Introduction
Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) genera una imagen de una superficie por la exploración a través de un área de la muestra utilizando un voladizo con una punta muy afilada 1. El movimiento de la voladizo sondea la topología de la superficie de la muestra. AFM ha sido ampliamente aplicado a las moléculas biológicas - incluyendo proteínas, el ADN y las membranas, debido a su versatilidad en el análisis de muestras fijadas en el aire o estado casi nativo en líquido 2-5.
Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución en el rango nanométrico, el voladizo AFM actúa como un resorte para sondear fuerzas de interacción (adhesión) y la repulsión y las propiedades mecánicas de la muestra 5,6. Esto se conoce como espectroscopia de fuerza. En este modo, la sonda se acerca primero la muestra y ejerce una fuerza sobre él, entonces se retrae hasta que se pierde el contacto con la muestra (Figura 1A). Las curvas generadas muestran la fuerza como una función de la distancia del voladizo, tanto para la aplicacióncucaracha y retracción. Varias propiedades, incluyendo el módulo elástico para medir la rigidez de un material, y fuerzas de adhesión se pueden derivar.
Bicapas lipídicas soportados son membranas modelo biológicas situadas en la parte superior de un soporte sólido - generalmente mica, vidrio de borosilicato, sílice fundida, o silicio 7 oxidado. Ellos se preparan utilizando diversas técnicas como la deposición de la vesícula, el método Langmuir-Blodgett y spin-coating 8,9. Formación de imágenes AFM se ha utilizado para seguir la formación de estas bicapas soportadas 10, y la sonda diferentes estructuras formadas por membranas de diferentes composiciones 11-15.
Realización de espectroscopia de fuerza en bicapas soportadas resultados en un pico en la curva de enfoque. Este pico indica la fuerza necesaria para perforar la bicapa, y se llama fuerza de avance. El espesor bicapa también se puede medir usando la curva de fuerza 6. La fuerza de avance típico de bicapasrango entre 1-50 nN 6. Estas propiedades dependen de embalaje de lípidos (fase líquida o gel) y la estructura (longitud de la cadena acilo y el grado de insaturación) y alterado por agentes 16-de membrana activa. La teoría detrás de la ruptura ha sido explicada 17 y otros parámetros experimentales tales como suavidad voladizo, radio de la punta y la velocidad de enfoque también afectará la fuerza avance 15,16,18. Espectroscopia de fuerza se ha utilizado para analizar las propiedades de las diferentes fases de lípidos 11,19, cambios en la composición dependiente de 12,20, así como efectos de otras biomoléculas, como los péptidos, sobre la estabilidad de la membrana 21.
La orientación plana de bicapas soportadas es ventajoso para la combinación de AFM con otros métodos tales como resonancia de plasmón superficial 22 y microscopía de fluorescencia 11,19 para caracterizar mejor la estructura y propiedades de las membranas.
Esta detallada proto vídeocol está destinado a preparar a bicapas lipídicas apoyados mediante la deposición de vesículas y analizarlos con AFM y espectroscopia de fuerza. Mientras que las vesículas de varios tamaños se pueden usar para preparar bicapas, este protocolo se centra en pequeñas y grandes vesículas unilamelares. Bicapas soportadas que fase separada en líquido ordenado (L o) y (L d) fases desordenadas líquidos se caracterizaron 11,15. La membrana se compone de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM) y el colesterol (Chol) en 2: 2: 1. Esta composición modelos las balsas de lípidos, que se proponen a comportarse como plataformas importantes para el tráfico de proteínas y la clasificación, la señalización celular y otros procesos celulares 23,24.
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Protocol
1. Preparación de admitidos Bilayers lípidos (SLB) 11,12,21
- Preparación de mezcla de lípidos y vesículas multilamelares Suspensiones
- Prepare los siguientes tampones de antemano.
- Preparar tampón PBS en concentraciones de 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 137 mM, pH 7,2.
- Preparar SLB (bicapa lipídica apoyado) tampón a concentraciones de NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4.
- Preparar una solución de 1 M de CaCl2.
- Disolver los siguientes lípidos en cloroformo a una concentración deseada: por ejemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / ml y colesterol (Chol) a 10 mg / ml.
