Introduction
Nyrer opretholde homeostatiske balance for forskellige stoffer og regulere blodvolumen på en måde, der bestemmer den samlede blodtryk. Forstyrrelser i renal filtration, reabsorption eller sekretion fører til eller ledsage patologiske tilstande, der spænder fra hyper- eller hypotension at ende nyresygdom, som til sidst kræver nyretransplantation. Den renale filtreringsenhed (glomerulus) består af tre lag - den kapillære endotel, basalmembran og en enkelt-celle lag af epitelceller - podocytter, som spiller en vigtig rolle i opretholdelsen af slidsen-membran integritet og funktion 1. Dysfunktion i permselektive glomerulære filter forårsager urin tab af makromolekyler, såsom proteinuri. Forskellige midler kan påvirke strukturen af podocytterne og deres fodprocesser, som er bestemmende integriteten af glomeruli filtrering barriere.
Podocytterne er involveret i opretholdelsen af glomeruli filtrering funktion. Det er blevet fastslået, at forkert calcium håndtering af podocyte fører til celle skade og spiller en vigtig rolle i udviklingen af forskellige former for nefropatier 2,3. Derfor, udvikling af en model, der giver mulighed for direkte måling af intracellulære calciumkoncentration ændringer vil være medvirkende til studier af podocyte funktion. Isolerede glomeruli blev tidligere anvendt i en lang række undersøgelser, herunder måling af albumin refleksion koefficient ændrer 4 og vurdering af integrerede cellulære strømninger i de hel-celle elektrofysiologiske patch-clamp målinger 5,6. I nærværende dokument beskriver vi den protokol, der gør det muligt for forskeren at måle intracellulære calciumkoncentration ændringer i respons på anvendelser af farmakologiske midler, anslår basale niveauer af calcium i cellerne, og vurdere individuelle calciumkanaler aktivitet. Ratometric calciumkoncentration målinger og patch-clamp electrophysiology blev anvendt til at bestemme ændringer i den intracellulære calciumkoncentration i podocyte og kanal aktivitet hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrs brug og velfærd bør holde sig til NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr følgende protokoller anmeldt og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. Nyre Flush
- Bruge 8 til 12 uger gamle hanrotter (foreslået, er en Sprague Dawley-stammen, men andre stammer af forskellig alder og køn kan anvendes med passende ændringer).
- Bedøver dyret ifølge fremgangsmåden tilladt af lACUC protokollen; overvåge dybde af anæstesi og inspicere dyret. Den detaljerede beskrivelse af den operation, der skal udføres i fra 1,3 til 1,8 kan findes i Ilatovskaya et al 7.
- Efter korrekt anæstesi, placere dyret på en temperaturreguleret kirurgisk bord, lave en midtlinjeincision af maven (op til 3 inches i længden), og afdække vena cava og aorta.
- Indsæt ligatur omkring cøliaki og overlegen mesenteriske arterier og den abdominaleaorta over dem; ikke ligere.
- Blunt dissekere den abdominale aorta under nyrearterierne, og placere to ligaturer omkring det, men ikke ligere, så klemme aorta over ligaturer og binde den nederste tråd.
- Selvkaterisation aorta med en polyethylen PE50 slange (knyttet til en sprøjtepumpe fyldt med PBS) under klemmen og fastgør kateteret med den anden ligatur; Fjern klemmen, tænde for pumpen, og liger aorta og mesenteriallymfeknuderne med cøliaki arterier. Hurtigt gøre snit i renal vene at aflaste.
- Tilføre aorta med præ-kølet PBS i 2 eller 3 minutter ved en hastighed på 6 ml / min.
- Stop perfusion, punktafgifter og decapsulate 7 nyrerne, og læg dem på is i PBS-løsningen. Aflive dyret ifølge protokollen er godkendt af IACUC.
2. Isolering af Rat glomeruli
- Forbered 30 ml frisk opløsning af 5% BSA i RPMI 1640.
