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Bioengineering

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Published: July 22, 2015 doi: 10.3791/52867
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Interfaculty Institute for Biochemistry, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems, 3German Cancer Research Center

Introduction

Microscopia de força atómica (AFM) gera uma imagem de uma superfície de varrimento através de uma área da amostra, utilizando um braço de suporte com uma ponta muito afiada 1. O movimento do braço de suporte investiga a topologia de superfície da amostra. AFM tem sido amplamente aplicado para moléculas biológicas - incluindo proteínas, DNA e membranas, devido à sua versatilidade na análise de amostras fixadas no ar ou estado quase nativo em líquido 2-5.

Para além da sua capacidade de imagiologia de alta resolução em escala nanométrica, o cantilever AFM actua como uma mola para sondar forças de interacção (adesão e repulsão) e as propriedades mecânicas da amostra 5,6. Isto é conhecido como espectroscopia de força. Neste modo, a sonda se aproxima primeiro da amostra e exerce uma força sobre ele, em seguida, é retraído até que perde o contacto com a amostra (Figura 1A). As curvas geradas mostram força em função da distância do braço de suporte, tanto para a aplicaçãobarata e retração. Várias propriedades, incluindo o módulo de elasticidade para medir a rigidez de um material, e as forças de adesão pode ser derivada.

Bicamadas lipídicas suportados são membranas biológicas modelo que encontram-se no topo de um suporte sólido - geralmente mica, vidro de borosilicato, de sílica fundida, ou oxidado silício 7. Elas são preparadas utilizando várias técnicas, como a deposição de vesículas, método Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. Imagiologia AFM foi utilizado para seguir a formação destas camadas duplas suportados 10, e sondar diferentes estruturas formadas por membranas de diferentes composições 11-15.

Execução de espectroscopia vigor em apoiadas resultados bicamadas em um pico na curva de abordagem. Este pico indica a força necessária para perfurar a camada dupla, e é chamada força de avanço. A espessura da bicamada pode também ser medido usando a curva de força 6. A força típica avanço de bilayersintervalo entre 1-50 nN 6. Estas propriedades dependem embalagem lípido (fase líquida ou gel) e da estrutura (comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação) e alterado pelos agentes activos de membrana 16. A teoria por trás da ruptura foi explicada 17 e outros parâmetros experimentais, tais como maciez cantilever, raio de ponta e velocidade de aproximação também afetam a força de avanço 15,16,18. Espectroscopia de força foi usado para analisar as propriedades de diferentes fases lipídicas 11,19, dependente da composição alterações 12,20, bem como os efeitos de outras biomoléculas, tais como péptidos, sobre a estabilidade da membrana 21.

A orientação plana de bicamadas suportados é vantajoso para a combinação de AFM com outros métodos tais como ressonância 22 e microscopia de fluorescência de plasma de superfície 11,19 para caracterizar melhor a estrutura e as propriedades das membranas.

Este proto vídeo detalhadacol destina-se a preparar bicamadas lipídicas suportados usando deposição de vesículas e analisá-los com a AFM e espectroscopia de força. Enquanto vesículas de diferentes tamanhos podem ser utilizados para preparar bicamadas, este protocolo concentra-se em pequenos e grandes vesículas unilamelares. Bilayers suportados que separam em fase líquida ordenou (L o) e (L d) fases líquidas desordenados foram caracterizados 11,15. A membrana é composta de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM), e colesterol (Chol) a 2: 2: 1. Esta composição modelos as jangadas lipídicas, que são propostas para se comportar como plataformas importantes para o tráfico de proteína e de triagem, sinalização celular e outros processos celulares 23,24.

