptak av aktiviteten til andre ionekanaler. Videre kan bruken av transfeksjon og siRNA utvide anvendelsesområdet enda mer, som har nylig blitt vist av Dr. Dryer gruppe 23.
Konvensjonell epifluorescence mikroskopi kan brukes her i stedet for mindre rimelig confocal bildebehandling. Imidlertid bør forskeren være klar over at den effektive følsomhet for bredt felt fluorescens mikroskopi er normalt begrenset av ut-av-fokus lys. Dette (i forhold til konfokalmikroskoper Tenk degg) forårsaker slike begrensninger som manglende evne til å produsere høy bildeoppløsning på enkelt ROI (podocyte) eller dets fot prosesser. Videre bred-felt mikroskopi kompliserer identifisering av podocytes som det er vanskelig å skille mellom overflaten av glomerulus og dype vev. Per nå kommersielle tilgjengeligheten av ulike fluoroforene for confocal bildebehandling er mye bedre og raskt voksende. Alternativt kan epifluorescens studier enkelt kombineres med en elektrofysiologisk oppsett som kan gi samtidig intracellulær Ca 2+ og enkelt kanal aktivitet opptak. Fura2-AM lasting av glomeruli podocytes med filter-hjulet monokromatoren og nøytral tetthet filter oppsett er mye brukt, men er ikke alltid egnet for kvaliteten høy oppløsning imaging.
Det skal også bemerkes at det isolerte, funksjonelle glomerulus er i stand til å endre sitt volum som reaksjon på fysiologiske stimuli. Forskeren bør være oppmerksom på dette mens du utførereksperimenter, og nøye velge fokalplanet ved konfokale studier for å unngå tap av fokus, og utføre kontrollforsøk ved valg av nye legemidler for å teste utilsiktet sammentrekning eller avslapning.
Denne teknikken gir en unik mulighet til å overvåke endringer i kalsiuminnstrømningen på enkelt ionekanalen og individuelle celler nivåer etter farmakologisk behandling eller andre manipulasjoner, i en rekke gnagere bakgrunn. Denne teknikken kan også anvendes i human renal sykdom studier som en modifisert protokoll kan anvendes på vev oppnådd fra nyre biopsier, noe som utvilsomt vil gi usedvanlig verdifull informasjon. I tillegg kan kalsium konsentrasjonsmålinger pares med de elektrofysiologiske patch-clamp eksperimenter i sanntid, noe som kan gi mer i dybden og mekanistisk innsikt i reguleringen av kalsium håndtering innen podocytes i normale og patologiske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) for utmerket teknisk assistanse med mikroskopi eksperimenter. Gregory Blass er anerkjent for kritisk korrekturlesing av manuskriptet. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health tilskudd HL108880 og American Diabetes Association gi 1-15-BS-172 (til AS) og Ben J. Lipps Stipendiat fra American Society of Nefrologi (til DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
