Summary

Метод Дистанционно заставить замолчать нейронной активности в течение Грызуны дискретных фаз обучения

Published: June 22, 2015
doi:

Summary

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Abstract

Этот протокол описывает, как временно, так и удаленно заглушить нейронную активность в дискретных областях головного мозга, а животные занимаются обучения и памяти задач. Подход сочетает в себе фармакогенетика (Дизайнер-Рецепторы-Эксклюзивно-активированный-на-Designer-препараты) с поведенческой парадигмы (сенсорной) предварительной, которая предназначена для дифференциации между различными формами обучения. В частности, вирусной опосредованной доставки используется, чтобы выразить генетически модифицированных тормозящее G-белком рецептор (рецептор конструктор) в дискретной области головного мозга в грызуна. Через три недели, когда уровни экспрессии рецепторов дизайнер высоки, фармакологический агент (наркотика) вводят системно 30 мин до определенной поведенческой сессии. Препарат обладает сродством к рецептору дизайнера и, таким образом, приводит к ингибированию нейронов, которые экспрессируют рецептор конструктора, но в остальном биологически инертным. Область мозга остается замолчать в течение 2-5 ч (висимостьдинь от дозы и пути введения). После завершения поведенческой парадигмы, ткани мозга оценивали для правильного размещения и экспрессии рецепторов. Этот подход особенно полезен для определения вклада отдельных областей мозга в конкретных компонентов поведения и может быть использован в любом числе поведенческих парадигм.

Introduction

Захватывающая задача в области поведенческой неврологии является определение нейронных субстратов сложным поведением. Количество таких методов, как постоянных поражений, временный инактивации мозга через канюли имплантатов и оптогенетика были использованы для идентификации вклад дискретных областей мозга, чтобы подкомпонентами сложным поведением. Хотя эти подходы наше понимание региональной специфики в ходе обучения, каждый метод не без ограничений. В частности, постоянные поражения, как правило, проводиться до поведенческим тестированием, таким образом, их действие присутствует в течение всего периода парадигмы. Катетеризация исследования, которые включают представление краткосрочной нервной инактиватора (например, тетродотоксин) может производить значительный ущерб ткани мозга и могут вызвать стресс у субъектов только до поведенческого тестирования. Кроме того, инактивации через канюлю ограничено области ткани, которая окружаетКончик канюли. Наконец, в то время как оптогенетика предлагает широкий выбор гибкости для временной контроля деятельности в конкретных областях мозга, она является экономически и технически непомерно требовательных.

Эти ограничения могут быть преодолены с помощью фармакогенетический подход (дизайнер-рецепторов-Исключительно активированные-на-Designer-наркотики, DREADDs) 1,2. Важно отметить, что в то время как концепция фармакогенетики является сложной, выполнение техники проста. Подобно традиционным стереотаксических хирургических методов, которые включают вливание токсина (например, NMDA, иботеновой кислоты) в дискретных областях головного мозга, этот метод включает привнесение в аденоассоциированный вирус (AAV), который содержит ДНК-фрагмент, модифицированный ингибирующее G-белком рецептор (hM4Di; дизайнер-рецептор) в области интереса стандартных лабораторных грызунов (рисунок 1). Вирусный вектор также содержит флуоресцентный репортер (mcitrine). После того, как включены вк клеткам, проектировщик рецепторов (и репортерный белок) максимально выражены ~ 3 недели после инфузии, и может быть избирательно активированы в течение 2-5 ч при системном введении в противном случае биологически инертного наркотика, клозапин-N-оксида (CNO) 1 3. Потому что экспериментатор наделен точной, но удаленной временной контроль над нервной деятельности в конкретных областях мозга, фармакогенетика сочетает особенно хорошо с поведенческими парадигмами, которые проводятся в несколько этапов. В этом примере, вклад ретроспленальной коры (РКК) на стимул-раздражитель обучение по сравнению с его ролью в павловской обучения, однако это сочетание подходов, хорошо подходит для любого количества вопросов, которые стремятся определить, каким образом конкретные области мозга способствуют сложное поведение.

Кроме того, в то время как не описано в данном протоколе, вирусные и трансгенные подходы могут быть использованы для достижения типа клеток конкретных DREADD выражение 2. Как и яс присущ поведенческих парадигм, которые включают фармакологические и / или другие типы экспериментальных манипуляций, тщательного рассмотрения эксперимента и последующего количественного анализа требуется при использовании подход DREADD. Экспериментаторы новые для подхода DREADD называют всеобъемлющего обзора современных технологий DREADD 2.

Каждый день, организмы узнать о новых стимулов и событий и их отношений друг к другу. Даже в знакомой среде, такие как дом, один быстро обнаружить изменения в отношениях между стимулами, потому что эти изменения могут быть предиктором значимых событий. Такой стимул-раздражитель (т.е., реляционная) обучения включает в себя conjoining нескольких стимулов и традиционно ассоциируется с гиппокампе, который находится в центре в медиальной височной доле 4. Тем не менее, гиппокамп не существует ни действовать в одиночку; области коры как в пределах и внесторона медиальной височной доле обеспечить критическую сенсорную информацию к гиппокампа 5-7. Традиционные постоянные исследования поражения убедительно доказательства причастности ряда корковых областей (например, ретроспленальной, postrhinal и энторинальной коры) в гиппокампе зависит от обучения, но ограничены в своей способности различать роль конкретного региона в дискретных фаз обучение 8-10.

Настоящий протокол проверяет гипотезу о том, что РКК необходимо для стимула стимула обучения по замолчать RSC во время одной фазы в 3-фазных сенсорная предварительной подготовки парадигмы 11,12. Вкратце, крысам настои из AAV, который содержит конструктор рецептор и ~ 3 недели вводят дизайнер наркотиков (CNO) за 30 мин до начала поведенческого тестирования. В настоящем протоколе, экспериментальные крысы получали CNO в ходе первого этапа тестирования (когда стимул-раздражитель ЛирНин происходит), и они получают автомобиль в течение следующих 2 фазы тестирования. Для контроля непреднамеренных последствий CNO на поведение, настоять крыс с дизайнером рецептора (hM4Di) и ввести с автомобиля, а не CNO. Для учета общего влияния вирусной инфузии и экспрессии рецепторов, настоять вирус управления, не содержит конструктор рецептор и управлять CNO.

Ряд различных серотипов AAV используются для доставки генетического материала. Текущие NIH Руководство для исследований с участием рекомбинантных или синтетических молекул утверждает, что AAV (всех серотипов) и рекомбинантных или синтетических AAV конструкции, в которых трансген не кодирует либо потенциально онкогенного генный продукт или молекулы токсина и производятся в отсутствие помощник вирус, требуют BSL-1 предосторожности (Приложение B-1. Группа риска 1 (Rg1) Агенты) 13. Количество отзывов, относящихся к структуре AAV, полезности и безопасности доступны 14,15. Примечательно, хотя, Из-за проблем, связанных с возможными репродуктивных 16,17 и потенциальных канцерогенных механизмов 18-20 у грызунов, некоторые учреждения требуют использования BSL-2 меры предосторожности при работе с AAV. Убедитесь в правильности BSL до использования путем консультаций с комитетами по надзору в отдельных учреждениях, где проводятся такие исследования, Центры по контролю за заболеваниями и НИЗ Руководства для исследований с участием рекомбинантных ДНК Молекулы 13 при использовании вирусных векторов для манипуляции генов в Соединенных Штатах. Личная защита, следователь подготовки, вектор сдерживания, обезвреживание, размещение в очищенных материалов, и после инъекции животных требования на жилье указаны в этих руководящих принципов. Кроме того, консультации и следуйте соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета руководящие принципы или эквивалентные руководящие организационные Комитет по надзору для обеспечения безопасной обработки, управления и распоряжения AAV.

Protocol

Использование животных утверждаются Оберлин колледжа Уходу за животными и использованию комитета и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных 21. 1. Подготовка к вирусным инфузии Примечание: Этот протокол использу?…

Representative Results

Поведенческие результаты По окончании эксперимента, эффективность области конкретных временной инактивации должно быть количественно и качественно оценить. Настоящий пример предполагает 3-фазный поведения парадигму (сенсорная предобусловливания), в котором CNO вводили…

Discussion

Этот протокол описывает, как применять подход фармакогенетический (DREADD), чтобы исследовать, как конкретного региона мозга способствует многофазной задачи комплексно обучения. С возможностью временно, так и удаленно заглушить нейронной активности в отдельных областях мозга в фазах об…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим авторов Робинсон и др. 12 за их вклад в рукописи, из которых этот протокол частично получены.

Materials

Male, Long Evans Rats, 55-60 d Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution:  This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution:  This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-Oxide R&D Systems 4936-10 Designer Drug
Rat Cage lid (Polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion
Filer Paper (Replacement) Alternative Design  FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table Top Vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Medline Biohazard liners  Staples 113444 Biohazard Trash Bags
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle  Amazon.com Biohazard Trash Can
Isoflurane, 100 mL Patterson Veterinary Supply Inc.  07-890-8540 Anesthetic
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia Mask (Rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated Syringe pump with Micro4 Controller  David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine Skin Cleanser Perdue  Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple Antiobiotic Ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube Vet Ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite  Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 Gauge 10uL Syringe Hamilton  80308-701SN Surgical equipment
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22'Wx22"Hx16"D
Extra Tall Modular Test Chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless Steel Grid Floor  Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House Light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular Pellet Dispenser  Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet Recetacle, Cup Type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head Entry Detector for Rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage Speaker for Rat Chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable Audio Generator  Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large Table Top Cabinet and Power Supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI Interface Package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard:  carcinogen, weigh in hood
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies  3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies  2956S Histology reagent
Anti-Rabbit IgG Cell Signaling Technologies  4412S Histology supplies
Superfrost Plus slides  VWR international 483111-703 Histology supplies

References

  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. . amnesia and the hippocampal system. , (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. . NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. . National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. . , (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Play Video

Cite This Article
Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

View Video