Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Published: July 22, 2015 doi: 10.3791/52867
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Interfaculty Institute for Biochemistry, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems, 3German Cancer Research Center

Introduction

Atomik Kuvvet mikroskopisi (AFM), çok keskin ucu 1 ile konsol kullanılarak numunenin bir alanı boyunca tarama bir yüzeyin bir görüntü oluşturur. konsol hareketi numunesinin yüzey topolojisini araştırıyor. Sıvı 2-5 hava ya da doğala yakın halde sabit örnekleri analiz çok yönlülüğünü nedeniyle, protein, DNA, ve membran da dahil olmak üzere - AFM yaygın biyolojik moleküllerin uygulanmıştır.

Apart nanometre aralığında, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yeteneği gelen, AFM konsol etkileşim kuvvetlerini (yapışma ve itme) ve örnek 5,6 mekanik özelliklerini araştırmak üzere bir yay gibi davranır. Bu kuvvet spektroskopisi diye bilinmektedir. Bu modda, prob birinci numune (Şekil 1A) ile temasını kaybeder kadar daha sonra geri çekilir, örnek yaklaşır ve bunun üzerine bir kuvvet uygular. oluşturulan eğriler uygulama hem de konsol mesafenin bir fonksiyonu olarak kuvvet gösterirhamamböceği ve geri çekilme. Elastikiyet modülüne dahil olmak üzere birçok özellikler, bir malzemenin sertliğini ölçmek için, ve yapışma güçleri elde edilebilir.

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır bir katı destek üstünde yatan biyolojik model membranlar - genellikle mika, borosilikat cam, erimiş silis veya silikon 7 oksitlenmiş. Bunlar vesikül birikimi gibi çeşitli teknikler kullanılarak hazırlanmaktadır, Langmuir-Blodgett yöntemi ve 8,9 spin kaplama. AFM görüntüleme bu desteklenen ikili tabakalar 10 oluşumunu takip ve farklı bileşimler 11-15 membranları tarafından oluşturulan farklı yapıları incelemek için kullanılmıştır.

Yaklaşım eğrisi de bir zirve desteklenen bilayers sonuçlarına kuvvet spektroskopisi gerçekleştirme. Bu zirve bilayeri delmek için gerekli kuvveti gösterir ve atılım kuvvet denir. iki tabakalı kalınlığı da kuvvet eğrisi 6 kullanılarak ölçülebilir. bilayers tipik atılım gücü1-50 arasındaki aralık NN 6. Bu özellikler, lipit ambalaj (sıvı veya jel fazı) ve yapının (asil zincir uzunlukları ve doymamışlık derecesi) ve zar-aktif maddeler 16 tarafından değiştirilmiş bağlıdır. rüptür arkasındaki teori 17 açıklanmıştır ve bu konsol yumuşaklık, uç yarıçapı ve yaklaşım hızı gibi diğer deneysel parametreler de atılım gücü 15,16,18 etkiler. Kuvvet spektroskopisi zar 21 stabilitesi, farklı lipit fazları 11,19, peptidler gibi bir bileşim bağımlı değişiklikler 12,20, hem de diğer biyomoleküllerin etkileri özelliklerini analiz etmek için kullanılmıştır.

Desteklenen iki katmanlı yassı yönelimi daha iyi bir yapı ve membran özelliklerini karakterize etmek için bu yüzey plazmon rezonans 22 ve floresan mikroskobu 11,19 gibi diğer yöntemler ile AFM birleştirilmesi için avantajlıdır.

Bu ayrıntılı video protocol vezikül birikimi kullanarak desteklenen lipit katmanlarını hazırlamak ve AFM ve kuvvet spektroskopisi ile bunları analiz etmek amaçlanmaktadır. Çeşitli büyüklüklerde veziküller iki katmanlı yapılar hazırlamak için kullanılabilir olsa da, bu protokol, küçük ve büyük tek lamelli vesiküller odaklanmaktadır. Faz sıvı emretti (ğ) ve sıvı düzensiz (L d) aşamalarında ayırmak Desteklenen bilayers 11,15 karakterize edildi. 2: 1 oranında membran 2 di-oleoil-fosfatidilkolin (DOPC), sfingomiyelin (SM) ve kolesterol (kol) oluşmaktadır. Bu kompozisyon modelleri, protein kaçakçılığı ve sıralama, hücre sinyalizasyon ve diğer hücresel süreçleri 23,24 önemli platformlar olarak davranmaya önerilmiştir lipid sallar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Desteklenen Lipid Bilayers 1. Hazırlama (SLB) 11,12,21