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Protocol

1. Preparação de Bicamadas Lipídicas suportados (SLB) 11,12,21

  1. Preparação de mistura de lípidos e de Vesículas multilamelares Suspensões
    1. Preparar os seguintes tampões de antemão.
      1. Preparar tampão PBS a concentrações de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH 2 PO 4, 8 mM de Na 2 HPO 4, e 137 mM de NaCl, pH 7,2.
      2. Prepare SLB (suportado bicamada lipídica) em concentrações de tampão de 150 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, pH 7,4.
      3. Prepara-se uma solução de 1 M de CaCl2.
    2. Dissolve-se os seguintes lípidos em clorofórmio a uma concentração desejada: por exemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / mL e colesterol (Chol) a 10 mg / ml.
    3. Aqui 18,38 ul de DOPC, 17,10 mL de SM e 11,30 mL de Chol para fazer uma solução com 1 mg de lipidos totais na proporção de 2: 2: 1 de DOPC: razão molar Chol: SM. Variar os volumes em conformidade com base no concentrations dos lipídios preparadas em 1.1.2. No entanto, manter a proporção molar de 2: 2: 1 de DOPC: SM: Chol, como alterar a relação molar irá alterar as características de fase da membrana 25.
    4. Misture a solução completamente por agitação em vórtex. Adicionar um corante fluorescente lipídica a 0,05% molar, se alguém deseja visualizar a bicamada por um microscópio de fluorescência.
      Nota: A família de dialkylcarbocyanines de cadeia longa, como o fez, DII e DiO abrangem uma ampla gama de comprimentos de onda e pode ser preferencialmente utilizadas para etiquetar membranas lipídicas. Alternativamente, lípidos marcados com fluorescência, assim como a rodamina-fosfatidiletanolamina ou BODIPY-colesterol pode ser utilizado. Em qualquer caso, a concentração do corante deve ser optimizado de acordo com a configuração de microscopia, mantendo em mente que as altas concentrações do fluoróforo ligado ao lípido pode alterar o comportamento de lípido 19.
    5. Seque o clorofórmio utilizando gás N2 (ou qualquer gás inerte disponíveis, tais como Ar e He).
    6. Além disso seco tele lípido mistura sob vácuo durante pelo menos 1 h.
      Nota: Se armazenar esta mistura de lípidos, purgar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. Alíquota excesso de lípidos-em-clorofórmio em pequenos frascos castanhos. Secá-las de uma maneira semelhante como a mistura de lípidos, deslocar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C.
    7. Dissolve-se os lípidos secos em tampão PBS até uma concentração de 10 mg / ml.
    8. Vortex-se a mistura vigorosamente durante cerca de 20 segundos a 1 min para obter uma suspensão turva, contendo vesículas multilamelares. Certifique-se de que não há a filmes lipídicos adira às paredes do frasco.
    9. Distribuir esta suspensão em alíquotas de 10 ul (1 mg de lípido torna alíquotas de 10).
    10. Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
  2. Preparação de Vesículas Unilamelares
    Nota: Os vários tamanhos de vesículas unilamelares podem ser preparadas utilizando o método de sonicação ou o método de extrusão. Sonication usa sound energia para agitar a mistura e separar as camadas da suspensão multilamelar. Isto é indicado por limpar da suspensão turva. Extrusão obriga as vesículas multilamelares de passar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro definido.
    1. Método de sonicação
      1. Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB.
      2. Transferir a mistura em pequenos (2 ml) frascos de vidro tapados e selar com Parafilm.
      3. Sonicar a mistura à temperatura ambiente num banho de ultra-sons durante 10 min ou até se tornar clara, para se obter pequenas vesículas unilamelares (SUVs, abaixo de 50 nm de diâmetro).
    2. Método de extrusão
      1. Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB.
      2. Transferir a suspensão para um tubo criogénico.
      3. Congelar a suspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico por alguns segundos em azoto líquido.
      4. Descongele osuspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico num banho de água à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante alguns minutos. Repetir os passos de congelamento e descongelamento, pelo menos, 10 vezes.