- Under anvendelse af et barberblad og saks,isolere cortex af begge nyrer, og derefter hakkekød indtil homogen. Denne procedure er blevet beskrevet tidligere 7.
- Skub væv hakket i den foregående trin gennem en 100 mesh sigte af rustfrit stål (præ-gennemvædet i 5% BSA / RPMI opløsning) under anvendelse af en spatel. Opsaml gennemløbet og ved tyngdekraften tillader gennemstrømning til at passere gennem en 140 mesh sigte.
- Filtrer gennemløbet indsamlet fra 140 mesh sien under anvendelse af en præ-gennemblødt 200 mesh sigte, filtratet kasseres, og vask toppen af sigten med 10 - 15 ml af den fremstillede BSA / RPMI løsning til opsamling af glomeruli, der sedimenterer på sien.
- Sætte BSA / RPMI opløsning indeholdende glomeruli på is i et 15 ml rør og lad glomeruli sediment i bunden af røret i op til 20 min. Glomeruli koncentrat på bunden af røret vil ses tydeligt. Fjerne overskydende opløsning, hvorefter ca. 2 ml i røret.
3. Single-kanals Patch-clamp Electrophysiology
- Forbered 5 x 5 mm cover glaschips ved at overtrække dem med MW 70.000 - 150.000 poly-ʟ-lysin, og lad tørre. Brug ca. 30 ul 0,01% steril filtreret opløsning i vand pr dækglas.
- Varm op de eksperimentelle løsninger på RT og fylde patch-clamp kammer og pipette. Til overvågning TRPC kanaler, brug en badopløsning, i mM: 126 NaCI, 1 CaCl2, 10 HEPES, 2 MgCl2, 10 glucose, pH 7,4; pipette: 126 NaCl, 1,5 CaCl2, 10 HEPES, 10 glucose; pH 7,4.
- Føj hæmmere til pipette løsning til at blokere aktiviteten af endogene kanaler, som ikke er relevante for undersøgelser (anbefales, er: 100 pM nifluminsyre eller DIDS (for at blokere Ca 2+ -aktiverede Cl - kanaler), 10 mM TEA (til at hæmme store konduktans Ca 2 + - afhængig K + kanal), 10 nM iberiotoksin (at blokere Ca 2 + -aktiverede K + kanaler), 10 uM nicardipin (til at blokere N-type Ca2+ kanaler)) direkte før patch-clamp eksperiment.
- Bland forsigtigt glomeruli-opløsning, og derefter anvende ca. 50 ul det til poly-ʟ-lysin coatede dækglas chips. Lad glomeruli binde i ca. 5 min.
- Flyt glas chips med glomeruli til patch-clamp kammer fyldt med bad opløsning; perfundere kammeret ved en hastighed på 3 ml / min i 1 min for at sikre fjernelse af ikke-fastgjorte glomeruli.
- Gennemføre en konventionel patch-clamp eksperiment i en celle-attached tilstand 7. Med et glas pipette (7-10 MOhm pipette resistens) danner en høj modstand forsegling mellem en pipette og et podocyte membran ved at tilføre et let sugning (en pipette fastgjort til en podocyte på overfladen af den isolerede glomerulus er vist i figur 2, om venstre).
- For celle- vedhæftede målinger, low-pass strømmene ved 300 Hz ved en otte-polet Bessel-filter.
- USE isoleret glomeruli i patch-clamp-forsøg i op til 4 - 6 timer. Hold fraktion bestanden glomeruli på is.
4. Ratiometrisk Konfokal fluorescensmålinger af intracellulære calciumkoncentration i podocytterne
- Placer 500 pi glomeruli fraktion (beskrevet på 2,5) i 0,5 ml konisk rør og tilsæt calcium farvestoffer Fura Red, AM og Fluo-4, AM. Bruge 2 mM og 1 mM stamopløsning koncentrationer af Fura Red, AM og Fluo-4, AM, henholdsvis (opbevares ved -20 ° C, opløst i DMSO) og bruge 2,5 pi af hver farve til en 500 pi glomeruli fraktion. Umiddelbart efter tilsætning af farvestofferne dækker røret med aluminiumsfolie.