  1. Lipid Karışım ve çok katmanlı veziküllü Cezalı Hazırlanması
    1. Önceden aşağıdaki tamponlar hazırlayın.
      1. 2.7 mM KCI, konsantrasyonlarda, PBS tampon hazırlanması 1.5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 ve 137 mM NaCl, pH 7.2.
      2. 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.4 konsantrasyonlarda SLB (desteklenen lipid iki katmanlı) tamponunu hazırlayın.
      3. 1 M CaCI2 ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
    2. İstenen bir konsantrasyonda kloroform içinde, aşağıdaki lipitleri çözülür: örneğin, di-oleoil-fosfatidilkolin, 10 mg / ml'de 25 mg / ml ve kolesterol (Chol) 25 mg / ml, sfingomiyelin (SM) 'den (DOPC).
    3. 2: 1: DOPC: SM: Kol mol oranında, bir 2 toplam lipidlerin 1 mg bir çözeltinin yapılması için DOPC 18.38 ul, SM 17.10 ul ve Chol 11.30 ul alır. Conce göre buna uygun hacimleri Vary1.1.2 hazırlanan lipitlerin ntrations. 2: 1: DOPC: SM: kol, zar 25 faz özelliklerini değiştirecek mol oranı değiştirilerek Ancak, 2 molar oranını korumak.
    4. Vorteks tamamen çözüm karıştırın. Biri floresan mikroskop ile bilayeri görselleştirmek isterse 0.05 mol% bir floresan lipidik boya ekleyin.
      Not: Uzun zincirli dialkylcarbocyanines ailesini, yaptığımız gibi, DII ve Dio dalga boylarında geniş bir yelpazede hizmet ve ideal lipid membranlar etiketlemek için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, rodamin-fosfatidiletanolamin ya da BODIPY-kolesterol gibi flüoresan etiketli lipidler kullanılabilir. Her durumda, boyanın konsantrasyonu lipid bağlı fluorofor yüksek konsantrasyonlarda lipid davranışı 19 değiştirebilirsiniz akılda tutarak, mikroskopi ayarına göre optimize edilmelidir.
    5. N 2 gazı kullanılarak kloroform (veya herhangi bir kullanılabilir inert gaz gibi Ar gibi He) kapalı kurulayın.
    6. Bundan başka, kuru tEn azından 1 saat için vakum altında bir karışım, kolesterol.
      Not: bu lipit karışımı depolamak için, soy gaz ile (N2, Ar veya He) hava üfleme ve -20 ° C'de saklayın. Küçük kahverengi şişelere fazla lipidler-in-kloroform kısım. -20 ° C'de soy gaz ile (N2, Ar veya He) ve mağaza hava yerini, lipit karışımı gibi benzer bir şekilde, kurutun.
    7. 10 mg / ml'lik bir konsantrasyona PBS tamponu içinde kurutuldu lipidleri çözülür.
    8. 1 dakika vorteksleyin, yaklaşık 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde kanşım çok katmanlı veziküller içeren, bulanık bir süspansiyon elde etmek için. Flakon kenarlarına yapışmasını hiçbir lipit film olmadığından emin olun.
    9. 10 ul alikotları (lipid 1 mg 10 bölüntülerin yapar) içine bu süspansiyon dağıtın.
    10. Sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edin.
  2. Tek lamelli vesiküller hazırlanması
    Not: tek lamelli vesiküller çeşitli boyutlarda sonikasyon yöntemi ya da kalıptan çekme yöntemi ile hazırlanabilir. Sonikasyon s kullanıround enerji karışımı ajitasyon ve çok katmanlı süspansiyon katmanları ayırmak için. Bu puslu süspansiyon kadar takas ile gösterilir. Ekstrüzyon kesin bir gözenek büyüklüğüne sahip bir membran filtreden geçmesine çok katmanlı veziküller zorlar.
    1. Sonikasyon Yöntemi
      1. Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin.
      2. Küçük (2 mi) kapaklı cam şişelere karışımı aktarın ve Parafilm ile sızdırmaz.
      3. 10 dakika süre ile ya da (çapı 50 nm altında, SUV), küçük tek tabakalı veziküller elde etmek için açık hale gelinceye kadar bir banyo sonikatörü içinde, oda sıcaklığında, karışım sonikasyon.
    2. Ekstrüzyon Yöntemi
      1. Çok katmanlı lipit süspansiyonlar 10 ul alın ve SLB tampon 150 ul ekleyin.
      2. Kriyojenik bir tüp içine süspansiyon aktarın.
      3. Sıvı azot içinde bir kaç saniye için kriyojenik tüp daldırılması lipid süspansiyonu dondurun.
      4. Çözülmebir kaç dakika için bir su banyosu oda sıcaklığında veya 37 ° C kriyojenik tüp daldırarak Lipid süspansiyonu. Donma-çözülme adımları en az 10 kere tekrarlanır.
