Introduction
Atomic Force Microscopy (AFM) genereert een beeld van een oppervlak door het scannen van een gebied van het monster met een vrijdragende ligger met een zeer scherpe punt 1. De beweging van de cantilever sondes het oppervlak topologie van het monster. AFM is op grote schaal toegepast om biologische moleculen - zoals eiwitten, DNA en membranen vanwege zijn veelzijdigheid analyseren gefixeerde monsters in lucht of bijna-natieve toestand in vloeibare 2-5.
Afgezien van de hoge-resolutie beeldvorming vermogen in het nanobereik, de AFM cantilever werkt als een veer interactiekrachten (adhesie en afstoting) en mechanische eigenschappen van het monster 5,6 sonde. Dit staat bekend als kracht spectroscopie. In deze modus wordt de eerste probe nadert het monster en een kracht uitoefent op, dan wordt teruggetrokken totdat het contact verliest met het monster (Figuur 1A). De gegenereerde curven kracht als functie van de afstand van de cantilever voor zowel appvoorn en intrekken. Verschillende eigenschappen inclusief de elasticiteitsmodulus de stijfheid van een materiaal te meten, en adhesie krachten kunnen worden afgeleid.
Ondersteunde lipide bilagen zijn biologische modelmembranen liggen boven op een vaste drager - gewoonlijk mica, borosilicaatglas, kwartsglas of geoxideerd silicium 7. Ze worden bereid met behulp van verschillende technieken zoals blaasje depositie, Langmuir-Blodgett methode en de spin-coating 8,9. AFM beeldvorming wordt gebruikt om de vorming van deze ondersteunde dubbellagen 10 volgen en sonde verschillende structuren gevormd door membranen met verschillende samenstellingen 11-15.
Het uitvoeren van kracht spectroscopie op ondersteunde bilayers resulteert in een piek in de aanpak curve. Deze piek geeft de kracht nodig om de bilaag doorboren, en heet doorbraak kracht. De dubbellaag dikte kan ook worden gemeten met de krachtcurve 6. De typische doorbraak kracht van dubbellagenrange tussen 1-50 nN 6. Deze eigenschappen zijn afhankelijk van lipiden verpakking (vloeibare of gelfase) en structuur (acyl ketenlengte en mate van onverzadiging) en veranderd door membraan-actieve middelen 16. De theorie achter de breuk is uitgelegd 17 en andere experimentele parameters zoals cantilever zachtheid, tip radius en aanpak van de snelheid ook van invloed op de doorbraak kracht 15,16,18. Force spectroscopie werd gebruikt om de eigenschappen van verschillende lipide fasen 11,19, preparaat-afhankelijke veranderingen 12,20, en effecten van andere biomoleculen, zoals peptiden analyseren op de stabiliteit van het membraan 21.
De vlakke oriëntatie ondersteunde bilagen voordelig te combineren AFM met andere methoden zoals oppervlakte plasmon resonantie 22 en fluorescentiemicroscopie 11,19 beter te karakteriseren structuur en eigenschappen van de membranen.
Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld om ondersteund lipidendubbellagen bereiden met behulp van blaasje afzetting en analyseren ze met de AFM en de kracht spectroscopie. Hoewel vesicles met verschillende grootte worden gebruikt om dubbellagen bereiden dit protocol is gericht op kleine en grote unilamellaire vesicles. Ondersteunde dubbellagen die fase scheiden in vloeibare besteld (L o) en vloeibare ongeordende (L d) fasen werden gekenmerkt 11,15. Het membraan bestaat uit di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC), sfingomyeline (SM), en cholesterol (Chol) en 2: 2: 1 ratio. Deze samenstelling modellen de lipide vlotten, die worden voorgesteld om zich te gedragen als platforms van belang voor eiwit mensenhandel en sorteren, cell signaling en andere cellulaire processen 23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van ondersteunde lipidendubbellagen (SLB) 11,12,21
- Voorbereiding van de lipidemengsel en Multilamellaire Vesicle Schorsingen
- Bereid de volgende buffers vooraf.
- Bereid PBS-buffer bij concentraties van 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 en 137 mM NaCl, pH 7,2.
- Bereid SLB (ondersteunde lipide dubbellaag) buffer bij concentraties van 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4.
- Bereid een oplossing van 1 M CaCl2.
- Los de volgende lipiden in chloroform in een gewenste concentratie: bijvoorbeeld di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC) en 25 mg / ml, sfingomyeline (SM) en 25 mg / ml en cholesterol (Chol) en 10 mg / ml.