      5. A fim de extrusão da suspensão de lípido, utilizar uma membrana de policarbonato com 200 nm de tamanho de poro (outros tamanhos dos poros estão disponíveis como, 100 nm ou 400 nm) e um dispositivo de extrusão comercial 26.
        Nota: Actualmente, existem dois dispositivos de extrusão comercialmente disponíveis: um extrusor manual está disponível para pequenos volumes (200 uL para alguns mL). Neste caso, a amostra é submetida a extrusão através da membrana, empurrando manualmente a suspensão e para trás entre duas seringas. Dependendo do fabricante, alíquotas de lípidos teriam de ser combinadas para atingir o volume mínimo do conjunto acima. Para volumes maiores (até 50 ml) dispositivos mais sofisticados são utilizados em que a suspensão é forçada através da membrana de policarbonato utilizando gás comprimido. Condições de set-up e extrusão pode mudar de acordo com o model. Consulte as instruções do fabricante antes de usar. Este protocolo refere-se ao extrusor manual para pequenos volumes.
      6. Equilibrar a extrusora em água por passagem da água através da extrusora. Imergir a membrana na água.
      7. Colocar a membrana entre os dois pistões, montar o dispositivo e equilibrar em tampão, fazendo passar o tampão através da extrusora, a partir de uma seringa para a outra. Este passo permite adicionalmente ensaios de leakiness do sistema. Se ele vazamentos, desmontar e remontar-lo novamente alterando a membrana.
      8. Tome a suspensão lipídica usando uma seringa da extrusora ("lado sujo ').
      9. Introduzir a seringa que contém a suspensão de lípido em uma câmara e a seringa vazia na câmara oposta.
      10. Empurre a seringa em uma extremidade. Filtrar a solução através da membrana e para dentro da seringa oposta. Este é o passo 1 r.
      11. Passá-lo através da membrana para um total de 31 vezes taisque a solução acaba na seringa adversária ('lado limpo').
        Nota: Verifique a membrana após a extrusão. Se ele foi quebrado, então o processo de extrusão não foi bem sucedida e necessita de ser repetida.
      12. Esvaziar a seringa num pequeno tubo. As grandes vesículas unilamelares (LUV) são estáveis ​​durante 1-2 dias se mantida a 4 ° C.
  3. Preparação de Mica e Lamelas
    1. Lavar lamelas primeiro em água e depois em etanol. Ar seco.
    2. Tome discos de mica e descolar a camada exterior usando fita adesiva.
    3. Coloque o disco de mica sobre a lamela. Colas ópticas transparentes são ideais para que se possa verificar as camadas duplas com um microscópio de fluorescência.
    4. Anexar cilindros de plástico (2,5 cm de diâmetro externo, diâmetro interno 2 cm, e 0,5 cm de altura), utilizando óptica cola / graxa. Certifique-se de que tudo está selado e que não há fugas. Use graxa quando querendo voltar a utilizar os cilindros como eles podem ser facilmente retirado do the lamela e lavados. As dimensões dos cilindros de plástico depender do tamanho do suporte do braço de suporte de AFM e devem ser ajustados em conformidade.
  4. Deposição de Unilamelares vesículas em suporte sólido
    1. Pipetar toda a solução de lipossomas directamente sobre a mica. Adicionar mais tampão SLB para chegar a um volume de 300 ml.
    2. Adicionar 0,9 ml de solução 1 M de cloreto de cálcio para alcançar uma concentração final de 3 mM de Ca 2+.
    3. Incubar a 37 ° C durante 2 minutos e depois a 65 ° C durante pelo menos 10 min. Sempre cobrir as bicamadas com tampão. O contato com as bolhas de ar e ar irá destruí-lo. Durante a incubação, adicionar mais tampão, se necessário, especialmente se a incubação a temperaturas mais elevadas.
      Nota: As temperaturas de incubação variam de acordo com as misturas de lípidos e as fases necessárias. É necessário um período de incubação de pelo menos 10 minutos para formar bicamadas suportados, mas pode ser mais longo, dependendo da temperatura e composição.
    4. Lavagema bicamada com quente (65 ° C) Tampão de SLB 15-20 vezes para remover o cálcio e vesículas não fundidas. Tome cuidado extra durante as etapas de lavagem para manter a bicamada sob tampão e pipeta suavemente a solução de lavagem para evitar a destruição da camada dupla.
    5. Bilayers legal suportados à temperatura ambiente antes medições AFM. Isto é necessário para formar as diferentes fases da membrana, bem como minimizar o desvio térmico no instrumento.