- Tome 18,38 l de DOPC, 17,10 l de SM y 11,30 l de Chol para hacer una solución con 1 mg de lípidos totales en un 2: 2: 1 DOPC: relación molar Chol: SM. Varíe los volúmenes de acuerdo basado en el concentrations de los lípidos preparados en 1.1.2. Sin embargo, mantener la relación molar a 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, como el cambio de la relación molar va a cambiar las características de fase de la membrana 25.
- Mezclar la solución por completo mediante agitación. Añadir un colorante fluorescente lipídico en 0,05% en moles si se desea visualizar la bicapa por un microscopio de fluorescencia.
Nota: La familia de dialkylcarbocyanines de cadena larga, como lo hizo, Dil y Dio abarcan una amplia gama de longitudes de onda y puede ser idealmente utilizan para etiquetar las membranas lipídicas. Alternativamente, los lípidos marcados con fluorescencia, como rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterol pueden ser utilizados. En cualquier caso, la concentración del colorante debe ser optimizado de acuerdo con el ajuste de la microscopía, teniendo en cuenta que las altas concentraciones de fluoróforo unido al lípido puede cambiar el comportamiento de lípidos 19. - Seque el cloroformo utilizando gas N2 (o cualquier gas inerte disponibles, tales como Ar y He).
- Además t secaque lipídico mezcla al vacío durante al menos 1 hora.
Nota: Si va a guardar esta mezcla de lípidos, purgar el aire con gas inerte (N2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. Alícuota exceso de lípidos-en-cloroformo en pequeños frascos marrones. Secar en una manera similar a la mezcla de lípidos, desplazar el aire con gas inerte (N 2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. - Disolver los lípidos secos en tampón de PBS a una concentración de 10 mg / ml.
- Vortex la mezcla vigorosamente durante aproximadamente 20 segundos a 1 minuto para obtener una suspensión turbia, contiene vesículas multilamelares. Asegúrese de que el no hay películas lipídicas se pegan a los lados del vial.
- Distribuir esta suspensión en 10 alícuotas (1 mg de lípidos hace 10 alícuotas).
- Almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.
- Prepare los siguientes tampones de antemano.
- Preparación de vesículas unilamelares
Nota: Los varios tamaños de vesículas unilamelares se pueden preparar utilizando el método de sonicación o el método de extrusión. Sonicación usa sound energía para agitar la mezcla y separar las capas de la suspensión multilamelares. Esto se indica en la limpieza de la suspensión turbia. Extrusión obliga a las vesículas multilamelares que pasar por un filtro de membrana con un tamaño de poro definido.- Método Sonicación
- Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB.
- Transfiera la mezcla en pequeñas (2 ml) viales de vidrio tapados y sellar con Parafilm.
- Sonicar la mezcla a temperatura ambiente en un baño de ultrasonidos durante 10 min o hasta que se vuelve claro para producir pequeñas vesículas unilaminares (SUVs, por debajo de 50 nm de diámetro).
- Método de extrusión
- Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB.
- Transferir la suspensión a un tubo criogénico.
- Congelar la suspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico durante unos segundos en nitrógeno líquido.
- Descongele lasuspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico en un baño de agua a temperatura ambiente o 37 ° C durante unos minutos. Repita los pasos de congelación-descongelación por lo menos 10 veces.
- Con el fin de extruir la suspensión de lípidos, utilizar una membrana de policarbonato con tamaño de poro 200 nm (otros tamaños de poro están disponibles como, 100 nm o 400 nm) y un dispositivo de extrusión comercial 26.
Nota: Actualmente, hay dos dispositivos de extrusión comercialmente disponible: una extrusora manual está disponible para los pequeños volúmenes (200 l a unos pocos ml). En este caso, la muestra se extruye a través de la membrana empujando manualmente la suspensión de ida y vuelta entre dos jeringas. Dependiendo del fabricante, tendrían que combinarse para alcanzar el volumen mínimo de la puesta en marcha alícuotas de lípidos. Para volúmenes más grandes se utilizan dispositivos más sofisticados (hasta 50 ml) en el que la suspensión es forzado a través de la membrana de policarbonato mediante el uso de gas comprimido. Set-up y extrusión condiciones pueden cambiar de acuerdo con el Ministerio de Defensaeléct. Consulte las instrucciones del fabricante antes de usar. Este protocolo se refiere a la extrusora manual para pequeños volúmenes. - Equilibrar la extrusora en agua haciendo pasar agua a través de la extrusora. Sumerja la membrana en agua.