- Neem 18.38 ui DOPC, 17,10 pl SM en 11,30 pl Chol om een oplossing met 1 mg totale lipiden in een 2 te: 2: 1 DOPC: SM: Chol molverhouding. Varieer de volumes dienovereenkomstig op basis van de concentrations van de bereide in 1.1.2 lipiden. Toch behouden de molaire verhouding van 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, het veranderen van de molaire verhouding van de fasekenmerken van het membraan 25 te veranderen.
- Meng de oplossing volledig door vortexen. Voeg een fluorescerende kleurstof lipide 0.05 mol% wanneer men wenst de bilaag te visualiseren door een fluorescentiemicroscoop.
Opmerking: De familie van lange-keten dialkylcarbocyanines, zoals deed, DII en DIO bestrijken een breed scala van golflengten en kan ideaal gebruikt worden om lipide membranen te labelen. Alternatief kan fluorescerend gemerkte lipiden, zoals rhodamine-fosfatidylethanolamine of BODIPY-cholesterol gebruikt. In ieder geval moet de concentratie van de kleurstof worden geoptimaliseerd afhankelijk van de instelling microscopie, rekening houdend dat hoge concentraties van de fluorofoor gebonden aan het lipide de lipide gedrag 19 kan veranderen. - Droog het chloroform onder toepassing van N 2 gas (of eventueel beschikbare inert gas zoals Ar en He).
- Verdere droog tHij lipide mengsel onder vacuum gedurende ten minste 1 uur.
Opmerking: Als het opslaan van deze lipidemengsel, zuiveren lucht met inert gas (N2, Ar of He) en bewaar bij -20 ° C. Aliquot overtollige lipiden-in-chloroform in kleine bruine flesjes. Droog ze op soortgelijke wijze als de lipide mengsel verplaatsen lucht met inert gas (N2, Ar of He) en bewaar bij -20 ° C. - Los de gedroogde lipiden in PBS buffer tot een concentratie van 10 mg / ml.
- Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer 20 sec tot 1 min tot een troebele suspensie te krijgen, met multilamellaire blaasjes. Zorg ervoor dat de er geen lipidefilms vastzitten aan de wand van het flesje.
- Verdeel deze suspensie in 10 ul porties (1 mg lipide maakt 10 porties).
- Bewaar bij -20 ° C tot verder gebruik.
- Bereid de volgende buffers vooraf.
- Bereiding van Unilamellaire Vesicles
Opmerking: Verschillende maten van unilamellaire vesicles kunnen worden bereid met sonicatie werkwijze of extrusiewerkwijze. Sonicatie gebruikt sound energie aan het mengsel roeren en scheid de lagen van de multilamellaire suspensie. Dit wordt aangegeven door het opruimen van de wazige schorsing. Extrusie dwingt de multilamellaire blaasjes door een membraan filter te passeren met een bepaalde poriegrootte.- Sonicatie Method
- Neem de 10 ul van multilamellaire lipide schorsingen en voeg 150 ul van SLB buffer.
- Breng het mengsel in kleine (2 ml) afgesloten glazen flesjes en afdichting met Parafilm.
- Ultrasone trillingen het mengsel bij kamertemperatuur in een badsonicator gedurende 10 minuten of totdat het duidelijk wordt op kleine unilamellaire vesicles (SUVs, dan 50 nm in diameter).
- Extrusie Method
- Neem de 10 ul van multilamellaire lipide schorsingen en voeg 150 ul van SLB buffer.
- Breng de suspensie in een cryogene buis.
- Bevries de lipidesuspensie door onderdompeling het cryogene buis gedurende een paar seconden in vloeibare stikstof.
- Ontdooi delipidesuspensie door onderdompeling het cryogene buis in een waterbad bij kamertemperatuur of 37 ° C gedurende enkele minuten. Herhaal de vries-dooi treden minstens 10 keer.
- Om de lipidesuspensie extruderen gebruik een polycarbonaat membraan met 200 nm poriegrootte (met poriegrootten zijn beschikbaar, zoals, 100 nm of 400 nm) en een commercieel extrudeerinrichting 26.