- Rørene anbringes på et roterende rysteapparat i mindst 20 min op til 1 time ved stuetemperatur.
Bemærk: Farmakologiske midler kan tilsættes under dette trin. - Forbered dækglas, dække dem med poly-ʟ-lysin og tillade tørring ved hjælp opvarmet plade sæt til 70 ° C.
- Når lastning af calcium farvestoffer er complete, anvendes 100 pi glomeruli indeholdende løsning på poly-ʟ-lysin overtrukne dækglas og lad dem klæbe fast til overfladen i ca. 5 minutter. Mount glomeruli grupperne dækglas i et billeddannende kammer, og perfundere med badopløsningen (indeholdende (i mM): 145 NaCI, 4,5 KCI, 2 MgCl2, 10 HEPES, pH 7,35) med en hastighed på 3 ml / min for at fjerne antennens frie glomeruli og de resterende farvestoffer.
- Indstil konfokal laser scanning mikroskop til en 488 nm excitation bølgelængde og emissionsfiltre (525/25 og 650/25 nm for Fluo-4 og Fura Red henholdsvis). Indstil imaging software til en ønsket frekvens og opløsning.
- Find glomeruli i lysfelt og tænd derefter påvisning af fluorescens-signalet. Justere intensiteten af laseren for hvert farvestof for at undgå mætning af signalet. Vælg brændplanet med podocytterne som er direkte knyttet til glasset. Dette minimerer effekten forårsaget af sammentrækning af en glomerulus som reaktion på lægemidletansøgning. Dobbelttjekke, at glomerulus valg er godt fastgjort til glasset;
- Start imaging brændplanet valg (tage 512 x 512 billeder med den hyppighed fastsat til 4 sek at visualisere hurtigt Ca2 + forbigående forandringer. Brug en 60X / NA 1.4 eller lignende objektiv til høj opløsning billede), gælder narkotika af interesse, og optage svaret.
- Vælg en ønsket fokusplan (så tæt på overfladen af glasset som muligt, for at sikre billeddannelse af podocytter på overfladen af glomerulus). Kontroller intensiteten af fluorescens på Fluo4 og FuraRed kanaler, og sørg for, at glomerulus tydeligt ses i brightfield.
- Start billeddannelse. Før anvendelsen af eventuelle medicin, at optage mindst 1 min af baseline fluorescens sørge for, at signalet er stabilt (der er ingen pludselige spikes eller fading af signalet).
- Påfør ønskede lægemidler ved hjælp af en mikropipette; være forsigtige og sikre lægemidlet var i stand til at diffundere godt og nå glomerUlus. Bland badet løsningen forsigtigt hvis det er nødvendigt, at overvåge den valgte brændplanet og kontrollere, at det ikke flytter ud af fokus på grund af ansøgningen lægemidlet.
- Registrere ændringer i fluorescensintensitet for Fluo4 og FuraRed signaler. Sørg for, at optagelsen er lang nok, ved at vente, indtil signalet når plateauet-niveau eller når et højdepunkt, og vender derefter tilbage til baseline. Udfør løsning ændring eller tilføjelse af andre lægemidler, hvis nødvendigt.
- Stoppe optagelsen, og gemme filen i det oprindelige format af softwaren.
5. Image Analysis for Calcium Målinger
- Udføre billedanalyse med ImageJ åben software installeret på ND Utility plugin, der giver mulighed for at importere billeder i den native ND2 format.
- Importer billedsekvens; Sørg for at opdele kanaler og bruge en hyperstack gråtoner mode.
- Følg Analyze → Værktøjer → ROI Manager sti i ImageJ software til at open et ROI leder vindue. Vælg flere regioner af interesse (podocytter) ved hjælp af en oval markeringsværktøj og "Tilføj (t)" funktion i ROI Manager. Som den sidste ROI, vælge det område i baggrunden; gemme de udvalgte ROIs (More → Gem).