      5. Lipid süspansiyonu ekstrüde etmek amacıyla, 200 nm gözenek boyutuna sahip olan bir polikarbonat membran kullanımı ticari bir ekstrüzyon tertibatı 26 (diğer gözenek boyutları 100 nm ya da 400 nm gibi mevcuttur).
        Not: Şu anda, iki ekstruder cihazları piyasada mevcut vardır: manuel ekstrüzyon küçük hacimleri (bir kaç ml 200 ul) için mevcuttur. Bu durumda, Örnek elle iki şırınga arasında ileri ve geri süspansiyon iterek zardan basınç altında geçirilir. Üreticisine bağlı olarak, lipid tümbölenler set up asgari hacme ulaşmak için kombine edilmesi gerekir. Daha büyük hacimler için (en fazla 50 mi) daha karmaşık cihazlar kullanıldığı süspansiyon sıkıştırılmış gaz kullanarak polikarbonat zardan itilir. Set-up ve ekstrüzyon koşulları mod göre değişebilirEl. Kullanmadan önce üreticinin talimatlarına bakın. Bu protokol, küçük miktarlar için manuel ekstruder anlamına gelir.
      6. Ekstruder üzerinden su geçirilerek su içinde ekstrüderi dengelenmesi. Suda membran daldırın.
      7. Iki piston arasında zarın cihazı monte ve bir şırınga diğerine, ekstrüzyon yoluyla tampon geçirilerek, tampon maddesi içinde dengeye. Bu adım ayrıca sistemin leakiness test sağlar. Bu sızıntı varsa, sökmeye ve tekrar zar değişiyor yenilemek.
      8. Ekstruder bir şırıngayı ('kirli yüzü') ile lipid süspansiyon atın.
      9. Tek odasının lipit süspansiyon ve karşıt odasının boş şırınga içeren şırınga takın.
      10. Bir ucunda şırınga itin. Zarından ve rakip şırınga içine çözüm geçirin. Bu 1. pass.
      11. 31 kat gibi bir toplam zar geçirinÇözelti rakip şırınga ('temiz tarafı') üzerine biter.
        Not: ekstrüzyon sonra membran kontrol ediniz. Kırık, sonra ekstrüzyon işlemi başarılı değildi ve tekrar edilmesi gerekir.
      12. Küçük bir tüp içine şırınga boşaltın. 4 ° C 'de muhafaza edilmesi durumunda Büyük tek tabakalı veziküller (LUVler) 1-2 gün boyunca stabildir.
  3. Mika ve lameller hazırlanması
    1. Yıkama etanol önce su ve daha sonra lamelleri. Kuru hava.
    2. Mika diskleri alın ve yapışkan bant kullanılarak dış katman soyulabilir.
    3. Lamel üzerine mika diski takın. Biri floresan mikroskop ile bilayers kontrol edebilirsiniz böylece Şeffaf optik yapıştırıcılar optimum bulunmaktadır.
    4. Optik tutkal / gres kullanarak plastik silindirler (2.5 cm dış çapı 2 cm iç çapı ve 0,5 cm yükseklik) takın. Her şey sızdırmaz olduğundan ve sızıntı olmadığından emin olun. Kolayca inci ayrılabilir olarak silindirlerin yeniden kullanmak isteyen yaparken gres kullanınE lamel ve yıkanmıştır. Plastik silindir boyutları AFM konsol tutucu büyüklüğüne bağlıdır ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır.
  4. Katı Destek tek katmanlı veziküller birikmesi
    1. Pipetleyin mika doğrudan bütün lipozom çözüm. 300 ul bir hacim ulaşmak için daha fazla SLB tamponu ekleyin.
    2. 3 mM Ca2 + nihai konsantrasyona ulaşmak için, 1 M kalsiyum klorür çözeltisinin 0.9 ul ekleyin.
    3. 2 dakika ve daha sonra en az 10 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta, 37 ° C'de inkübe edilir. Her tampon ile iki katmanlı kapsamaktadır. Hava ve hava kabarcıkları ile irtibat onu yok edecek. Gerekirse İnkübasyon sırasında, yüksek sıcaklıklarda kuluçka, özellikle daha fazla tampon eklemek.
      Not: İnkübasyon ısılarının, ihtiyaç duyulan lipid karışımları ve fazlar göre değişir. En az 10 dakika kuluçkalama süresi desteklenen iki katmanlı yapılar oluşturmak için gerekli olan, ancak sıcaklık ve bileşimine bağlı olarak, daha uzun olabilir.
    4. YıkamaSıcak (65 ° C) ile iki tabakalı SLB tamponu 15-20 kat kalsiyum ve kaynaşmamış kesecikler kaldırmak için. Tamponu altında bilayeri tutmak için yıkama adımları sırasında ekstra özen ve yavaşça bilayeri yok önlemek için yıkama solüsyonu pipetlemeyin.
    5. AFM ölçümlerinden önce oda sıcaklığında soğutun desteklenen bilayers. Bu membran, farklı fazlar oluşturabildiğini gibi alet termal kaymasını en aza indirmek için gereklidir.