Opmerking: Momenteel zijn er twee extrusie apparaten in de handel verkrijgbaar: handmatig extruder is beschikbaar voor kleine volumes (200 pl tot enkele ml). In dit geval wordt het monster geëxtrudeerd door het membraan door handmatig indrukken van de suspensie heen en weer tussen twee spuiten. Afhankelijk van de fabrikant, zou lipide fracties moeten worden gecombineerd om minimum volume van de set-up te bereiken. Voor grotere volumes (tot 50 ml) meer geavanceerde apparaten worden gebruikt, waarin de suspensie wordt gedwongen door het polycarbonaatmembraan met gecomprimeerd gas. Set-up en de extrusie-omstandigheden kan volgens de mod te veranderenel. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor gebruik. Dit protocol betreft de handleiding extruder voor kleine volumes. - Equilibreren de extruder in het water door het passeren van water door de extruder. Dompel het membraan in water.
- Plaats het membraan tussen de beide zuigers, assembleren het apparaat en equilibreren buffer door het passeren van de buffer door de extruder, van de ene spuit naar de andere. Deze stap maakt bovendien het testen van de leakiness van het systeem. Als het lekt, demonteren en weer opnieuw het veranderen van de membraan.
- Neem de lipidesuspensie via een spuit van de extruder ('vuile kant').
- Bevestig de spuit met de lipidesuspensie op een kamer en de lege injectiespuit op de tegenoverliggende kamer.
- Duw de spuit op een einde. Laat de oplossing door het membraan en in de tegenoverliggende injectiespuit. Dit is de 1 ste pass.
- Geef het door het membraan voor een totaal van 31 keer een dergelijkedat de oplossing terecht in de vijandelijke spuit ("clean side").
Opmerking: Controleer het membraan na extruderen. Wanneer het was gebroken, vervolgens extrusiewerkwijze niet succesvol en moet worden herhaald. - Leeg de spuit in een kleine buis. Grote unilamellaire vesikels (LUV's) zijn houdbaar 1-2 dagen als bij 4 ° C bewaard.
- Sonicatie Method
- Voorbereiding van Mica en Coverslips
- Wash coverslips eerst in water en vervolgens in ethanol. Luchtdroog.
- Neem mica schijven en loslaten van de buitenste laag met plakband.
- Bevestig de mica schijf op het dekglaasje. Transparante optische lijmen zijn optimaal, zodat men de dubbellagen kunnen controleren met een fluorescentiemicroscoop.
- Bevestig plastic cylinders (2,5 cm buitendiameter, 2 cm binnendiameter en 0,5 cm hoogte) met optische lijm / vet. Zorg ervoor dat alles is afgesloten en dat er geen lekken zijn. Gebruik vet wanneer willen hergebruiken de cilinders omdat ze gemakkelijk kunnen worden losgemaakt van the dekglaasje en gewassen. De afmetingen van de plastic cilinder afhankelijk van de grootte van de AFM cantilever houder en moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
- Afzetting van Unilamellaire blaasjes op Solid Ondersteuning
- Pipet geheel liposoomoplossing direct op het mica. Voeg meer SLB buffer tot een volume van 300 pi te bereiken.
- Voeg 0,9 gl 1 M calciumchloride-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 3 mM Ca2 + bereiken.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens bij 65 ° C gedurende ten minste 10 min. Bedek altijd de dubbellagen met buffer. Contact met bubbels lucht en lucht zal vernietigen. Tijdens incubatie voeg meer buffer eventueel name als incuberen bij hogere temperaturen.
Opmerking: Incubatie temperatuur varieert afhankelijk van de lipidemengsels en fasen vereist. Incubatie van ten minste 10 minuten is nodig ondersteund bilagen vormen, maar kan langer zijn, afhankelijk van de temperatuur en samenstelling. - Wassende bilaag met warm (65 ° C) SLB buffer 15-20 maal calcium en gefuseerde vesicles te verwijderen. Neem extra zorg tijdens de wasstappen om de bilaag onder buffer te houden en voorzichtig pipet de was- oplossing om te voorkomen dat het vernietigen van de bilaag.
- Cool ondersteund bilayers op kamertemperatuur voordat AFM metingen. Dit is nodig om de verschillende fasen van het membraan en minimaliseren thermische drift in het apparaat.