- Coloque la membrana entre los dos pistones, montar el dispositivo y equilibrar en tampón, haciendo pasar el tampón a través de la extrusora, de una jeringa a la otra. Este paso permite, además, pruebas de la falta de estanqueidad del sistema. Si se filtra, desmontar y volver a montar de nuevo el cambio de la membrana.
- Tome la suspensión de lípidos usando una jeringa de la extrusora ('lado sucio').
- Conecte la jeringa que contiene la suspensión de lípidos en una de las cámaras y la jeringa vacía en la cámara opuesta.
- Empuje la jeringa en un extremo. Pasar la solución a través de la membrana y en la jeringa opuesta. Este es el paso 1 st.
- Pasar a través de la membrana para un total de 31 veces talesque la solución termina en la jeringuilla opuesta ('lado limpio').
Nota: Consulte la membrana después de la extrusión. Si se rompe, entonces el proceso de extrusión no tuvo éxito y necesita ser repetido. - Vacíe la jeringa en un pequeño tubo. Vesículas unilamelares grandes (LUV) son estables durante 1-2 días si se mantiene a 4 ° C.
- Método Sonicación
- Preparación de Mica y Cubreobjetos
- Wash cubreobjetos primero en agua y luego en etanol. Aire seco.
- Tome los discos de mica y retire la capa exterior con cinta adhesiva.
- Coloque el disco de mica en el cubreobjetos. Colas ópticas transparentes son óptimas para que se pueda comprobar las bicapas con un microscopio de fluorescencia.
- Adjuntar cilindros de plástico (diámetro 2,5 cm exterior, 2 cm de diámetro interior y 0,5 cm de altura) con óptica pegamento / grasa. Asegúrese de que todo está sellado y que no hay fugas. Utilice grasa cuando se quiere volver a utilizar los cilindros, ya que pueden ser fácilmente separados de THe cubreobjetos y se lavan. Las dimensiones de los cilindros de plástico dependen del tamaño del soporte voladizo AFM y se deben ajustar en consecuencia.
- La deposición de vesículas unilamelares en soporte sólido
- Pipetear toda la solución de liposomas directamente sobre la mica. Añada más memoria intermedia SLB para llegar a un volumen de 300 l.
- Añadir 0,9 l de solución de cloruro de calcio 1 M para alcanzar una concentración final de 3 mM Ca 2+.
- Incubar a 37 ° C durante 2 min y luego a 65 ° C durante al menos 10 min. Siempre cubra las bicapas con tampón. El contacto con las burbujas de aire y aire lo destruirá. Durante la incubación, añadir más tampón si es necesario, especialmente si la incubación a temperaturas más altas.
Nota: Las temperaturas de incubación varían de acuerdo con las mezclas de lípidos y fases requeridas. Se necesita tiempo de incubación de al menos 10 min para formar bicapas soportadas, pero podría ser más largo, dependiendo de la temperatura y la composición. - Lavarla bicapa con agua caliente (65 ° C) tampón SLB 15-20 veces para eliminar el calcio y las vesículas no fusionadas. Tenga mucho cuidado durante las etapas de lavado para mantener la bicapa bajo tampón y pipetear suavemente la solución de lavado para evitar la destrucción de la bicapa.
- Bicapas frescos soportados a temperatura ambiente antes de mediciones de AFM. Esto es necesario para formar las diferentes fases de la membrana, así como minimizar la deriva térmica en el instrumento.
2. Microscopía de Fuerza Atómica Medidas 11,12
- Imaging
Nota: Realice las imágenes de microscopía de fuerza atómica en el modo de contacto o el modo tapping. De imagen soportados bicapas en solución; no permita que la solución se evapore por completo ya que esto va a destruir las bicapas. Como era de estar trabajando con tampón, se deben observar las medidas de seguridad para asegurarse de que cualquier parte AFM está protegido contra derrames de líquidos.- Seleccionar un voladizo suave (abajo se recomienda 0,2 N / m constante del resorte) y montarlo en tél AFM. La elección de la rigidez en voladizo es más crítico para la espectroscopia de fuerza (y esto se discutirá más adelante).