2. Atomik Kuvvet Mikroskobu Ölçümleri 11,12

  1. Görüntüleme
    Not: İletişim modu veya mod dokunarak atomik kuvvet mikroskopisi görüntüleme gerçekleştirin. Çözelti içinde Resim desteklenen bilayers; Bu bilayers yok gibi çözüm tamamen buharlaşması için izin vermez. Tek tampon ile çalışıyor olacak gibi, herhangi AFM kısmı sıvı dökülmelerine karşı korumalı olduğunu emin güvenlik önlemlerini dikkate alınız.
    1. Yumuşak bir konsol seçin (0.2 N / m yay sabiti tavsiye edilir altında) ve t monteO AFM. Konsol sertlik seçimi kuvvet spektroskopisi için daha önemlidir (ve bu daha sonra ele alınacaktır).
    2. AFM sahnede örnek takın ve tüm titreşim izolasyonu modülleri açık olduğundan emin olun. Dengeye ve sistemin termal sürüklenme azaltmak için en az 15 dakika boyunca bekleyin. AFM set-up bağlı olarak, ayarlama ve görüntüleme özellikleri değişebilir. Üreticinin kullanma kılavuzuna bakınız.
    3. Temas edene kadar AFM ucu ile örnek yaklaşın.
    4. Lipid bilayers genellikle yüksekliği 4 nm olduğundan, (örneğin 1.5 mikron için) en yüksek z-çözünürlüğü verecek cihazın Z-dizi kullanın.
    5. Görüntünün bir bölge seçin. Çift katlı lipid genel bir bakış, x 25 mikron bölge imajı için iyi bir başlangıç ​​noktası olacaktır 50 mm x 50 mm veya 25 mikron almak için. Daha küçük özellikler belirirse, küçük alanlarda bir kutu görüntüsü (10 mm x 10 mm veya 2 mm x 2 mm). görüntüleme alanının seçimi de çalışma r bağlıdırPiezoelektrik tarayıcı ange. Bunun için alet kılavuzuna bakınız.
    6. Bilayers çok kırılgan olduğu için, numune ile temas korurken, termal sürüklenme için en az kuvvet ve doğru tutmak için görüntüleme sırasında AFM ucu ayar noktasını ayarlayın. Iletişim modunda, ayar noktasını en aza indirmek. Modunda dokunarak, set noktasını maksimize.
    7. Polinom tesviye işlevlerine her tarama satırı takarak Süreç görüntüler. AFM üretim şirketi özel yazılım kullanılarak membran ile temas kaybetmek taramalar için hat kaldırma gerçekleştirin.
  2. Kuvvet Spektroskopisi
    1. Üreticinin protokolüne göre yönergeleri izleyerek konsol ayarlayın. Kalibrasyon fotodiyotlar kuvvete (Şekil 1B) elektrik sinyalinin dönüşüm sağlar.
      1. Volt uç duyarlılığını (uzunluk birimi olarak) z-piezo hareketi olarak sapma ölçmek yerine, elektrik sinyalini kalibre edin.
      2. Genellikle AFM yazılımı dahil termal gürültü frekans yöntemi kullanılarak konsol bahar sabitini hesaplayınız. Bu yöntemde, güç spektrumu yoğunluk arsa oluşturma, salınım frekansına göre gürültü titreşimin genliğini çizilir. Bu arsa rezonans frekansı etrafında bir tepe gösterecektir. Frekans nerede genlik iEn büyük s rezonans frekansı olduğunu. Yazılım tarafından otomatik olarak yay sabitini hesaplamak için tepe etrafında Lorentz işlevi takın. Isıl gürültü yönteminin teorisi için bazı yararlı kaynaklar referanslar 27-30 verilmiştir.
    2. Çift katlı bir alanı görüntüleme sonra kuvvet spektroskopisi gerçekleştirmek için iki katmanlı bir 5 mm x 5 mm bölgeyi seçin.
    3. O bölgenin 16 x 16 grid kuvvet eğrileri alır, böylece AFM ayarlayın. Bu bölgenin başına 256 kuvvet eğrileri ile sonuçlanır. iki komşu nokta arasındaki boşluk membran alanı sonraki noktaya denk olur bir noktada tarafından tanınacak olan önlemek için yeterli olmalıdır. Bu uç yarıçapına bağlıdır. İki nokta arasında bir 100 mil mesafesi ideal olacaktır. 16 x 16 ızgara içine 5 mm x 5 mm bölgesini bölün. Faz büyüklüğüne bağlı olarak, bir küçük veya daha büyük bölgeyi seçmek ve daha sonra buna göre ızgara boyutunu ayarlayabilirsiniz.
    4. Ayarlayın z-piezo deplasman400 nm. Bu z-piezo maksimum hareket aralığını belirler. Bu konsol tamamen ölçümler arasında numune uzak geri emin olmak için yeterince büyük olmalıdır.
    5. 800 nm / sn yaklaşım hızını ayarlamak ve 200 nm / sn hıza geri çekin. Iki tabakalı yapısı ve lipit fazı 6.16 incelenecek bağlı 6.000 nm / sn 400 arasında bir yaklaşım hızı kullanın.
    6. Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, AFM yazılımı "run" düğmesine basarak, kuvvet eğrileri kazanır.
    7. Yükseklik eğrileri vs kuvvet olarak kuvvet eğrileri (z-piezo hareketinin bir ölçüsü) kaydedin. Bu husus örnek ile temas dikkate konsol bükülmesini almaz. Veri işleme adımı sırasında, AFM yazılım iki tabakalı kalınlığı için uygun değerler verecek uç-numune ayırma eğrileri (Şekil 1C), vs kuvveti elde etmek için eğilme konsol için düzeltme sağlar. Düzeltme değerleri, genellikle calibr içinde bu buluşa katılmıştırHer kuvvet eğrisi ile kaydedilir tirme. Belirli bir noktada piezo hareketinden, dikey saptırma çıkarılarak uç-numune ayırma hesaplayın.
      Not: yaklaşım kuvvet eğrisinde tepe (kuvvet değeri aşağı konsol hareketi yaklaşım döngüsü hala olsa bile gider) membran atılım gücüdür iken bu zirve pozisyon ve nokta konum arasındaki fark kuvvet yükselmeye başladığı tekrar zarın kalınlığı sağlar.
    8. Iyi istatistikler elde etmek için her durum için en az 500 kuvvet eğrileri edinin. Menşe veya MatLab gibi programları kullanarak değerleri bir histogram çiziniz ve dağıtım zirve ve genişliğini almak için Gauss dağılımına histogramlar uygun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DOPC oluşan Desteklenen lipid bilayers: SM: Chol (2: 2: 1) AFM içinde görüntülendi (Şekil 2 AC). Çünkü lipit kompozisyonu, SM / Chol-zengini L o ve DOPC zengin L d fazlar gözlenmiştir. AFM görüntüleme yükseklik profili zar yapısı hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Yükseklik profili bakarak, iki tabakalı kalınlığı temin edilebilir membranın (Şekil 2B), veya L o / L D fazlar arasındaki yükseklik farkından kusurların varlığında ölçülebilir. Buna ek olarak, AFM özellikle seçin, bu aşamaları temsil eden bölgeler ve kuvvet spektroskopisi (- F Şekil 2 D) kullanılarak mekanik özelliklerini analiz etmeyi sağlar. kuvvet spektroskopisi modundan türetilen kuvvet eğrileri kuvvet eğrisi (Şekil 2B ve E) zirvesinde kuvvet değerini bularak atılım gücü ölçmek için kullanılır ve Membr vardırmesafe değerine kuvvet eğrisinin tepe mesafe değeri çıkarılarak ane kalınlığı kuvvet eğrisi tekrar (Şekil 2D ve F) yükselmeye başladığında.