2. Atomic Force Microscopy Metingen 11,12
- Imaging
Opmerking: Voer atoomkrachtmicroscopie beeldvorming in contact modus of tikken mode. Beeldondersteund bilagen in oplossing; niet mogelijk oplossing verdampen omdat dit de dubbellagen zal vernietigen. Zoals men zou werken met buffer, in acht nemen veiligheidsmaatregelen om ervoor te zorgen dat elke AFM deel is beschermd tegen gemorste vloeistoffen.- Selecteer een zachte cantilever (onder 0,2 N / m veerconstante wordt geadviseerd) en monteer het aan tHij AFM. De keuze van de cantilever stijfheid is van cruciaal belang voor kracht spectroscopie (en dit zal later worden besproken).
- Monteer het monster op de AFM podium en ervoor te zorgen dat alle vibratie-isolatie modules zijn ingeschakeld. Wacht tenminste 15 min equilibreren en verminderen thermische drift van het systeem. Afhankelijk van de AFM set-up, kan tuning en imaging specificaties verschillen. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant.
- Benader het monster met de AFM tip tot contact.
- Omdat lipide bilagen gewoonlijk 4 nm in lengte, met de Z-bereik van het instrument dat de hoogste z-resolutie (bijvoorbeeld 1,5 pm) zal geven.
- Selecteer een regio om de afbeelding. Om een overzicht van de lipide bilaag, een 50 um x 50 urn of 25 urn x 25 urn regio zal een goed uitgangspunt om de afbeelding te krijgen. Als kleinere functies verschijnen, kan men het in kleinere gebieden (10 micrometer x 10 micrometer, of 2 micrometer x 2 pm). De keuze van het opnamegebied ook afhankelijk van de werkende range van de piëzo-elektrische scanner. Raadpleeg de handleiding voor dit instrument.
- Zoals dubbellagen zijn erg kwetsbaar, passen het setpoint van de AFM tip tijdens de beeldvorming om de kracht op minimum en correct voor thermische drift te houden, terwijl het contact met het monster. In contact modus, het minimaliseren van het setpoint. In de tapping mode, het maximaliseren van de setpoint.
- Proces beelden door het aanbrengen van elke scan lijn naar polynoom nivellering functies. Voer lijn verwijdering voor scans dat contact met het membraan met behulp van de eigen software van de AFM productiebedrijf verliezen.
- Force Spectroscopie
- Kalibreren van de cantilever de instructies volgens het protocol van de fabrikant. Kalibratie kan de omzetting van het elektrische signaal van de fotodiodes kracht (Figuur 1B).
- Kalibreren de gevoeligheid van de tip om afbuiging als z-piëzo-beweging (in eenheden van lengte) te meten in plaats van het elektrisch signaal in Volt.
- Bereken de cantilever veerconstante met behulp van de thermische ruis frequentie methode, meestal opgenomen in het AFM software. In deze werkwijze plot de trillingsamplitude van lawaai wat betreft oscillatiefrequentie, waardoor een spectrale vermogensdichtheid plot. Dit perceel zal een piek rond de resonantiefrequentie te tonen. De frequentie waar de amplitude is de grootste is de resonantiefrequentie. Breng een Lorentziaanse functie rond de piek automatisch berekenen van de veerconstante van de software. Enkele nuttige middelen voor de theorie van de thermische ruis methode worden gegeven in de referenties 27-30.
- Kalibreren de gevoeligheid van de tip om afbuiging als z-piëzo-beweging (in eenheden van lengte) te meten in plaats van het elektrisch signaal in Volt.
- Na het afbeelden van een gebied van de bilaag, selecteer een 5 urn x 5 urn gebied in de bilaag te dwingen spectroscopie.
- Stel de AFM, zodat het duurt kracht bochten in een 16 x 16 raster van die regio. Dit resulteert in 256 van kracht curves per regio. De ruimte tussen twee aangrenzende punten moet genoeg om te voorkomen dat het membraanoppervlak wordt gesondeerd met een punt samenvalt met het volgende punt. Dit is afhankelijk van de tip radius. Een 100 nm afstand tussen twee punten zou ideaal zijn. Verdeel de 5 micrometer x 5 micrometer regio in 16 x 16-raster. Afhankelijk van de grootte van de fase, kan men een kleiner of een groter gebied te selecteren en aan te passen de rastergrootte.
- Stel z-piëzo verplaatsing naar400 nm. Dit bepaalt het maximale bereik van de beweging van de z-piëzo. Het moet groot genoeg zijn om ervoor te zorgen dat de cantilever volledig verwijderd is teruggetrokken uit het monster tussen metingen.
- Stel aanpak snelheid tot 800 nm / sec en trek snelheid tot 200 nm / sec. Gebruik naderingssnelheid tussen 400 tot 6000 nm / sec afhankelijk van de bilaag samenstelling en lipidefase te bestuderen 6,16.
- Na het instellen van alle parameters, te verwerven kracht bochten, door op de "run" knop van de AFM software.
- Sla kracht curves als kracht versus hoogte curves (een maat voor de z-piëzo-beweging). Dit houdt geen rekening met het buigen van de cantilever bij contact met het monster. Tijdens de verwerking van gegevens stap, de AFM software maakt correctie voor cantilever buigen tot kracht vs. tip-sample scheiding curves (figuur 1C), die de juiste waarden voor tweelaags dikte zal geven te krijgen. De correctiewaarden gebruikelijke wijze gedispergeerd in de kalibratie, die wordt opgeslagen met elke kracht curve. Bereken tip-sample scheiding door het aftrekken van de vertikale afbuiging van de piëzo beweging op een bepaald moment.
Opmerking: De piek in de benadering krachtcurve (de krachtwaarde ondergaat zelfs als de cantilever beweging nog op de aanpak cyclus) is de doorbraak kracht van het membraan, terwijl het verschil tussen de positie van deze piek en de positie van het punt indien de kracht begint te stijgen weer geeft de dikte van het membraan. - Verwerven van minstens 500 kracht curves voor elke voorwaarde om goede statistieken te krijgen. Maak een histogram van de waarden met behulp van programma's zoals Origin of MatLab, en passen de histogrammen een Gaussische verdeling naar de top en de breedte van de distributie te krijgen.
- Kalibreren van de cantilever de instructies volgens het protocol van de fabrikant. Kalibratie kan de omzetting van het elektrische signaal van de fotodiodes kracht (Figuur 1B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ondersteunde lipide bilagen samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) werden afgebeeld in AFM (figuur 2 AC). Door de lipidensamenstelling SM / Chol-rich Lo en DOPC-rijke Ld fasen waargenomen. De hoogte van het profiel van de AFM beeldvorming kan belangrijke informatie over het membraan structuur. Door naar het hoogteprofiel kan de dubbellaag dikte gemeten in aanwezigheid van defecten in het membraan (Figuur 2B) of het hoogteverschil tussen de L o / Ld fasen worden verstrekt. Daarnaast AFM maakt het mogelijk om specifiek te selecteren regio vertegenwoordigen deze fasen en hun mechanische eigenschappen met behulp van kracht spectroscopie (figuur 2 D - F) te analyseren. De kracht curves afgeleid uit de kracht-spectroscopie modus worden gebruikt om de doorbraak kracht te meten door het vinden van de waarde van de kracht op het hoogtepunt van de krachtcurve (figuur 2D en E) en de Membrane dikte door het aftrekken van de afstandswaarde van de top van de krachtcurve naar de afstandswaarde wanneer de krachtcurve begint te stijgen (figuur 2D en F).
De gevoeligheid van AFM metingen is afhankelijk van piëzo-elektrisch materiaal en elektronische feedback loops. Als zodanig, voordat u proeven, is het belangrijk om vertrouwd te raken met de set-up AFM te krijgen. Er zijn twee veel voorkomende instrument opgezet voor de piëzo-elektrische materialen: (1) tube scanner waarin het monster op de top van het piëzo-elektrisch materiaal wordt geplaatst en het monster wordt gescand op een immobiele tip; of (2) flexuur-stadium waarin de tip over het piëzo-elektrische materiaal in plaats van het monster is aangebracht. In het laatste geval, het piëzo-elektrische materiaal en andere elektronica beschermd tegen morsen. Veel van de AFM modellen voor biologische toepassingen hebben deze configuratie.
Tijdens de beeldvorming, kan de AFM tip contact met het monster te verliezen en leiden tot me foutieveasurements. Afhankelijk van het aantal scans verloren, kan het beeld worden gecorrigeerd door de scanlijnen verwijderen en met een gemiddelde intensiteit filter om de nieuwe waarden van de omgeving (figuur 3) afleiden. Maar in de meeste gevallen is dit niet een goed beeld te geven en het wordt aanbevolen om het beeld gewoon weggooien. Er zijn andere artefacten die moeten worden bewaakt. Deze komen voort uit stompe / beschadigd / vuil tips en de diffractie van de laserspot achter de cantilever 31. In deze gevallen moeten afbeeldingen worden weggegooid en de AFM tip moet worden vervangen.
Tijdens werking spectroscopie metingen kunnen verschillende problemen optreden: (1) ontbreken van pieken (figuur 4A), (2) de aanwezigheid van schouders in plaats van goed gedefinieerde pieken (figuur 4B), (3) een lichte stijging en daaropvolgende plateauing bij zeer lage krachten (figuur 4C - D). De afwezigheid van een piek kan worden toegeschreven aan het meten in een gebied zonder bilayer of overname voorwaarden niet wordt geoptimaliseerd. Het wordt aanbevolen dat een beeld AFM wordt verkregen voordat u kracht spectroscopie om ervoor te zorgen dat de bilaag wordt inderdaad wordt gemeten. Acquisitie voorwaarden evenals tip / cantilever specificaties van invloed op de kans op een doorbraak evenement 17. Een scherpere tip kan gemakkelijk doorboren bilaag, als zodanig, kan de doorbraak kracht lage verschijnen of helemaal niet weergegeven omdat deze beneden de geluidsniveaus. . Het verhogen van de aanpak van snelheid verhoogt ook de doorbraak van kracht 16. Zoals de bilaag van de punt drukt de vetmoleculen ook reageren op deze kracht verdwijnen. Bij een lagere naderingssnelheid, de lipide dubbellaag voldoende tijd equilibreren vóór de volgende stap van kracht, en dit verhoogt de kans dat een doorbraak gebeurtenis kan gebeuren. Bij een hogere naderingssnelheid, de kracht hellingen sneller is dan de reactie van de lipiden en, als zodanig, de kans op een doorbraak gebeurtenis lager dezelfde kracht. Het is possbaar dat door het gebruik van high speed aanpak, het setpoint voor de bilaag pauzes resulteert in geen waarneembare pieken bereikt. Er zijn geen rapporten om het uiterlijk van de schouders op de kromme leggen maar we veronderstellen dat het zou kunnen zijn op materiaal compressie voor doorbraak. Voorts kan een plateau of brede pieken bij lage krachten de aanwezigheid van vuil of losse lipidemateriaal in de tip geven. Tips kunnen vuil en lipide materiaal ophopen in de overspanning van verschillende metingen. Vuil en materiaal bevestigd aan het uiteinde maakt het bot, waardoor de doorbraak kracht.
Het wordt aanbevolen dat kracht curves zijn verworven in verschillende gebieden als deze uitdagingen voordoen. Een tweede aanbeveling is om tips te veranderen (dit zal herijking nodig). Tenslotte, moet de naderingssnelheid worden aangepast en het gebruik van een tip met verschillende specificaties (tip radius en stijfheid) worden overwogen. De doorbraak kracht varieert tussen 0-50 nN 6 als zodanig, tHij veerconstante van de cantilever kan worden in het bereik van 0,05-0,7 N / m. De meeste commerciële uitkragingen hebben een nominale tip straal rond 20-40 nm. In plaats van conventionele tips kunnen puntloze cantilevers worden gekocht en bollen van bekende radius (die meestal monodisperse in grootteverdeling) worden verbonden. Om reproduceerbare gegevens op te halen, altijd dezelfde overname voorwaarden en cantilever specificaties voor dezelfde reeks experimenten.
Figuur 1: Principes van Force Spectroscopie (A) Verloop van aanpak-terugtrekken van de cantilever van het monster.. De rode lijn geeft de cantilever doorbuiging van zijn evenwichtspositie (zwarte lijn). (B) cantilever kalibratie zet elektrische signaal (in Volt) te dwingen (in Newton). Door overname van de cantilever sensiteit en veerconstante de verticale doorbuiging (in volt) wordt omgezet in de afstand en de afstand in werking met behulp van de wet van Hooke. (C) Bij contact geldende spectroscopie metingen, ofwel scanbeweging z-piëzo geen rekening met de cantilever buigen. Een correctie voor dit kan worden gedaan door het aftrekken van de vertikale afbuiging, x (in afstandseenheden) vanaf de z-piëzo beweging z (ook in afstandseenheden). Op deze wijze wordt de eigenlijke tip-sample scheiding plaats van alleen z-piëzo beweging kan worden gemeld, hetgeen een nauwkeuriger meting van afstanden en is belangrijk om de dikte van het monster te meten.
Figuur 2:. AFM van SLBs (A) Regeling van SLBs samengesteld uit DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) te scheiden in vloeibare ontregeld (L d) en vloeibare besteld (L o) fasen. (B (C) overeenkomt met de gele vierkant in B (10 urn x 10 urn). Lo en L d fasen worden gelabeld. Onder de lijn profiel komt overeen met de gele lijn in het beeld. De Lo fase verschijnt 1-2 nm lager dan de L d fase. (D) Een monster krachtcurve zien hoe de doorbraak kracht en membraandikte afgeleid. (E) Doorbraak kracht en (F) membraandikte verdeling van Ld en Lo fasen met Gaussian plaatsing voor kwantificering.
Figuur 3: Verlies van contact tijdens de beeldvorming leidt tot. scan lijnen die niet overeenkomen met de rest van het beeld Een ondersteunde dubbellaag bestaat uit DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) met een verlies van contact in sommige lijn scans. Scale bar 2 micrometer.
Figuur 4:. Uitdagingen in Force Spectroscopie (A) enige kracht curves zullen geen pieken. (B) De curve kan schouders in plaats van goed gedefinieerde pieken. (C) na een kleine stijging een plateau optreden in afwezigheid van de piek. (D) Uiterlijk van een plateau met een goed gedefinieerde piek.
| Membraan regio | Doorbraak Force (NN) | Membraan dikte (nm) |
| L d fase | 6 ± 1 | 4.7 &# 177; 0.5 |
| Lo fase | 8 ± 1 | 6 ± 1 |
Tabel 1: Membraan eigenschappen van DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBs De Ld fase een doorbraak kracht van 6 ± 1 nN en een dikte van 4,7 ± 0,5 nm. De Lo is 8 ± 1 nN en een dikte van 6 ± 1 nm. Het hoogteverschil tussen de beide fasen 2 ± 1,4 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SLBs samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) gevormd op mica na vesicle adsorptie en scheuren geïnduceerd door calciumchloride. Deze lipidepreparaat gescheiden in Ld en L o fasen. De Lo fase verrijkt met cholesterol en sfingomyeline en is minder vloeibaar / viskeus (figuur 1A) dan Ld fase 11. De scheiding van Lo van Ld fase manifesteert als cirkelvormige structuren boven de omringende (Figuur 1B, C) verhoogd. De platforms zijn Lo fasen omringd door Ld fasen. Membraandefecten (of gaten in het membraan) worden ook gezien (figuur 1B, blauwe pijl) en een hoogteprofiel aan dit gebrek wordt de dikte van de dubbellaag. De L d / L o hoogteverschil kan ook worden onderzocht door te kijken naar een AFM hoogte profiel (figuur 1C).
De voorbereiding van de lipidenmengsel is zeer belangrijk aangezien de samenstelling bepaalt de bilaag eigenschappen. Bij de bereiding van de bilaag, is het belangrijk om te werken bij de aangegeven temperaturen voor de juiste vorming van de lipide fasen (stap 1.4.5). Tijdens beeldvorming, het houden van een lage kracht is belangrijk om niet de bilaag te vernietigen of vuil ophopen op de punt.
Na AFM beeldvorming, zijn regio's van de SLB geselecteerd en onderzocht het gebruik van geweld spectroscopie. Force spectroscopie kunnen ook andere eigenschappen van het membraan, in het bijzonder de doorbraak kracht (figuur 1D) probe. De L d en L o fasen tonen verschillende doorbraak kracht en dikte (figuur 1E, F). De eigenschappen zijn samengevat in tabel 1. We merken dat in vergelijking met Chiantia et al. 11, vergelijkbare waarden voor doorbraak kracht in de Ld-fase verkregen, maar een lagere waarde voor Lo fase. Dit kandoor lagere hoeveelheden cholesterol in onze membranen (gemaakt DOPC: SM: Chol verhouding 2: 2: 1, terwijl zij gebruikt van 1,5: 1,5: 1). Dit toont ook het belang van het mengen van de juiste lipideverhouding - een kritische factor in reproduceerbaarheid. Verder met verschillende lipiden (ketenlengte en mate van onverzadiging) tevens desbetreffende bilaag eigenschappen 6,15,18.