- Montar la muestra en el escenario AFM y asegurarse de que todos los módulos de aislamiento de vibraciones están encendidos. Espere al menos 15 minutos para equilibrar y reducir la deriva térmica del sistema. Dependiendo de la AFM configuración, especificaciones de ajuste y de imagen pueden variar. Consulte el manual del fabricante.
- Acérquese a la muestra con la punta del AFM hasta que el contacto.
- Desde bicapas lipídicas son generalmente 4 nm de altura, utilice el Z-rango del instrumento que le dará la mayor z-resolución (por ejemplo 1,5 micras).
- Seleccione una región de la imagen. Para tener una visión general de la bicapa lipídica, un 50 micras x 50 micras o 25 micras x 25 micras región será un buen punto de partida para la imagen. Si aparecen las características más pequeñas, la imagen de un bote en áreas más pequeñas (10 m x 10 m, o 2 m x 2 m). La elección de la superficie de imágenes también depende de la r de trabajoange del escáner piezoeléctrico. Por favor consulte el manual del instrumento para ello.
- Como bicapas son muy frágiles, ajustar el punto de la punta del AFM conjunto durante la exploración para mantener la fuerza, como mínimo, y corregir la deriva térmica, manteniendo contacto con la muestra. En el modo de contacto, minimizar el punto de ajuste. En el modo de grabación, maximizar el punto de ajuste.
- Imágenes de proceso de ajuste de cada línea de exploración de las funciones polinómicas de nivelación. Efectuar la eliminación de línea para las exploraciones que pierden contacto con la membrana utilizando el software propietario de la empresa de fabricación de AFM.
- Fuerza Espectroscopia
- Calibrar el voladizo siguiendo las instrucciones según el protocolo del fabricante. La calibración permite la conversión de la señal eléctrica de los fotodiodos a la fuerza (Figura 1B).
- Calibrar sensibilidad de la punta para medir la deflexión como el movimiento z-piezo (en unidades de longitud) en lugar de la señal eléctrica en voltios.
- Calcular la constante de resorte en voladizo utilizando el método de frecuencia de ruido térmico, generalmente incorporado en el software AFM. En este método, representar gráficamente la amplitud de la vibración del ruido con respecto a la frecuencia de oscilación, la creación de un gráfico de densidad espectral de potencia. Esta parcela se mostrará un pico alrededor de la frecuencia de resonancia. La frecuencia donde el i amplituds la mayor es la frecuencia de resonancia. Montar una función Lorentzian alrededor del pico para calcular automáticamente la constante del resorte por el software. Algunos recursos útiles para la teoría del método ruido térmico se dan en las referencias 27-30.
- Calibrar sensibilidad de la punta para medir la deflexión como el movimiento z-piezo (en unidades de longitud) en lugar de la señal eléctrica en voltios.
- Después de la formación de imágenes un área de la bicapa, seleccione una región x 5 m 5 m en la bicapa para realizar espectroscopia de fuerza.
- Configure el AFM para que tome las curvas de fuerza en una cuadrícula de esa región de 16 x 16. Esto se traduce en 256 curvas de fuerza por región. El espacio entre dos puntos vecinos debería ser suficiente para evitar que el área de la membrana se sondeó por un punto coincidiría con el siguiente punto. Esto depende de la radio de la punta. Una distancia 100 nm entre dos puntos sería ideal. Divida el 5 micras x 5 región micras en 16 x 16 cuadrícula. Dependiendo del tamaño de la fase, se puede seleccionar una región más pequeña o más grande, y luego ajustar el tamaño de la cuadrícula en consecuencia.
- Ajuste de desplazamiento z-piezo a400 nm. Esto determina el rango máximo de movimiento de la z-piezo. Debe ser lo suficientemente grande para asegurarse de que el voladizo ha completamente retraída lejos de la muestra en entre mediciones.
- Ajuste la velocidad de aproximación a 800 nm / seg y retraer la velocidad a 200 nm / seg. Utilice una velocidad de aproximación entre 400 a 6.000 nm / seg dependiendo de la composición bicapa y fase lipídica a ser estudiados 6,16.
- Después de configurar todos los parámetros, adquirir curvas de fuerza, pulsando el botón "Ejecutar" del software AFM.