AFM ölçümleri duyarlılığı piezoelektrik malzeme ve elektronik geri bildirim döngüleri bağlıdır. Bu nedenle, yapıyor deneyler öncesinde, kurmak AFM tanımak önemlidir. Piezoelektrik malzeme için ayarlanmış iki yaygın gösterge vardır: (1) Tüp tarayıcı hareketsiz bir uç örnek piezoelektrik malzeme üstüne yerleştirilir ve numune taranan edildiği; ya da (2) ucu örnek yerine piezoelektrik malzeme üzerine monte edilir bükülmede aşamalı. İkinci durumda, piezoelektrik malzeme ve diğer elektronik dökülmeleri korunmaktadır. Biyolojik uygulamalar için AFM modellerinin bir sürü bu konfigürasyona sahip.

Görüntüleme sırasında, AFM ucu numune ile temas kaybetmek beni yanlış yol açabilirasurements. Kaybolur kaç taramalar bağlı olarak, görüntü tarama hatları kaldırarak ve çevresi (Şekil 3) yeni değerler elde etmek için ortalama yoğunluk filtresi kullanılarak düzeltilebilir. Ancak çoğu durumda, bu iyi bir görüntü elde değil ve sadece görüntüyü atmak için tavsiye edilir. Izlenmesi gereken diğer eserler vardır. Bu künt / hasarlı / kirli ipuçları yanı sıra konsol 31 arkasında lazer spot kırınımı kaynaklanmaktadır. Bu gibi durumlarda, görüntü atılmalı ve AFM ucu değiştirilmelidir.

Kuvvet spektroskopi ölçümleri sırasında, çeşitli zorluklar ortaya çıkabilir: piklerin (1) yokluğunda (Şekil 4A), omuz bölgesinin (2) bulunması yerine, iyi tanımlanmış zirveler (Şekil 4B), çok düşük olarak, (3), küçük bir artış ve daha sonra platolaşmasının kuvvetler (Şekil 4C - D). bir tepe yokluğu bil olmayan bir bölgede ölçüm atfedilebilirAyer veya satın alma koşulları optimize edilen değil. Bu bir AFM görüntü iki tabakalı gerçekten ölçülen ediliyor emin olmak için kuvvet spektroskopi yapmadan önce kazanılır tavsiye edilir. Toplama koşullarının yanı sıra ucu / konsol özellikleri bir atılım olay 17 olasılığını etkiler. Bir keskin ucu kolaylıkla gibi, atılım gücü düşük görünmesi veya gürültü seviyelerinin altında olduğu için hiç görünmeyebilir, bir bilayeri delebilir. . Yaklaşım hızı artırmak da atılım gücü 16 artar. Iki tabakalı ucu tarafından basıldığı gibi, lipit molekülleri de bu kuvveti dağılımı tepki. Daha düşük bir yaklaşım hızında çift katlı lipid yürürlükte sonraki adımdan önce dengelenmeye için yeterli zaman vardır ve bu bir atılım olay olabilir olasılığını arttırır. Daha yüksek bir yaklaşım hızında, örneğin, lipidler reaksiyonu daha hızlı ve kuvvet rampalar, bir atılım olayın olasılığını aynı kuvvette daha düşüktür. Bu poss olduğunuYüksek yaklaşım hızı kullanılarak, ayar noktası gözlemlenebilir zirveleri sonuçlanan iki tabakalı ara vermeden önce ulaşıldığından emin ible. Orada eğri üzerinde omuz görünümünü açıklamak için hiçbir rapor vardır ama biz atılım önce maddi sıkıştırma nedeniyle olabileceğini varsaymaktadır. Bundan başka, çok düşük güçler bir plato veya geniş tepe ucu kir veya gevşek lipid malzemenin varlığına işaret edebilir. İpuçları çeşitli ölçümler span kir ve lipidik malzemeyi birikebilir. Ucuna takılı Kir ve malzeme böylece atılım gücünün artırılması, bu kör yapar.