Tijdens het uitzetten van de verdeling van krachten doorbraak is nuttig en kan reeds verschillen in de bilaag eigenschappen vertonen, kan verdere analyse van de doorbraak krachtverdeling worden om andere mechanische eigenschappen zoals kabelspanning en verspreiden druk 11,17,21 afleiden. In het kort wordt de waarschijnlijkheid, P (F) van het meten van een bepaalde doorbraak kracht, F, beschreven door het continuüm nucleation model 11,15,17:
waarbij A de Resonance frequentie van de cantilever, K de veerconstante van de cantilever, v de snelheid van de benadering Γ is de lijnspanning (de rand energie die nodig is om een gat in het membraan open te houden), R de straal van de AFM tip, k B is de constante van Boltzmann, T de temperatuur is en S de verspreiding druk of energie van het gat sluiten (tegenover membraan spanning - de energie die nodig is door het membraan wordt uitgeoefend om een gat 32 te openen). Deze vergelijking kan worden geïntegreerd en dP / dF kan worden berekend als:
A, K, R zijn de eigenschappen van de AFM cantilever / tip dat kan worden verkregen via cantilever kalibratie. T en v experimentele parameters die gedurende de proeven constant worden gehouden. dP / dF wordt dan aan het histogram gemonteerd op de lijnspanning en de verspreiding druk te verkrijgen. Zoals verschillende parameters beïnvloeden P (F), ervamentalisten wordt geadviseerd om soortgelijke tips en acquisitie voorwaarden te gebruiken om vergelijkbare waarden voor de lijn spanning en het verspreiden van de druk te hebben. Verontreiniging van de AFM tip (inclusief vuil en ongefuseerde blaasjes op het puntje tijdens de beeldvorming verworven) leidt tot niet-reproduceerbare resultaten. Bovendien is de keuze van drager beïnvloedt de mechanische eigenschappen van het membraan 20.
Een andere techniek die de mechanische eigenschappen van lipidebilaag kunnen karakteriseren is de micropipet aspiratie van reusachtige unilamellaire blaasjes (GUVs) 33. In deze techniek wordt het membraan spanning berekend uit de vervorming van GUVs tijdens aspiratie. Verder kan door het verhogen van de zuiging, kan de spanning berekenen waarbij de GUV scheurt (of lysis spanning) 34, die kan worden gerelateerd aan de lijnspanning in het continuüm nucleatie model. Een nadeel van deze techniek is de complexiteit van de berekening membraan spanning fasescheiding membranen, zoals de verschillende phases hebben verschillende mechanische eigenschappen 35. Dit in tegenstelling tot AFM kracht spectroscopie, waarbij afzonderlijke fasen afzonderlijk worden gekarakteriseerd. Bovendien, terwijl veel GUVs zijn nodig om statistisch relevante resultaten te produceren, de AFM kan men verdeling per SLB produceren. Echter membraan remodeling effecten (bijvoorbeeld buis en invaginations) gemakkelijker zichtbaar gemaakt met GUVs, waardoor ze betere systemen voor het karakteriseren deze vorm gerelateerde effecten met mechanische eigenschappen.
In verdere toepassingen de effecten van membraaneiwitten op bilaag eigenschappen te bestuderen, kunnen gezuiverde eiwitten in deze vesicles worden opgenomen om proteoliposomen maken. Eén techniek om dit te doen gebruikt reinigingsmiddelen om de eiwitten te stabiliseren en plaats in het membraan. Daaropvolgende zuivering via dialyse of grootte-exclusie chromatografie verwijdert vrije eiwitten en detergent in oplossing 36. Een andere benadering vereist de tagging vande gezuiverde eiwitten (bijvoorbeeld, histidine of Streptavidine-tags) en waarin affiniteitpartners hiervoor tag in de liposomen (met nikkel-nitriloazijnzuur (Ni-NTA) of gebiotinyleerde lipiden).
Samengevat beschrijven we een werkwijze voor lipide bilagen analyseren. Door de hoge-resolutie, kan AFM sub-micrometer structuren in het membraan, die lipide fasen onder meer omvatten onthullen. Force spectroscopie, hier gebruikt voor het karakteriseren van lipidemembranen, kan ook gebruikt worden op membraaneiwitten en andere biomoleculen op het membraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Max Planck Society, de Duitse Cancer Research Center, de universiteit van Tübingen en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (verlenen no. 0312040).
Wij danken Eduard Hermann voor het helpen ons de analyse van de kracht curve gegevens en Dr. Jakob Suckale voor een zorgvuldige lezing van dit manuscript automatiseren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling. |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling. |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling. |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet) |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
- Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
- Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
- Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
- Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
- Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
- Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
- Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
- Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
- Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
- Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
- Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
- Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
- Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
- Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
- Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
- Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
- Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
- García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
- Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
- Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
- Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
- Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
- Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
- Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
- Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
- Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
- Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
- Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
- Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
- Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
- Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).