- Fremhæv vinduet med det valgte til analyser kanal. Brug Mere → Multi Mål funktion i ROI Manager markere "en række pr skive" boksen i dialogen, der springer ud, og klik derefter på OK. Resultaterne vil blive vist i det format, der kan sættes op i Resultater vinduet: gå ind i menupunktet Resultater → Set Målinger, skal du vælge "Mean grå værdi" og beregne pixel intensitet værdier for hver ROI, som vil blive vist i Resultater vindue i separate kolonner for hver ROI.
- Kopiere de målte ROI intensitetsværdierne for hver kanal (Fluo-4 og Fura Red) til foretrukne dataanalyse software; Fratræk baggrund intensitetsværdier fra hver datet punkt.
- For hvert tidspunkt beregne forholdet mellem intensiteter af Fluo-4 til Fura Red kanaler. Plot scatter / line point-time ændringer af Ca 2+ forbigående for hver ROI. Beregn Mean / SE-værdier for udvalgte glomeruli.
Bemærk: Time kolonne skal indstilles i henhold til billedbehandling frekvens valgt på 4,5.
6. Intracellulære calciumkoncentration beregninger vha Fluo-4 Fluorescenssiqnal
- Tage en prøve af glomeruli og udfører eksperimentelle protokol op til trin 4.7. Efter registrering af baggrundsfluorescens tilføje ionomycin (slutkoncentration i badkammeret bør være 10 uM) til badet opløsning og optage fluorescensintensitet stigning. Når intensiteten når sit maksimum og henfald begynder, tilsættes MnCl2 (slutkoncentration bør være 5 mM) til standsning af fluorescens 8.
- Analysere data opnået i 6.1. Kopier Fluo-4 signal ROI intensitet værdier opnået eftertil protokollen beskrevet på 5,1-5,5 ved foretrukne analyse software.
- Beregn intracellulære calciumkoncentration (i nM) i podocyte svarer til ROI hjælp af en formel:
hvor K d er en forudbestemt dissociationskonstant for Fluo-4 (345 nM), F er intensiteten på tidspunkterne, du beregne calciumkoncentrationen for (baseline), og F min og F max er intensitetsværdierne på punktet for maksimal calcium belastning (efter ionomycin ansøgning) og efter standsning af fluorescens (med MnCl2), henholdsvis (se figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her behandles vi problemet med at måle akutte ændringer i calcium niveauer i podocytterne. Figur 1 viser en skematisk fremstilling af den eksperimentelle protokol designet for at udføre høj opløsning levende fluorescens konfokal billeddannelse og enkelt ionkanalaktivitet optagelser i podocytterne af frisk isolerede gnavere glomeruli. Kort fortalt, efter at rotten er bedøvet, nyrerne bør skylles med PBS for at rense dem for blod. Derefter nyrerne udskåret og decapsulated, og glomeruli isoleres fra nyre cortex ved differentiel sigtning. En del af prøven kan tages for patch-clamp-analyse og resten kan belastes med fluorescerende calcium farvestoffer Fluo-4, AM og Fura Red, AM for at udføre konfokal ratiometrisk calcium billeddannelse.
Elektrofysiologiske målinger af enkelt ionkanalaktivitet kan udføres straks efter isolering af glomeruli. Aktivitet af ion chakan måles nnels både celle-bundet og hel-celle-konfigurationer af patch-clamp-metode. At demonstrere muligheden for tilgangen vist er optagelsen af den fælles TRPC-lignende calcium-ledende ionkanalaktivitet (figur 2). Desuden er det muligt at anvende celle-permeable eller receptor-bindende lægemidler til at teste deres virkninger på calciumindstrømning i podocytterne på niveauet af enkelte ionkanaler.