Bu zorluklar çıkarsa kuvvet eğrileri farklı alanlarda edinilen tavsiye edilir. İkinci öneri (bu tekrar kalibre edilmesini gerektirir) ipuçları değiştirmektir. Son olarak, yaklaşma hızı ayarlanabilir veya farklı özelliklerde (uç yarıçapı ve sertlik) bir ucu kullanımı kabul edilebilir gerekebilir. atılım gücü gibi, t gibi, 0-50 nN 6 arasında değişmektedirO 0,05-0,7 N / m aralığında olabilir konsol sabit yay. Çoğu ticari konsollar 20-40 nm çapında bir anma ucu yarıçapı var. Bunun yerine, geleneksel ipuçlarını kullanarak, uçsuz konsollar de satın alınabilir (genellikle boyut dağılımı bakımından tek dağılımlı) bilinen yarıçapın küreler onlara bağlı olabilir. Tekrarlanabilir veri almak için, her zaman deneyler aynı seti için aynı satın alma koşulları ve konsol özelliklere kullanın.

Figür 1
Şekil 1: Kuvvet Spektroskopisi İlkeleri numuneden konsolun yaklaşımı-geri çekilme (A) Sıra.. kırmızı çizgi denge konumuna (siyah çizgi) dan konsol sapmasını gösterir. (B) Konsol kalibrasyonu (Newton cinsinden) zorlamak için (Volt) elektrik sinyali dönüştürür. Konsol sensi edinimi tarafındanbilirlik ve yay sabiti (volt) dikey saptırma mesafesi ve Hooke kanunu kullanılarak yürürlüğe mesafe dönüştürülür. Kuvvet spektroskopisi ölçümlerinde temas ettiğinde (C), z-piezo tarama hareketi eğilme dikkate konsol almaz. Bunun için bir düzeltici z-piezo hareketinden (uzunluk birimleri olarak) dikey dönmeyi, X çıkarılarak yapılabilir, z (aynı zamanda uzunluk birimleri olarak). Bu şekilde, bunun yerine basit bir z-piezo hareketinin asıl ucu örneği ayırma, mesafelerin daha doğru bir ölçüsüdür ve numunenin kalınlığını ölçmek için önemli olan, kaydedilmemiştir.

Şekil 2,
SM: Şekil 2:. DOPC oluşan SLBs bölgesinin SLBs AFM (A) Şema Kol (2: 2: 1) düzensiz sıvı (L d) ve sıvı sipariş (ğ) fazlar ayrılır. (B (C), b san bir kare (10 mm x 10 mm) karşılık gelir. L o ve L d fazları etiketli. hat profili aşağıdaki resimde sarı çizgiye tekabül eder. L o faz L d fazı daha 1-2 nm yüksek görünmektedir. (D) atılım gücü ve membran kalınlığı nasıl elde edildiğini gösteren bir örnek kuvvet eğrisi. (E) Cephe kuvveti ve miktar tayini için Gauss montaj L D ve L değeri O aşamaları için araçlardan (F) membran kalınlığı dağılımı.

Şekil 3,
Şekil 3: görüntüleme sırasında temas kaybı neden olur. SM: Chol resmin geri kalanından karşılık gelmez satırları taramak A DOPC oluşan bilayeri desteklenen (2: 2: 1) Bazı çizgi taramaları temas kaybı ile. Ölçek çubuğu 2 mikron.

Şekil 4,
Şekil 4:. Kuvvet Spektroskopi Zorluklar (A) Bazı kuvvet eğrileri hiçbir zirveleri olacaktır. (B) eğrisi yerine iyi tanımlanmış zirvelerinden omuz olabilir. Plato tepe yokluğunda oluşabilecek küçük bir artış sonra (C). Iyi tanımlanmış bir zirve ile birlikte bir yayla (D) Görünüm.