2. Microscopia de Força Atômica Medidas 11,12

  1. Imagem
    Nota: Execute projeção de imagem atômica no modo de contato ou o modo de tocar. Imagem suportado bilayers em solução; Não deixe que a solução para evaporar completamente, pois isso irá destruir as camadas duplas. Como era de se estar trabalhando com tampão, observe as precauções de segurança para garantir que qualquer parte AFM está protegido contra derramamento de líquidos.
    1. Selecione um cantilever macio (abaixo de 0,2 N / m constante da mola é aconselhável) e montá-lo para tele AFM. A escolha da rigidez cantilever é mais crítico para a espectroscopia de força (e isso será discutido mais tarde).
    2. Monte a amostra no palco AFM e certifique-se que todos os módulos vibração de isolamento estão ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para equilibrar e reduzir a dispersão térmica do sistema. Dependendo da AFM set-up, especificações de ajuste e de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante.
    3. Aproxime-se da amostra com a ponta do AFM até que o contato.
    4. Desde bicamadas lipídicas são geralmente 4 nm de altura, utilize o Z-gama do instrumento que lhe dará a mais alta resolução z (por exemplo, 1,5 mm).
    5. Selecione uma região para a imagem. Para obter uma visão geral da bicamada lipídica, uma 50 mm x 50 mm ou 25 mm x 25 mm região será um bom ponto de partida para a imagem. Se aparecer pequenos recursos, imagem uma lata em áreas menores (10 mm x 10 mm, ou 2 mm x 2 mm). A escolha de uma área de imagem depende também da r trabalhandoange do scanner piezoeléctrico. Por favor, consultar o manual do instrumento para isso.
    6. Como camadas duplas são muito frágeis, ajustar o ponto da ponta do AFM conjunto durante a imagem para manter a força no mínimo e corrigir deriva térmica, mantendo contato com a amostra. No modo de contato, minimizar o set point. No modo de tocar, maximizar o set point.
    7. Processar imagens por encaixando cada linha de digitalização para funções polinomiais de nivelamento. Executa a remoção linha para verificações que perdem contato com a membrana usando o software proprietário da empresa de fabricação de AFM.
  2. Força Spectroscopy
    1. Calibrar o cantilever seguindo as instruções de acordo com o protocolo do fabricante. A calibragem permite a conversão do sinal eléctrico dos fotodiodos de força (Figura 1B).
      1. Calibrar a sensibilidade da ponta para medir a deflexão de movimento piezo-z (em unidades de comprimento) em vez do sinal eléctrico em volts.
      2. Calcula-se a constante de mola cantilever usando o método de frequência de ruído térmico, geralmente incorporados no software AFM. Neste método, traçar a amplitude de vibração de ruído em relação à frequência de oscilação, a criação de uma trama densidade espectral de potência. Este gráfico irá mostrar um pico em torno da freqüência de ressonância. A freqüência em que o i amplitudeé a maior é a freqüência de ressonância. Ajustar uma função Lorentzian em torno do pico para calcular automaticamente a constante de mola pelo software. Alguns recursos úteis para a teoria do método de ruído térmico são dadas nas referências 27-30.
    2. Depois de imagiologia uma área da bicamada, seleccionar uma região x 5 mm 5 mm na bicamada para realizar espectroscopia de força.
    3. Configure o AFM para que ele leva curvas de força em uma grade de que a região de 16 x 16. Isso resulta em 256 curvas força por região. O espaço entre dois pontos vizinhos deve ser suficiente para evitar que a área de membrana sendo sondado por um ponto coincidiria com o próximo ponto. Isto é dependente do raio da ponta. Uma distância de 100 nm entre dois pontos seria ideal. Divide x 5 uM a região 5 um de 16 x 16 em grade. Dependendo do tamanho da fase, pode-se seleccionar uma região mais pequena ou maior, e, em seguida, ajustar o tamanho da grelha em conformidade.
    4. Definir deslocamento z piezo-a400 nm. Isso determina o alcance máximo do movimento do z-piezo. Ele deve ser suficientemente grande para garantir que o braço de suporte está totalmente retraída a partir da amostra entre as medições.
    5. Definir velocidade de aproximação de 800 nm / seg e retrair a velocidade para 200 nm / seg. Utilize uma velocidade de aproximação entre 400 a 6000 nm / seg dependendo da composição da bicamada lipídica e da fase a ser estudado 6,16.
    6. Depois de configurar todos os parâmetros, adquirir curvas força, pressionando o botão "run" do software AFM.
    7. Salvar curvas de força como força vs. curvas de altura (uma medida do movimento z-piezo). Isso não leva em conta a curvatura do cantilever quando em contacto com a amostra. Durante a etapa de processamento de dados, o software permite a correção da AFM para cantilever dobrar para obter força vs. curvas de separação ponta-amostra (Figura 1C), o que dará valores adequados para a espessura da camada dupla. Os valores de correcção são geralmente incorporados na calibradoção, que são guardadas com cada curva de força. Calcular separação ponta-amostra subtraindo a deflexão vertical do movimento piezo a um determinado ponto.
      Nota: O pico na curva da força de aproximação (o valor da força vai para baixo, mesmo se o movimento cantilever ainda está no ciclo de abordagem) é a força de ruptura da membrana, enquanto que a diferença entre a posição do pico e a posição do ponto em que a força começa a levantar-se de novo fornece a espessura da membrana.
    8. Adquirir, pelo menos, 500 curvas de força para cada condição para obter boas estatísticas. Traçar um histograma dos valores usando programas como origem ou MatLab, e se encaixam os histogramas para uma distribuição de Gauss para obter o pico e largura da distribuição.

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Representative Results

Bicamadas lipídicas constituídas suportados de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram fotografadas em AFM (Figura 2 CA). Devido à composição de lípido, foram observados SM / Chol-rico e L o DOPC-ricas fases G d. O perfil de altura a partir da imagem AFM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana. Ao olhar para o perfil de altura, a espessura da bicamada pode ser medido na presença de defeitos na membrana (Figura 2B), ou a diferença de altura entre os / l de D fases G S pode ser fornecida. Além disso, a AFM permite especificamente regiões selecionados que representam estas fases e analisar suas propriedades mecânicas usando espectroscopia de força (Figura 2 D - F). As curvas da força derivados a partir do modo de espectroscopia de força são utilizados para medir a força de avanço por encontrar o valor de força no pico da curva de força (Figura 2D e E), e o Membrane espessura, subtraindo o valor da distância a partir do pico da curva de força para o valor da distância em que a curva da força começa a aumentar de novo (Figura 2D e F).

A sensibilidade das medições AFM é dependente de material piezoelétrico e loops de feedback eletrônicos. Como tal, antes de fazer experimentos, é importante para se familiarizar com o AFM configurar. Existem dois instrumento comum criado para os materiais piezoeléctricos: (1) de scanner tubo no qual a amostra é colocada no topo do material piezoeléctrico e a amostra é analisada em uma ponta imóvel; ou (2) à flexão fase em que a ponta está montado sobre o material piezoeléctrico em vez da amostra. Neste último caso, o material piezoeléctrico e outros produtos electrónicos estão protegidos contra derrames. Um monte de modelos AFM para aplicações biológicas têm essa configuração.

Durante a gravação, a ponta do AFM pode perder o contato com a amostra e levar a me errôneasasurements. Dependendo do número de verificações são perdidos, a imagem pode ser corrigido através da remoção das linhas de leitura e utilizando um filtro de intensidade média para derivar os novos valores da área circundante (Figura 3). No entanto, na maioria dos casos, este não produz uma boa imagem e recomenda-se simplesmente descartar a imagem. Há outros artefactos que têm de ser monitorizadas. Estes surgem a partir danificadas blunt dicas / / sujos, bem como a difração do raio laser atrás do cantilever 31. Nestes casos, as imagens devem ser deitados fora, a ponta de AFM deve ser substituído.

Durante medidas de espectroscopia de força, vários desafios podem surgir: (1) ausência de picos (Figura 4A), (2) a presença de ombros em vez de picos bem definidos (Figura 4B), (3) uma pequena subida e plateauing subsequente a muito baixo forças (Figura 4C - D). A ausência de um pico pode ser atribuída a medição numa região sem um bilcondições ayer ou a aquisição não sendo otimizada. Recomenda-se que uma imagem AFM é adquirido antes de fazer espectroscopia de força para se certificar de que a bicamada está de facto a ser medido. Condições de aquisição, bem como especificações de ponta / cantilever afetam a probabilidade de um evento de avanço 17. Uma dica mais nítida pode facilmente perfurar uma bicamada, como tal, a força de avanço pode parecer baixo ou não aparecer em tudo, porque ele fica abaixo dos níveis de ruído. . O aumento da velocidade de aproximação também aumenta a força inovadora 16. À medida que a bicamada é pressionado pela ponta, as moléculas de lípidos também reagir para dissipar esta força. A uma velocidade de aproximação inferior, a bicamada lipídica tem tempo suficiente para equilibrar antes do passo seguinte em vigor, o que aumenta a probabilidade de que um evento de avanço pode acontecer. A uma velocidade de aproximação mais elevada, as rampas de força mais rapidamente do que a reacção dos lípidos e, como tal, a probabilidade de um evento de avanço é menor, ao mesmo vigor. É possvel que, usando alta velocidade de aproximação, o set point é atingido antes de as quebras de duas camadas, resultando em nenhum pico observáveis. Não existem relatos para explicar o aparecimento de ombros na curva, mas nós postulamos que isso pode ser devido a compressão de material antes de avanço. Além disso, um patamar ou picos largos com forças muito baixa pode indicar a presença de sujidade ou material lipídico solto na ponta. Dicas podem acumular sujeira e de material lipídico no período de várias medições. Sujidade e materiais ligados à ponta torna romba, aumentando, assim, a força de avanço.

Recomenda-se que as curvas de força são adquiridas em diferentes áreas, se surgirem esses desafios. A segunda recomendação é mudar dicas (este terá que ser recalibrada). Por fim, a velocidade de aproximação pode necessitar de ser ajustada ou a utilização de uma ponta com especificações diferentes (raio da ponta e rigidez) pode ser considerada. A força de avanço varia entre 0-50 nN 6, como tal, tele constante da mola do braço de suporte pode estar na gama de 0,05-0,7 N / m. A maioria dos balanços comerciais têm um raio nominal da ponta em torno de 20-40 nm. Em vez de usar dicas convencionais, consolas tipless também poderia ser comprado e esferas de raio conhecido (que são normalmente monodispersa na distribuição de tamanho) pode ser ligado a eles. Para obter dados reprodutíveis, use sempre as mesmas condições de aquisição e especificações cantilever para o mesmo conjunto de experiências.

Figura 1
Figura 1: Princípios da Força Espectroscopia (A) Sequência de abordagem-retracção do cantilever a partir da amostra.. A linha vermelha mostra a deflexão cantilever a partir de sua posição de equilíbrio (linha preta). (B) de calibração Cantilever converte sinal elétrico (em Volts) para forçar (em Newtons). Pela aquisição da sensi cantileverdade constante e a deflexão vertical (em volts) da mola é convertida em distância e a distância em vigor usando a lei de Hooke. (C) Em caso de contato em medidas de espectroscopia de força, z-piezo movimento de análise não leva em conta o raio de acção de flexão. Uma correcção para este pode ser feito subtraindo a deflexão vertical, x (em unidades de distância) do movimento Z-piezo, z (também em unidades de distância). Desta forma, a separação da ponta-amostragem real, em vez de simplesmente movimento z-piezo, podem ser comunicados, o que é uma medida mais precisa das distâncias e é importante, a fim de medir a espessura da amostra.

Figura 2
Figura 2:. AFM de SLBS (A) Esquema de SLBS composta de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) separar-se em líquido desordenada (L d) e ordenou líquido (L o) fases. (B (C) corresponde ao quadrado amarelo em B (de 10 um x 10 um). L S e L d fases são rotulados. O perfil de linha abaixo corresponde à linha amarela na imagem. A fase L o aparece 1-2 nm maior do que a fase L d. (D) A curva de força amostra mostrando como a força de avanço e espessura da membrana são derivados. (E) e força de ruptura (F) distribuição espessura da membrana para L d e L o fases com montagem de Gauss para a quantificação.

Figura 3
Figura 3: Perda de contato durante a imagem leva a. SM:: Chol digitalizar linhas que não correspondem com o resto da imagem bicamada composto de DOPC Um suportado (2: 2: 1) com perda de contacto em alguns varrimentos das linhas. A barra de escala de 2 um.

Figura 4
Figura 4:. Desafios da Força Spectroscopy (A) Algumas curvas de força não terá picos. (B) A curva pode ter ombros, em vez de picos bem definidos. (C) Depois de um pequeno aumento pode ocorrer um patamar na ausência do pico. (D) Aspecto de um patamar em conjunto com um pico bem definido.

Membrana região Breakthrough Force (nn) Membrana Espessura (nm)
L fase d 6 ± 1 4.7 &# 177; 0,5
Fase L o 8 ± 1 6 ± 1

Tabela 1: Propriedades de membrana de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1). A fase SLBS L d tem uma força de avanço de 6 ± 1 N e uma espessura de 4,7 ± 0,5 nm. O L o tem 8 ± 1 N e uma espessura de 6 ± 1 nm. A diferença de altura entre as duas fases é de 2 ± 1,4 nm.

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Discussion

SLBS compostos de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram formadas em mica após adsorção vesícula e ruptura induzida por cloreto de cálcio. Esta composição de lípido separado em L e L o d fases. A fase L o é enriquecida em esf ingomielina e colesterol e é menos fluido / mais viscoso (Figura 1A) do que a fase L d 11. A separação de fase a partir de L o G d manifesta como estruturas circulares elevados acima da circundante (Figura 1B, C). As plataformas são as fases de o G cercadas pelas fases L d. Defeitos da membrana (ou buracos na membrana) também são observados (Figura 1B, seta azul) e um perfil de altura entre este defeito mostra a espessura da bicamada. The L d / L o diferença de altura também podem ser examinados por olhar para um perfil de altura AFM (Figura 1C).

A preparação de lípidomistura é muito importante que a composição determina as propriedades bicamada. Durante a preparação da bicamada suportada, é importante trabalhar às temperaturas indicadas para a adequada formação de fases lipídicas (passo 1.4.5). Durante a gravação, mantendo uma baixa força é muito importante de modo a não destruir a bicamada nem a acumular-se sujidade na ponta.

Depois AFM imagem, regiões do SLB são selecionadas e sondado utilizando espectroscopia de força. Espectroscopia de força nos permite investigar outras propriedades da membrana, especificamente a força de avanço (Figura 1D). The L d e L o fases mostram diferente força inovadora e espessura (Figura 1E, F). As propriedades encontram-se resumidas na Tabela 1. Nota-se que em comparação com Chiantia et al. 11, foram obtidos valores semelhantes de força avanço na fase d G mas um valor inferior para a fase C o. Isto poderia serdevido a quantidades mais baixas de colesterol utilizada nas nossas membranas (usamos DOPC: SM: Chol proporção 2: 2: 1, enquanto que utilizado de 1,5: 1,5: 1). Isto também demonstra a importância de se misturar o lípido direita - um factor crítico na reprodutibilidade dos resultados. Além disso, utilizando diferentes lípidos (comprimento de cadeia e grau de insaturação) também altera as propriedades de bicamada 6,15,18.

Ao traçar a distribuição das forças revolucionárias é útil e já pode mostrar diferenças nas propriedades bicamada, uma análise mais aprofundada da distribuição da força de avanço pode ser usado para deduzir outras propriedades mecânicas, incluindo a tensão da linha e se espalhando pressão 11,17,21. Resumidamente, a probabilidade, P (F) de medir uma determinada força de avanço, F, é descrita pelo modelo de nucleação contínuo 11,15,17:

Equação 1

em que A é o Resonadno frequência do cantilever, K é a constante da mola cantilever, v é a velocidade da abordagem, Γ é a tensão da linha (a energia necessária para manter o bordo de um orifício na membrana aberta), R é o raio da AFM ponta, k B é a constante de Boltzmann, T é a temperatura, e S representa a pressão de espalhamento ou a energia associado para fechar o furo (em frente de tensão de membrana - a energia necessária a ser exercida pela membrana para abrir um buraco 32). Esta equação pode ser integrado e dP / DF pode ser calculado como:

Equação 2

A, K, R, são propriedades da AFM cantilever / dica que pode ser adquirido através de calibração de linha suspensa. T e v são parâmetros experimentais que deve ser mantida constante ao longo das experiências. dP / dF é então ajustada para o histograma para adquirir a tensão e a pressão de linha de propagação. Como vários parâmetros afetam P (F), experimentalists são aconselhados a usar dicas semelhantes e condições de aquisição para ter valores comparáveis ​​para a tensão e pressão de linha se espalhando. Contaminação da ponta do AFM (incluindo sujeira e vesículas não fundidos na ponta adquirida durante o exame) leva a resultados não reproduzíveis. Além disso, a escolha do suporte afecta as propriedades mecânicas da membrana 20.

Outra técnica que pode caracterizar as propriedades mecânicas da bicamada lipídica é a aspiração micropipeta de vesículas unilamelares gigantes (GUVs 33). Nesta técnica, a tensão da membrana é calculada a partir da deformação da GUVs durante a aspiração. Além disso, através do aumento da sucção, pode-se calcular a tensão a que as rupturas GUV (ou tensão de lise) 34, o que poderia estar relacionado com a tensão de linha no modelo contínuo nucleação. Um inconveniente deste técnicas é a complexidade do cálculo da tensão de membrana para membranas de separação de fases, tal como o PHA diferenteses têm diferentes propriedades mecânicas 35. Isto está em contraste com a espectroscopia de força AFM, em que as fases individuais pode ser caracterizada separadamente. Além disso, enquanto muitos GUVs são necessários para produzir resultados estatisticamente relevantes, a AFM pode produzir uma distribuição per SLB. No entanto, membrana remodelação efeitos (por exemplo, tubulation e invaginations) são mais facilmente visualizadas com GUVs, tornando-os melhores sistemas para caracterizar estes efeitos relacionados com a forma em conjunto com propriedades mecânicas.

Noutras aplicações para estudar os efeitos das proteínas de membrana na bicamada propriedades, as proteínas purificadas podem ser incorporados nestas vesículas para fazer proteolipossomas. Uma técnica para fazer isso utiliza detergentes para ajudar as proteínas para estabilizar e inserir na membrana. A purificação subsequente por meio de cromatografia de diálise ou de exclusão de tamanho remove as proteínas livres em solução detergente e 36. Outra abordagem requer a marcação deas proteínas purificadas (por exemplo, histidina ou Streptavidin etiquetas) e incorporando parceiros de afinidade para esta tag em lipossomas (com ácido níquel-nitriloacético (Ni-NTA) ou lipídios biotinilados).

Em resumo, foi descrito um método para analisar bicamadas lipídicas. Devido à sua alta resolução, a AFM pode revelar as estruturas de sub-micrométricas na membrana, o que inclui as fases lipídicas entre outros. Espectroscopia de força, aqui usado para a caracterização das membranas lipídicas, também pode ser usado em proteínas de membrana e outras biomoléculas sobre a membrana.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela Max Planck Society, o alemão Cancer Research Center, da Universidade de Tübingen, eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (conceder nenhum. 0.312.040).

Agradecemos Eduard Hermann por nos ajudar a automatizar a análise dos dados curva de força e Dr. Jakob Suckale para a leitura cuidadosa deste manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

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