- Guardar curvas de fuerza como la fuerza contra curvas de altura (una medida del movimiento z-piezo). Esto no toma en cuenta la flexión del voladizo cuando está en contacto con la muestra. Durante la etapa de procesamiento de datos, el software AFM permite la corrección de flexión en voladizo para obtener fuerza frente a curvas de separación punta-muestra (Figura 1C), lo que dará valores adecuados para el espesor bicapa. Los valores de corrección se incorporan normalmente en la Calibración, que se guarda con cada curva de fuerza. Calcular la separación punta-muestra restando la desviación vertical del movimiento piezo en un punto dado.
Nota: El pico en la curva de fuerza enfoque (el valor de la fuerza va hacia abajo, incluso si el movimiento en voladizo está todavía en el ciclo de aproximación) es la fuerza de avance de la membrana, mientras que la diferencia entre la posición de este pico y la posición del punto donde la fuerza comienza a aumentar de nuevo proporciona el espesor de la membrana. - Adquirir al menos 500 curvas de fuerza para cada condición para obtener buenas estadísticas. Trazar un histograma de los valores utilizando programas como Origen o MatLab, y encajar los histogramas para una distribución gaussiana para obtener el pico y la anchura de la distribución.
- Calibrar el voladizo siguiendo las instrucciones según el protocolo del fabricante. La calibración permite la conversión de la señal eléctrica de los fotodiodos a la fuerza (Figura 1B).
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Representative Results
Bicapas soportadas lípidos compuestos por DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se obtuvieron imágenes de AFM (Figura 2 AC). Debido a la composición lipídica, se observaron SM / Chol-rica o L y DOPC-ricos fases L d. El perfil de la altura de la imagen AFM puede proporcionar información importante sobre la estructura de la membrana. Al observar el perfil de altura, el espesor de la bicapa se puede medir en presencia de defectos en la membrana (Figura 2B), o la diferencia de altura entre los D / L fases L o puede ser proporcionada. Además, AFM permite específicamente regiones selectas que representan estas fases y analizar sus propiedades mecánicas utilizando espectroscopia de fuerza (Figura 2 D - F). Las curvas de fuerza derivadas del modo de espectroscopia de fuerza se utilizan para medir la fuerza de avance al encontrar el valor de la fuerza en el pico de la curva de fuerza (Figura 2D y E), y la membrespesor ane restando el valor de la distancia desde el pico de la curva de la fuerza para el valor de distancia cuando la curva de fuerza comienza a subir de nuevo (Figura 2D y F).
La sensibilidad de las mediciones de AFM depende de material piezoeléctrico y bucles de retroalimentación electrónicos. Por lo tanto, antes de hacer experimentos, es importante familiarizarse con el AFM configurar. Hay dos instrumento común establecido para los materiales piezoeléctricos: (1) escáner tubo en el que se coloca la muestra en la parte superior del material piezoeléctrico y la muestra se exploró en una punta inmóvil; o (2) la flexión-etapa en la que la punta se monta en el material piezoeléctrico en lugar de la muestra. En este último caso, el material piezoeléctrico y otros aparatos electrónicos están protegidos de derrames. Una gran cantidad de modelos de AFM para aplicaciones biológicas tienen esta configuración.
Durante estas pruebas, la punta del AFM puede perder el contacto con la muestra y llevar a mí erróneaasurements. Dependiendo del número de exploraciones se pierden, la imagen se puede corregir mediante la eliminación de las líneas de exploración y el uso de un filtro de intensidad media para obtener los nuevos valores de la zona circundante (Figura 3). Sin embargo en la mayoría de los casos, esto no produce una buena imagen y se recomienda simplemente desechar la imagen. Hay otros artefactos que necesitan ser monitoreados. Estos surgen de dañados puntas romas / / sucios, así como la difracción del punto láser detrás del voladizo 31. En estos casos, las imágenes deben ser descartados y la punta del AFM deben ser reemplazados.
Durante las mediciones de espectroscopia de fuerza, pueden surgir varios problemas: (1) la ausencia de picos (Figura 4), (2) la presencia de los hombros en lugar de picos bien definidos (Figura 4B), (3) una pequeña subida y posterior estancamiento a muy bajo fuerzas (Figura 4C - D). La ausencia de un pico se puede atribuir a la medición en una región sin un bilcondiciones ayer o a la adquisición no está optimizado. Se recomienda que una imagen AFM se adquiere antes de hacer espectroscopia de fuerza para asegurarse de que se está midiendo en efecto la bicapa. Condiciones de adquisición así como las especificaciones / punta en voladizo afectan a la probabilidad de un evento de avance 17. Un consejo más agudo puede perforar fácilmente un bicapa, como tal, la fuerza de avance puede parecer baja o no aparecer en absoluto, ya que está por debajo de los niveles de ruido. . El aumento de la velocidad de aproximación también aumenta la fuerza de avance 16. Como la bicapa es presionado por la punta, las moléculas de lípidos también reaccionan para disipar esta fuerza. A una velocidad de enfoque inferior, la bicapa lipídica tiene tiempo suficiente para equilibrar antes de que el siguiente paso en la fuerza, y esto aumenta la probabilidad de que un evento de avance puede suceder. A una velocidad de enfoque superior, las rampas de fuerza más rápido que la reacción de los lípidos y, como tal, la probabilidad de un evento de avance es inferior a la misma fuerza. Es possble que mediante el uso de alta velocidad de aproximación, el punto de consigna se alcanza antes de los descansos de dos capas que resulta en ningún pico observables. No hay informes para explicar la aparición de los hombros de la curva pero postulan que podría ser debido a la compresión material antes de avance. Por otra parte, una meseta o picos de ancho en fuerzas muy bajas pueden indicar la presencia de suciedad o material lipídico sueltos en la punta. Consejos pueden acumular suciedad y el material lipídico en el lapso de varias mediciones. La suciedad y el material unido a la punta hace que sea romo, aumentando así la fuerza de avance.
Se recomienda que las curvas de fuerza se adquieren en diferentes áreas si surgen estos desafíos. Una segunda recomendación es cambiar las puntas (esto requerirá una recalibración). Por último, puede ser necesario ajustar o el uso de una punta con diferentes especificaciones (radio de la punta y rigidez) se puede considerar la velocidad de aproximación. La fuerza de avance varía entre 0-50 nN 6, como tal, tél constante de resorte del voladizo puede estar en el intervalo de 0,05-0,7 N / m. La mayoría de los voladizos comerciales tienen un radio de punta nominal alrededor de 20 a 40 nm. En lugar de utilizar puntas convencionales, voladizos sin punta también se podían comprar y esferas de radio conocido (que suelen ser monodispersas en distribución de tamaño) se podría unir a ellos. Para obtener datos reproducibles, utilice siempre las mismas condiciones de adquisición y especificaciones en voladizo para el mismo conjunto de experimentos.
Figura 1: Principios de la espectroscopia de fuerza (A) Secuencia de enfoque de la retracción de la voladizo de la muestra.. La línea roja muestra la deflexión en voladizo desde su posición de equilibrio (línea de color negro). (B) de calibración voladizo convierte la señal eléctrica (en voltios) a la fuerza (en Newtons). Por adquisición de la sensi voladizotividad y constante la desviación vertical (en voltios) de primavera se convierte en la distancia y la distancia en vigor mediante la ley de Hooke. (C) Al entrar en contacto en las mediciones de espectroscopia de fuerza, z-piezo movimiento de exploración no tiene en cuenta la flexión en voladizo. Una corrección para esto se puede hacer restando la deflexión vertical, x (en unidades de distancia) del movimiento z-piezo, z (también en unidades de distancia). De esta manera, la separación punta-real de la muestra, en lugar de simplemente movimiento z-piezo, se puede informar, que es una medida más precisa de las distancias y es importante con el fin de medir el espesor de la muestra.
Figura 2:. AFM de SLBS (A) Esquema de SLBS compuesto por DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se separan en líquido desordenado (L d) y el líquido ordenado (L o) fases. (B (C) corresponde al cuadrado amarillo en B (10 m x 10 m). L o L y d fases están etiquetados. El perfil de la línea de abajo corresponde a la línea amarilla en la imagen. La fase L o aparece 1-2 nm más alta que la fase L d. (D) Una curva de fuerza ejemplo que muestra cómo se derivan la fuerza de avance y el espesor de la membrana. (E) la fuerza de penetración y (F) de la membrana para la distribución del espesor L D y L o fases con ajuste de Gauss para la cuantificación.
Figura 3: La pérdida de contacto durante la exploración conduce a. SM:: Chol escanear líneas que no se corresponden con el resto de la imagen una bicapa compuesta de DOPC soportado (2: 2: 1) con pérdida de contacto en algunas exploraciones de línea. Barra de escala 2 micras.
Figura 4:. Desafíos en la Fuerza Espectroscopia (A) Algunas curvas de fuerza no tendrá picos. (B) La curva puede tener hombros en lugar de picos bien definidos. (C) Después de un pequeño aumento de una meseta puede ocurrir en ausencia del pico. (D) Aspecto de una meseta junto con un pico bien definido.
| Región de la membrana | Breakthrough Fuerza (NN) | Membrana Espesor (nm) |
| Fase L d | 6 ± 1 | 4.7 y# 177; 0.5 |
| Fase L o | 8 ± 1 | 6 ± 1 |
Tabla 1: propiedades de la membrana de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). SLBS La fase L d tiene una fuerza de avance de 6 ± 1 nN y un grosor de 4,7 ± 0,5 nm. La L o tiene 8 ± 1 nN y un espesor de 6 ± 1 nm. La diferencia de altura entre las dos fases es 2 ± 1,4 nm.
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Discussion
SLBS compuestas de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se formaron en mica después de la adsorción de vesículas y la ruptura inducida por cloruro de calcio. Esta composición lipídica separa en L d y L o fases. La fase L o se enriquece en la esfingomielina y colesterol, y es menos fluido / más viscoso (Figura 1A) que la fase L 11 d. La separación de L o de la fase L d manifiesta como estructuras circulares elevadas por encima de los alrededores (Figura 1B, C). Las plataformas son las fases o L rodeados de las fases L d. Defectos de membrana (o agujeros en la membrana) también se observan (Figura 1B, la flecha azul) y un perfil de altura a través de este defecto muestra el espesor de la bicapa. La L d / L o diferencia de altura también puede ser examinado por mirar un perfil de altura AFM (Figura 1C).
La preparación de lípidosmezcla es muy importante ya que la composición determina las propiedades de bicapa. Durante la preparación de la bicapa de apoyo, es importante trabajar a las temperaturas indicadas para la formación adecuada de las fases de lípidos (etapa 1.4.5). Durante formación de imágenes, manteniendo una baja fuerza es muy importante a fin de no destruir la bicapa ni a acumular suciedad en la punta.
Después de imágenes AFM, se seleccionan las regiones del SLB y probaron utilizando espectroscopia de fuerza. Espectroscopia de fuerza nos permite sondear otras propiedades de la membrana, específicamente la fuerza avance (Figura 1D). La L d y L o fases muestran diferentes vigor avance y espesor (Figura 1E, F). Las propiedades se resumen en la Tabla 1. Observamos que en comparación con Chiantia et al. 11, se obtuvieron valores similares para la fuerza de avance en la fase d L pero un valor más bajo para la fase L o. Esto podría serdebido a la menor cantidad de colesterol utilizado en nuestras membranas (utilizamos DOPC: SM: relación Chol 2: 2: 1, mientras que ellos utilizan de 1,5: 1,5: 1). Esto también demuestra la importancia de la mezcla de la proporción de lípido de derecha - un factor crítico en la reproducibilidad de los resultados. Además, el uso de diferentes lípidos (longitud de cadena y grado de insaturación) también cambia las propiedades de bicapa 6,15,18.
Mientras que el trazado de la distribución de las fuerzas revolucionarias es útil y ya puede mostrar diferencias en las propiedades de bicapa, un análisis más detallado de la distribución de la fuerza avance se puede utilizar para deducir otras propiedades mecánicas incluyendo la tensión de línea y la difusión de presión 11,17,21. En pocas palabras, la probabilidad, P (F) de medición de una cierta fuerza de avance, F, es descrita por el modelo de nucleación continuum 11,15,17:
donde A es el Resonafrecuencia NCE del voladizo, K es la constante de muelle del voladizo, v es la velocidad del enfoque, Γ es la tensión de la línea (la energía necesaria para mantener el borde de un agujero en la membrana abierta), R es el radio de la AFM punta, k B es la constante de Boltzmann, T es la temperatura, y S es la presión de propagación o la energía asociada para cerrar el orificio (opuesto de tensión de la membrana - la energía necesaria para ser ejercida por la membrana para abrir un agujero 32). Esta ecuación se puede integrar y dP / dF se puede calcular como:
A, K, R son propiedades del voladizo / punta del AFM que se puede adquirir a través de la calibración en voladizo. T y v son parámetros experimentales que deben mantenerse constantes a lo largo de los experimentos. dP / dF es entonces instalado en el histograma para adquirir la tensión de la línea y la presión de difusión. Como varios parámetros afectan P (F), expeSe aconseja a los mentalistas de usar consejos similares y condiciones de adquisición para tener valores comparables para la tensión de línea y la presión se propague. La contaminación de la punta del AFM (incluyendo la suciedad y las vesículas no fusionadas en la punta adquirida durante la exploración) conduce a resultados no reproducibles. Además, la elección del soporte afecta a las propiedades mecánicas de la membrana 20.
Otra técnica que se pueden caracterizar las propiedades mecánicas de bicapa lipídica es la aspiración de micropipeta de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) 33. En esta técnica, la tensión de la membrana se calcula a partir de la deformación de GUVs durante la aspiración. Además, mediante el aumento de la aspiración, se puede calcular la tensión a la que se rompe el GUV (o tensión de lisis) 34, que podrían estar relacionados con la tensión de línea en el modelo de nucleación continuo. Un inconveniente de estas técnicas es la complejidad del cálculo de tensión de la membrana para eliminar la separación de las membranas, como la diferente phases tienen diferentes propiedades mecánicas 35. Esto está en contraste con AFM espectroscopia de fuerza, donde las fases individuales se pueden caracterizar por separado. Por otra parte, mientras que se necesitan muchos GUVs para producir resultados estadísticamente relevantes, el AFM puede producir una distribución por SLB. Sin embargo, la membrana remodelación efectos (por ejemplo, tubulación y invaginaciones) son más fácilmente visualizados con GUVs, lo que los mejores sistemas para la caracterización de estos efectos relacionados con la forma -junto con propiedades mecánicas.
En otras aplicaciones para estudiar los efectos de las proteínas de membrana en las propiedades de bicapa, las proteínas purificadas se pueden incorporar en estas vesículas para hacer proteoliposomas. Una técnica para hacer esto utiliza detergentes para ayudar a las proteínas para estabilizar y se insertan en la membrana. La posterior purificación por cromatografía de diálisis o de exclusión por tamaño elimina proteínas libres y detergente en solución 36. Otro enfoque requiere el etiquetado delas proteínas purificadas (por ejemplo, histidina o estreptavidina etiquetas) y la incorporación de socios de afinidad para esta etiqueta en los liposomas (con ácido y níquel nitriloacético (Ni-NTA) o lípidos biotina).
En resumen, se describe un método para analizar las bicapas lipídicas. Debido a su alta resolución, AFM puede revelar estructuras sub-micrométricos en la membrana, que incluyen las fases de lípidos, entre otros. Espectroscopia de fuerza, aquí utilizado para la caracterización de las membranas lipídicas, también se puede utilizar en las proteínas de membrana y otras biomoléculas en la membrana.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck, el Centro Alemán de Investigación Oncológica, la Universidad de Tubinga, y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (subvención. No 0312040).
Damos las gracias a Eduard Hermann por ayudarnos a automatizar el análisis de los datos de la curva de la fuerza y el Dr. Jakob Suckale para una lectura cuidadosa de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850375P | Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling. |
| Sphingomyelin (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 860062P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling. |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling. |
| Sodium chloride (NaCl), 99.8% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9265.1 | |
| Potassium chloride (KCl), 88% | Sigma | P9541 | |
| Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% | AppliChem GmbH | A1046 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3904.1 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade | AppliChem GmbH | A4689 | |
| HEPES, molecular biology grade | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness | Duran Group | 2355036 | |
| Punch and Die Set | Precision Brand Products, Inc | 40105 | |
| Optical Adhesive | Norland Products, Inc. | NOA 88 | Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mica blocks | NSC Mica Exports Ltd. | These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set. Always handle mica with gloves or tweezers. | |
| Laboratory Equipment Grease | Borer Chemie AG | Glisseal N | |
| Liposome Extruder | Avestin | LiposoFast-Basic | As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc. |
| Adhesive Tape | 3M | Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch) | |
| Bath Sonicator | Bandelin Sonorex Digitec | DT-31 | No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet) |
| Silicon Nitride AFM Cantilever | Bruker AFM Probes | DNP-10 | Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m. |
| AFM | JPK | JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200 |
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