Membran bölgesi Cephe Gücü (nN) Membran kalınlığı (nm)
L d fazı 6 ± 1 4.7-177.; 0.5
Ğ aşaması 8 ± 1 6 ± 1

Tablo 1: DOPC membran özellikleri: SM: Kol (2: 2: 1). SLBs L D aşaması 6 ± 1 nN bir atılım kuvvet ve 4.7 ± 0.5 nm'lik bir kalınlığa sahiptir. Ğ 8 ± 1 nN 6 ± 1 nm arasında bir kalınlığa sahiptir. İki faz arasındaki yükseklik farkı 2 ± 1.4 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DOPC oluşan SLBs: SM: Kol (2: 2: 1), kalsiyum klorür ile indüklenen vezikül adsorpsiyon ve yırtılması sonrasında mika oluşmuştur. Bu lipit kompozisyonu L D ve L değeri O fazlar ayrıldı. Ğ fazı sfingomyelin ve kolesterol açısından zengin ve L, D aşaması 11'den daha az sıvı / daha viskoz (Şekil 1A) olarak bulunmuştur. L d aşamasından L o ayrılması çevreleyen (Şekil 1B, C) ​​yukarıda yükseltilmiş dairesel yapılar ortaya çıkar. platformlar L d aşamalarında çevrili L o aşamaları vardır. Membran defektleri (veya zarında delik) da (Şekil 1B, mavi ok) görülmektedir ve bu kusur genelinde bir yükseklik profili çift katlı kalınlığını gösterir. L d / L o yükseklik farkı da AFM yüksekliği profili (Şekil 1C) bakarak muayene edilebilir.

lipid hazırlanmasıKarışım bileşimi iki tabakalı özelliklerini belirlediği çok önemlidir. Desteklenen çift-katlı hazırlanması sırasında, lipid fazları (aşama 1.4.5) doğru oluşumu için belirtilen sıcaklıklarda çalışmak için önemlidir. Iki tabakalı yok etmek için de uç kir birikmesine şekilde değil görüntüleme sırasında, düşük kuvvet tutulması çok önemlidir.

AFM görüntüleme sonra, SLB bölgeleri seçilmiş ve kuvvet spektroskopisi kullanılarak sondalandı. Kuvvet spektroskopisi bize membranın diğer özelliklerin, özellikle atılım kuvveti (Şekil 1D) prob sağlar. Fazlar o L d ve L (Şekil 1E, F) farklı atılım gücü ve kalınlığını göstermektedir. özellikleri Tablo 1 'de özetlenmiştir. Biz Chiantia ve ark., 11 ile karşılaştırıldığında, L D aşamasında atılım kuvvet için benzer değerler elde edilmiştir dikkat L, O aşaması için daha düşük bir değer. Bu olabilirnedeniyle membranlarımızda kullanılan kolesterol daha düşük miktarda (1.5'lik kullanılan süre, 1::: SM: kol oranı 2: 2 Biz DOPC kullanılan 1.5: 1). Sonuçların tekrarlanabilirlik kritik bir faktör - Bu aynı zamanda doğru lipit karıştırma oranı önemini ortaya koymaktadır. Bundan başka, değişik lipidler (zincir uzunluğu ve doymamışlık derecesi) ile aynı zamanda iki tabakalı özellikleri 6,15,18 değiştirir.

Atılım kuvvetlerin dağılımı çizimi yararlıdır zaten iki tabakalı özellikleri farklılık gösterebilir birlikte, atılım kuvvet dağılımı daha fazla analiz hattı gerilimi de dahil olmak üzere ve basınç 11,17,21 yayılan diğer mekanik özelliklerini anlamak için kullanılabilir. Kısaca, olasılık, p belirli bir atılım kuvvet ölçüm (F), K, sürekli nükleasyon modelinin 11,15,17 ile tarif edilir:

Denklem 1

burada A Resona olduğukonsolun nce frekansı, K konsolun yay sabiti, v yaklaşımının hızı, Γ hat gerilimi (zarında açık bir delik tutmak için gerekli kenar enerjisi), R AFM yarıçapı olduğunu ucu, k, B-T sıcaklığı, Boltzmann sabiti, S yayılan basınç veya deliği kapatmak için ilişkili enerji (membran gerilim karşısında - bir delik 32 açmak için bir membran ile tatbik edilmesi için gerekli enerji). Bu denklem, entegre edilebilir ve dP / dF gibi hesaplanabilir:

Denklem 2

A, K, R konsol kalibrasyon yoluyla elde edilebilir AFM konsol / ucu özellikleridir. T ve v, deneyler boyunca sabit tutulmalıdır deney parametrelerdir. dP / dF sonra hat gerilimi ve yayma basıncını elde etmek için histogram takılmıştır. Gibi çeşitli parametreler P (F), bu deneyimlerden etkilermentalists hat gerilim ve yayma basınç karşılaştırılabilir değerlere sahip benzer ipuçları ve toplama koşullarını kullanılması tavsiye edilir. (Görüntüleme sırasında edinilen ucunda kir ve kaynaşmamış kesecikler dahil) AFM ucu kirlenmesi olmayan tekrarlanabilir sonuçlara yol açar. Bundan başka, destek seçimi zar 20 mekanik özelliklerini etkiler.