En tilgang, der tillader vurdering enkelt ionkanalaktivitet producerer en række forskellige data, der kan karakterisere podocyte funktion. Det kan imidlertid være meget suppleret ved måling af calciumkoncentration ændringer på niveauet for de hele celler. For at udføre sådanne undersøgelser blev frisk isolerede glomeruli fyldt med fluorescerende farvestoffer til high throughput konfokal billeddannelse. Med en høj optisk opløsning er det muligt at overvåge calciumniveauer i flere podocytter ad gangen. Figur 3 viser tids-kursus for den typisk forsøg designet til at vurdere ændringer i calciumkoncentration i podocyte. Den basale calciumkoncentration i podocyte blev evalueret på grundlag af Fluo-4 fluorescens. Efter optagelse basal signalintensitet i 1 min (F), er ionomycin anvendes og forårsager peak fluorescens (F max), der skal nås, som derefter standset ved MnCI2 (F min bemærkes). Ifølge formlen i 6.3, kan intensiteten af Fluo-4 signal på hvert tidspunkt af eksperimentet skal efterfølgende omregnes til den faktiske koncentration af calciumioner i cellen. Som det ses af grafen, betyder fluorescens i baggrunden (ca. 400 arbitrære enheder) svarer til 140 nM, hvilket er inden for et normalt koncentrationsområde til intracellulær calcium i raske ikke-apoptotiske celler.
Betydningen og nytten af den beskrevne fremgangsmåde er begrundet i et andet program, som giver mulighed for måling af akut calcium transients i podocytter som reaktion på forskellige stoffer. Figur 4A illustrerer repræsentative billeder af rotte glomerulus farvet med Fluo-4 og Fura Rød i 2 mM calcium-indeholdende opløsning (beskrevet i 4.5) før og efter tilsætning af 10 um ATP. Bemærk en dramatisk stigning i grøn (Fluo-4 AM) fluorescens af podocytterne (markeret med pile), og et fald i Fura Red fluorescens (rød pseudofarve). Fluo4 og FuraRed afspejler en stigning i calciumkoncentration ved en excitationsbølgelængde på 488 nm i modsatte måde dvs. når calciumkoncentration i cellen stiger Fluo 4 intensitet går op, mens FuraRed går ned. Det er muligt på grund af dobbelte excitation natur FuraRed fluoroforen. Afhængig excitationsbølgelængden det kan opføre sig som calcium-bundet (420 nm) eller calcium-fri (488 nm) fluorfor med tilsvarende stigning eller et fald i fluorescens. Derfor er det muligt at anvende FuraRed alene i en ratiometrisk billeddannelse tilstand, men det requires to excitationsbølgelængder - 420 nm og 488 nm. Dette vil nedsætte hyppigheden af billeddannelse mindst to gange (sammenlignet med brugen af en excitationsbølgelængde); hvis forskeren ønsker at beholde den hurtige billedbehandling, bør reduceres billedets opløsning. Imidlertid kan Fluo 4 og FuraRed blive anvendt sammen i en ratiometrisk tilstand uden tab af opløsning eller et fald i billeddannelsesfrekvens, da disse fluorophorer kan exciteres af den samme 488 nm laser, og giver en god differentiering af emissionsspektrene. En typisk transient i et sammendrag af ROI'er markeret med pile i figur 4A er vist i figur 4B; grafen viser klart en akut stigning i Fluo4 / FuraRed intensitetsforhold efter tilsætning af 10 uM ATP, som henfalder i løbet af nogle minutter. Billeder blev taget hver 4 sek, og dermed tillader teknikken observere hurtige ændringer i calciumkoncentration i cellen.
Figur 1. Skematisk fremstilling af forsøgsprotokollen. Efter at dyret er korrekt bedøvet og forberedt til kirurgi, er nyrerne skyllet med PBS for at fjerne blod. Derefter nyrerne udskåret og decapsulated, og glomeruli isoleres fra nyre cortex ved differentiel sigtning. Her en del af prøven taget til patch-clamp-analyse, og resten er fyldt med fluorescerende calcium farvestoffer og konfokal ratiometrisk calcium billeddannelse udføres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentativ optagelse, der viser aktiviteten af TRPC calciumkanaler i Podocytes af frisk isolerede rotte glomeruli. Venstre panel viser patch-clamp pipette fastgjort til podocyte organ på overfladen af glomerulus under en elektrofysiologiske optagelse i en celle-attached konfiguration; en del af en indkapslet glomerulus kan ses i nederste højre hjørne af billedet. Repræsentativ nuværende spor af TRPC-lignende kanaler aktivitet fra en celle-attached plaster foretaget på podocyte af rotte glomerulusen ved en -40 mV holdepotentiale er vist til højre. C og o jeg betegne lukkede og åbne kanalniveauer henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. repræsentativt forsøg designet til at vurdere det intracellulære calciumniveau i podocytterne. For at måle intracellulær calciumkoncentration, glomeruli er fyldt med Fluo-4, AM, fluorescensintensiteten er registreret i baseline og efter tilsætning af ionomycin og MnCl2. Grafen viser fluorescenssignalet ændringer som reaktion på ionomycin (fremstilling maksimum af Fluo-4-fluorescens, F max) og MnCl2, som quencher farvestof og resulterer i den laveste fluorescensintensitet (F min). Fluorescensintensitet (venstre abscisse) for hvert tidspunkt kan oversættes til det faktiske calciumkoncentration i nanomol (højre abscisse) i henhold til formlen i 6.3. Bemærk mellemværker med billeder, der viser podocytter ved de tidspunkter, hvor F, F max og F min blev beregnet. Den her viste graf afspejler fluorescens intensitet podocyte markeret med en cirkel (ROI); billeder blev taget hver 4 sek.nk "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Måling af calcium transienter i podocytterne som respons på ATP. (A) Repræsentative billeder, der illustrerer vildtype rotte glomerulus farvet med Fluo-4 (grøn pseudofarve) og Fura Red (rød pseudofarve) i 2 mM calcium-indeholdende opløsning før og efter tilsætning af 10 uM ATP. Lavere intensitet grøn-farvet fluorescens før påføring af lægemidlet bør bemærkes. (B) sammendragne eksempel på den intracellulære calcium forbigående fremkaldt i podocytter ved anvendelse af 10 um ATP. Bemærk en stærk og hurtig stigning i Fluo-4 / Fura Red fluorescensintensitet forholdet efter tilsætning af lægemidlet, som tegner sig for stimulering og udtynding af calcium depot og calciumindstrømning fra the udenfor i cellen, hvilket resulterer i forhøjelse af den intracellulære calciumkoncentration. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af midler beregnet for 11 podocytter af samme glomerulus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne fremgangsmåde giver mulighed for analyse af calcium håndtering af podocytterne af gnaver glomeruli. Denne teknik tillader anvendelse af patch-clamp enkelt kanal elektrofysiologi og fluorescens ratiometrisk konfokal billeddannelse. Dog kan begge tilgange anvendes separat, på egen hånd. Den foreslåede protokol har flere relativt enkle trin, herunder 1) nyre flush; 2) isolering af glomeruli ved differentiel sigtning; 3) kan udføre patch-clamp elektrofysiologiske eksperimenter eller inkubering af glomeruli med fluorescerende calcium mærkning farvestoffer til ratiometrisk konfokal billeddannelse af ændringer i intracellulært calcium.
At isolere glomeruli, en modificeret protokol baseret på Gloy et al. 5 blev anvendt. Den største fordel ved den nuværende teknik med differentieret sigtning er, at den producerer glomeruli strippet af Bowmans kapsel og kræver således ikke den sofistikerede og tidskrævende trinaf manuel decapsulation. Størstedelen af glomeruli i den isolerede fraktion decapsulated dog forskeren skal være opmærksom på, at der er indkapslede glomeruli, også. Det er vigtigt at sørge for, at de glomeruli strippet ud af Bowmans kapsel er afbildet, som kapsel forhindrer stoffer i at nå podocytterne. Som det ses i figur 2, decapsulated glomeruli have en ru overflade med tydelige kapillærer og podocyte organer, hvorimod indkapslede glomeruli synes glat og rund. Endvidere indkapslet Fluo4 og FuraRed indlæst glomeruli udsender mindre intens fluorescens signal sammenlignet med decapsulated dem.
Fraktionen af rotte glomeruli opnåede 95% ren (med spor af proksimale tubuli) og kan let anvendes til western blotting eller andre molekylærbiologiske applikationer, hvis nødvendigt. Det er usædvanligt vigtigt, at podocytter i dette præparat er knyttet til kapillærerne, fastholde intakte fodprocesser og funktion som en delaf det native glomerulus filtreringsapparat maskiner. Mekanismerne af calcium håndtering af podocytterne tjener en væsentlig regulerende rolle i udviklingen og forebyggelse af renale komplikationer i sådanne sygdomme som diabetes eller hypertension 9-12. Podocytter bidrage væsentligt til barrierer permeabiliteten, hvilket fremgår af det faktum, at akut skade ændrer podocyte morfologi og struktur og kan forårsage proteinuri 2,3,13-15. Det er derfor af stor betydning at observere reaktionsevne caiciumindstrømning i disse celler til lægemidler, som let kan screenes i dette præparat. Det skal forstås, at hvis forskeren sondering podocytter i en patologisk tilstand, eksempelvis hypertension eller diabetes, hvilket resulterer sædvanligvis i proteinuri og glomeruli skader, udbyttet af glomeruli kan være mindre ren end de raske dyr. Det anbefales altid at overvåge glomeruli fraktioner i hver fase af isolation proces for at undgå tab afvævet. I nogle tilfælde kan kraftigt syge glomeruli eller glomeruli fra ældede eller for unge dyr kræver individuel tilpasning af isolation proces, herunder udvælgelse af større / mindre mesh sigter.
Vi har anvendt denne fremgangsmåde i første omgang at bestemme effektiviteten af ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler til inhibering af calcium TRPC kanaler i podocytter 16. Efter disse undersøgelser 7,16-22 beskæftigede vi de beskrevne teknikker til at etablere flere kritiske mekanismer, der styrer podocytter funktion. For eksempel har vi beskrevet profil P2 (purinergiske) receptorer i podocytterne rotternes og defineret reguleringen af calcium tilstrømning af angiotensin II i musen glomeruli. Som beskrevet i et senere manuskript 20, kan protokollen blive indrettet til at udføre lignende undersøgelser ikke blot i rotter, men også i andre arter, såsom mus. Ratiometrisk calcium fluorescensimagografi (med anvendelse af to fluorescerendefarvestoffer - Fluo-4 og Fura Red) sikrer ekstra pålidelige data, og om nødvendigt calcium imaging kan kombineres med andre fluorescerende farvestoffer til at overvåge ændringer i andre stoffer inden podocytterne. For eksempel har vi anvendt denne metode til at måle nitrogenoxid ved hjælp af DAF-FM farvestof. Patch-clamp elektrofysiologi kan anvendes alene eller (opsætning tillader det) i kombination med calcium imaging. Bortset fra calciumkanaler, teknikken tillader registrering af aktiviteten af andre ionkanaler. Endvidere kan anvendelsen af transfektion og siRNA udvide anvendelsesområdet endnu mere, som det for nylig blevet vist af Dr. Dryer gruppe 23.
Konventionel epifluorescensmikroskopi kan anvendes her i stedet for den mindre overkommelige konfokal billeddannelse. Imidlertid bør forskeren være opmærksom på, at den effektive følsomhed bredt felt fluorescensmikroskopi generelt er begrænset af ude-af-fokus lys. Dette (i forhold til konfokal imaging) forårsager sådanne begrænsninger som manglende evne til at producere høj billedopløsning på enkelt ROI (podocyte) eller dens mund processer. Endvidere wide-field mikroskopi komplicerer identifikation af podocytter som det er svært at skelne mellem overflade af glomerulus og dybe væv. Som nu er meget bedre og hurtigt voksende kommercielle tilgængelighed af forskellige fluoroforer for konfokal billeddannelse. Alternativt kunne epifluorescens undersøgelser let kombineres med en elektrofysiologisk setup, som kan give samtidig intracellulær Ca2 + og enkelt kanal aktivitet optagelse. Fura2-AM lastning af glomeruli podocytter med filter-wheel monokromator og neutral tæthed filtre setup er meget udbredt, men er ikke altid egnet til kvaliteten høj opløsning billeddannelse.
Det skal også bemærkes, at det isolerede, funktionelle glomerulus er i stand til at ændre sit volumen som reaktion på fysiologiske stimuli. Forskeren skal være opmærksom på dette, mens udførereksperimenter, og omhyggeligt vælge brændplanet under konfokale undersøgelser for at undgå tab af fokus og udføre kontrol eksperimenter ved udvælgelse af nye lægemidler for at teste utilsigtet sammentrækning eller afslapning.
Denne teknik giver en unik mulighed for at overvåge ændringer i calcium tilstrømning på enkelt ionkanal og individuelle celler niveauer efter farmakologiske behandlinger eller andre manipulationer, i en række forskellige gnavere baggrunde. Denne teknik kan også anvendes i nyresygdom undersøgelser humane som en modificeret protokol kan anvendes på væv fra nyre biopsier, som utvivlsomt vil give usædvanligt værdifulde oplysninger. Derudover kunne calcium koncentrationsmålinger parres med de elektrofysiologiske patch-clamp-forsøg i realtid, som kan give mere dybdegående og mekanistisk indsigt i reguleringen af calcium håndtering inden podocytter i normale og patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) og Colleen A. Lavin (Nikon Instruments, Inc.) for fremragende teknisk bistand med mikroskopi eksperimenter. Gregory Blass er anerkendt for kritisk korrekturlæsning af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health tilskud HL108880 og American Diabetes Association giver 1-15-BS-172 (AS) og Ben J. Lipps Research Fellowship fra American Society of Nefrologisk (til DVI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| FuraRed AM | Life Technologies | F-3020 | |
| Poly-ʟ-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Pluronic acid | Sigma-Aldrich | F-68 | solution |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I3909-1ML | |
| Tube rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | Germany |
| Nikon confocal microscope (inverted) | Nikon | Nikon A1R | Laser exitation 488 nm. Emission filters 500-550 nm and 570-620 nm |
| Objective | Nikon | Plan Apo 60x/NA 1.4 Oil | |
| Cover Glass | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | Silicone Compound | |
| Software | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Low pass filter | Warner Instruments | LPF-8 | 8 pole Bessel |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Japan |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microvibration isolation table | TMC | equipped with Faraday cage | |
| Multichannel valve perfusion system | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 | |
| Iberiotoxin | Sigma | I5904-5UG | |
| Niflumic acid | Sigma-Aldrich | N0630 | |
| DIDS | Sigma-Aldrich | D3514-25MG | |
| TEA chloride | Tocris | T2265 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11835030 | without antibiotics |
| BSA | Sigma-Aldrich | A8327 | 30% albumin solution |
| Temperature controlled surgical table | MCW core | for rodents | |
| Steel sieves: | #100 (150 μm), 140 (106 μm) | ||
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200 | Fisher Sci | 50-871-316 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270 | Fisher Sci | 50-871-318 | |
| Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400 | Fisher Sci | 50-871-320 | |
| mesh 200 | Sigma-Aldrich | s4145 | screen for CD-1 |
| Binocular microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Binocular microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Syringe pump-based perfusion system | Harvard Apparatus | ||
| Polyethylene tubing | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Isofluorane anesthesia |  VetEquip, Inc. |
911103 | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
- Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
- Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
- Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
- Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
- Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
- Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
- Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
- Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
- Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
- Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771 (2009).
- Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
- Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
- Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
- Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
- Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
- Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
- Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
- Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
- Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
- Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).