Çift katlı lipid mekanik özelliklerini karakterize bir başka teknik, dev tek katmanlı veziküller (GUVs) 33 mikropipet aspirasyon olduğunu. Bu teknikte, membran gerilimi aspirasyon sırasında GUVs deformasyonu hesaplanır. Ayrıca, emme arttırarak, bir germe hesaplayabilir hangi sürekli nükleasyon modelinde hattı gerilimi ile ilgili olabilir GUV kırılmalar (veya lizis gerilim) 34. Bu tekniklerden biri dezavantajı farklı PHA olarak, zarları ayıran faz membran gerilimi hesaplama karmaşıklığıses, farklı mekanik özelliklere 35 var. Bu tek tek fazlar, ayrı olarak karakterize edilebilir AFM kuvvet spektroskopisi, aksine bulunmaktadır. Birçok GUVs istatistiksel sonuç üretmek için gerekli oysa Dahası, AFM SLB başına bir dağıtım üretebilir. Bununla birlikte, (örneğin, tubulation ve invajinasyonları için) membran biçimlenme etkileri daha kolay GUVs ile görüntülendi mekanik özellikleri ile birlikte, bu şekil ilgili etkilere karakterize etmek için onları daha iyi sistemler yapıyoruz.

Iki tabakalı özellikleri üzerindeki membran proteinlerinin etkilerini incelemek için başka uygulamalarda, proteinler arıtıldı proteoliposomes yapmak için bu veziküller içinde dahil edilebilir. Bunu yapmak için bir teknik stabilize ve membran eklemek için proteinleri yardımcı deterjanlar kullanır. Diyaliz ya da boyut-dışlama kromatografisi ile daha sonraki saflaştırma çözeltisi 36 serbest proteinler ve deterjan kaldırır. Başka bir yaklaşım etiketleme gerektirirve (nikel-nitriloasetik asit (Ni-NTA) ya da biyotinilatlı lipidler) ile lipozomlarda Bu etiket için birleştiren afinite ortakları (örneğin, Histidinden veya Streptavidin etiketleri için) saflaştırılmış protein.

Özetle, biz lipit katmanlarını analiz etmek için bir yöntem tarif. Sayesinde yüksek çözünürlüklü, AFM diğerleri arasında lipit fazları içerir zarındaki alt mikrometre yapıları ortaya çıkarabilir. Burada lipid membranlar karakterize etmek için kullanılan gücün spektroskopisi, aynı zamanda zar proteinleri ve zar üzerinde diğer biyomoleküllerin kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu eser (no. 0312040 hibe) Max Planck Kurumu, Alman Kanser Araştırma Merkezi, Tübingen Üniversitesi ve Bundesministerium für Bildung und Forschung tarafından desteklenmiştir.

Biz bize bu yazının dikkatli okumak için kuvvet eğrisi verileri ve Dr. Jakob Suckale analizi otomatik yardım için Eduard Hermann teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850375P Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine) Avanti Polar Lipids, Inc. 860062P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol Avanti Polar Lipids, Inc. 700000P Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8% Carl Roth GmbH + Co. KG 9265.1
Potassium chloride (KCl), 88% Sigma P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99% AppliChem GmbH A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99% Carl Roth GmbH + Co. KG 3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade AppliChem GmbH A4689
HEPES, molecular biology grade AppliChem GmbH A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness Duran Group 2355036
Punch and Die Set Precision Brand Products, Inc 40105
Optical Adhesive Norland Products, Inc. NOA 88 Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light. 
Name Company Catalog Number Comments
Mica blocks NSC Mica Exports Ltd. These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease Borer Chemie AG Glisseal N
Liposome Extruder Avestin LiposoFast-Basic As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape 3M Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator Bandelin Sonorex Digitec DT-31 No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever  Bruker AFM Probes DNP-10 Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM JPK JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
  2. Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology. Science. 242, 209-216 (1988).
  3. Gaczynska, M., Osmulski, P. A. AFM of biological complexes: What can we learn. Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).
  4. Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. AFM for structure and dynamics of biomembranes. BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).
  5. Muller, D. J. AFM: A Nanotool in Membrane Biology. Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).
  6. Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
  7. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).
  8. Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. Atomic Force Microscopy of Biological Membranes. Biophys. J. 96, 329-338 (2009).
  9. Mennicke, U., Salditt, T. Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating. Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).
  10. Raviakine, I., Brisson, A. R. Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy. Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).
  11. Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).
  12. Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics. Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).
  13. Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane. BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).
  14. Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. Supported planar bilayers from hexagonal phases. BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).
  15. Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes. J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).
  16. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation. Biophys. J. 103, 38-47 (2012).
  17. Butt, H. -J., Franz, V. Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory. Physical Review E. 66, 031601 (2002).
  18. Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy. Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).
  19. Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study. Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).
  20. Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes. Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).
  21. García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM. Biophys. J. 93, 103-112 (2007).
  22. Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques. Nanoscale. 1, 40-49 (2009).
  23. Simons, K., Vaz, W. L. C. Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1. Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).
  24. Pike, L. J. Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function. The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).
  25. Kahya, N. Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  26. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation and applications. Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).
  27. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).
  28. Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids. Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).
  29. Sader, J. E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).
  30. Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope. Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).
  31. Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging. Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).
  32. Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides. Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).
  33. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).
  34. Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes. BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).
  35. Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration. Phys. Rev. Lett. 98, (2007).
  36. Rigaud, J. -L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).

Tags

Biyomühendislik Sayı 101 desteklenen lipit bilayers atomik kuvvet mikroskopisi kuvvet spektroskopisi lipid sallar sıvı sipariş faz atılım gücü lipid membranlar
Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Unsay, J. D., Cosentino, K.,… More

Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers. J. Vis. Exp. (101), e52867, doi:10.3791/52867 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter